張雪霽

（天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072）

巰基化合物通過氧化還原反應(yīng)參與機(jī)體代謝，進(jìn)而影響機(jī)體的正常生理功能，其涉及范圍廣，種類多，然而目前鮮少有文章系統(tǒng)地總結(jié)含巰基物質(zhì)的定量測定方法。5-5’二硫代雙（2-硝基苯甲酸）通常指總巰基檢測試劑，又稱作Ellman 試劑或簡稱為DTNB，現(xiàn)已成為實驗室常用的一種巰基定量檢測試劑?？値€基檢測試劑比色法首次被Ellman 提出，又被叫做Ellman 法，Ellman［1］于1959 年成功合成DTNB，并通過光電比色法定量地測定了生物材料（血液樣品）中的巰基，其簡便、有效和快速的優(yōu)勢使得Ellman 試劑被廣泛使用。在弱堿性條件下，反應(yīng)物中巰基（—SH）的數(shù)量，可根據(jù)硫醇類物質(zhì)的—SH 與DTNB 的二硫鍵快速交換釋放的2-硝基-5-硫代苯甲酸二價陰離子（NTB2-）來計算，此陰離子的最大吸收波長為412 nm，其摩爾消光系數(shù)為14 150×1 000 cm2／mol。此外，隨著分析技術(shù)的發(fā)展，Ellman 試劑還可以與高效液相色譜聯(lián)用以實現(xiàn)實時監(jiān)測，或者作為表面增強(qiáng)拉曼光譜的探針以達(dá)到增強(qiáng)信號的作用。筆者將對Ellman 法的反應(yīng)原理、反應(yīng)動力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行概述，并著重介紹其應(yīng)用，旨在為該方法能夠更加靈活廣泛地運(yùn)用到相關(guān)研究中提供解決思路和參考。

1 反應(yīng)原理

DTNB 與含有巰基的物質(zhì)（R—SH）在弱堿性條件下反應(yīng)，生成一分子NTB2-和一分子R—S—S—NTB。NTB2-顯亮黃色，可通過監(jiān)測412 nm波長下的吸光度根據(jù)朗伯-比耳定律進(jìn)行定量。NTB2-摩爾消光系數(shù)的確定經(jīng)歷了20 年，最開始的摩爾消光系數(shù)ε412(13 600×1 000 cm2／mol)是由Ellman［2］將NTB2-溶解在丙酮中測量得到的。此后，有科學(xué)家采用過量的半胱氨酸、巰基乙醇和還原型谷胱甘肽與DTNB 反應(yīng)［3-4］，并對ε412進(jìn)行了測量，得到ε412范圍為（9 500～13 100）×1 000 cm2／mol。直到1979 年，Riddles 等［5］從反應(yīng)溶液的pH、離子強(qiáng)度和溫度等當(dāng)方面重新評估了NTB2-的摩爾消光系數(shù)，得到延用至今的14 150×1 000 cm2／mol。

2 反應(yīng)動力學(xué)性質(zhì)

巰基-二硫鍵的交換是以硫負(fù)離子（RS-）作為進(jìn)攻基團(tuán)發(fā)生的二級親核取代（SN2）反應(yīng)。Vasas等［6］在研究硫化氫的二硫鍵還原電勢動力學(xué)和熱力學(xué)性質(zhì)時，以DTNB 作為二硫化物的模型，綜合性地探討了DTNB 與硫醇類化合物反應(yīng)時的動力學(xué)性質(zhì)。在Ellman 試劑反應(yīng)中，當(dāng)DTNB 的化學(xué)計量數(shù)是硫醇類化合物的100 倍時，一分子的DTNB釋放一分子的NTB2-，此反應(yīng)呈現(xiàn)依賴于硫醇類化合物的偽一級動力學(xué)過程。當(dāng)硫醇類化合物的化學(xué)計量數(shù)是DTNB 的100 倍時，一分子的DTNB 釋放兩分子的NTB2-，此時也符合偽一級動力學(xué)性質(zhì)，Vasas 認(rèn)為這可能是由于一組獨特的動力學(xué)參數(shù)所產(chǎn)生的簡單動力學(xué)行為。此外，該反應(yīng)顯示出強(qiáng)烈的pH 依賴性，其反應(yīng)的最佳pH 范圍是7～8。

影響DTNB 反應(yīng)活性的因素主要有兩個，包括硫醇類物質(zhì)的pKa 和空間位阻。與DTNB 反應(yīng)的最佳巰基類物質(zhì)的pKa 應(yīng)與此反應(yīng)的最適合的pH范圍相一致［7］。牛血清蛋白有一個相對暴露的巰基基團(tuán)，而β-乳球蛋白的巰基因自身構(gòu)象原因而高度掩蔽，這種空間結(jié)構(gòu)上的差異造成了反應(yīng)活性的不同。對于蛋白中的巰基而言，其反應(yīng)活性還受蛋白結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)。誘導(dǎo)效應(yīng)是由于臨近的帶電荷的氨基酸之間相互作用而產(chǎn)生的，因此多肽鏈長度增加，誘導(dǎo)效應(yīng)的強(qiáng)度就會降低［8］。鈣離子結(jié)合引起的肌鈣蛋白C 構(gòu)象的改變也會引起巰基基團(tuán)反應(yīng)活性的改變［9］。

3 Ellman 法的應(yīng)用

3.1 巰基活性測定

在許多應(yīng)用學(xué)科中，巰基的定量測定成為一項常規(guī)操作，而快速、簡便的方法便成為首選。隨著化學(xué)合成技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了DTNB 的替代品——4，4’-二硫代二吡啶(4-DPS)［10-11］。4-DPS 的優(yōu)勢是可以在相對低的pH 范圍內(nèi)（pH 3～7）進(jìn)行巰基定量，避免不必要的副反應(yīng)。但4-DPS 與巰基產(chǎn)生吡啶酮產(chǎn)物的最大吸收波長為324 nm，相比于NTB2-的最大吸收波長較短，這意味著DTNB更具穩(wěn)定性，更適合于近紫外區(qū)強(qiáng)吸收溶液中巰基的定量。此外，在中性環(huán)境中，4-DPS 的溶解度遠(yuǎn)低于DTNB，這一點在實際應(yīng)用中也要被考慮在內(nèi)。

多種分析技術(shù)如高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）和毛細(xì)管電泳（CE）已被報道用于復(fù)雜生物體中的低分子量硫醇的檢測［12］。高效液相色譜技術(shù)分辨率和靈敏度較高，已被應(yīng)用于多種領(lǐng)域，并已成為解決生化問題最有前途的方法之一。Ozyurek 等［13］建立了HPLC-Ellman法測定了L-半胱氨酸、還原型谷胱甘肽和N-乙酰半胱氨酸等小分子硫醇的活性。經(jīng)C18柱分離的硫醇與柱后試劑DTNB 反應(yīng)，使用二極管陣列檢測器進(jìn)行監(jiān)測，檢測限可低至40 nmol／L。Furuki 等［14］利用分子排阻-超高效液相-Ellman（SE-UHPLCEllman）法測定了單克隆抗體中的硫醇含量。與上述提到的HPLC-Ellman 法類似，SE-UHPLC 用于單克隆抗體的分離，柱后流出液與DTNB 反應(yīng)，經(jīng)紫外檢測器檢測，顯示出良好的選擇性、線性和重復(fù)性。這種與高效液相色譜聯(lián)用的Ellman 法具有快速、價廉、通用、不費力等優(yōu)勢，可推廣用于生物樣品和藥物中硫醇成分的定性以及定量估計。

除此之外，Ellman 試劑也可單獨用于測定多種物質(zhì)中的巰基活性，小到硫化氫氣體分子，大到蛋白質(zhì)類有機(jī)大分子。由于硫化氫是氣體，難以捕捉和測量，操作不便，因此設(shè)計硫化氫供體成為新的研究方向。Zaorska［15］等設(shè)計了硫酰胺類、硫內(nèi)酰胺類和硫脲類等化合物作為硫化氫供體，并用DTNB 作為硫化氫釋放試驗中的反應(yīng)試劑，定量測定了硫化氫釋放的動力學(xué)參數(shù)。微管蛋白是一種富含巰基的異二聚體，在哺乳動物腦微管蛋白的兩個亞基上共分布20 個半胱氨酸殘基。雖然這20 個半胱氨酸殘基均是還原型，但其反應(yīng)性并不完全依賴于表面的暴露性，因為一些更隱蔽的半胱氨酸殘基有較高的反應(yīng)性［16］。微管蛋白可以結(jié)合大量對其產(chǎn)生影響的不同結(jié)構(gòu)的小分子，這些小分子的結(jié)合造成微管蛋白結(jié)構(gòu)上的動態(tài)變化，尤其是微管蛋白上半胱氨酸的反應(yīng)活性［17］。其中，秋水仙堿已被證明可通過改變微管蛋白的結(jié)構(gòu)，使得半胱氨酸殘基失去與DTNB 的反應(yīng)活性［18］。Ellman 法簡便易行，不依賴于配體的放射性或熒光性質(zhì)，可提高配體篩選效率，因此Begaye 等［19］利用DTNB 來檢測和評價配體結(jié)合后的微管蛋白，以進(jìn)一步推斷配體結(jié)合特征。

綜合比較發(fā)現(xiàn)，盡管有各種各樣的分析手段，但是，Ellman 試劑依然是經(jīng)典且常用的巰基檢測顯色劑，在巰基的活性測定方面有著不容忽視的重要作用。

3.2 膽堿酯酶活性測定

膽堿酯酶活性測定方法主要包括羥胺-三氯化鐵法［20］和Ellman 法［21］兩種，其不同點在于羥胺-三氯化鐵法測定的是未被膽堿酯酶分解的乙酰膽堿，而Ellman 法測定的是被乙酰膽堿酯酶（AChE）分解后的硫代乙酰膽堿。對比而言，硫代乙酰膽堿與其水解產(chǎn)物成比例，因此Ellman 法在膽堿酯酶活性測定上顯得更為直接。

膽堿酯酶的活性中心有兩個：帶負(fù)電荷的陰離子部位和酯解部位，其抑制劑可逆（毒扁豆堿）或不可逆（有機(jī)磷化合物）地降低酶活性。有機(jī)磷化合物通過與活性位點的絲氨酸結(jié)合抑制乙酰膽堿酯酶活性［22］，但肟類化合物可通過親核反應(yīng)，攻擊磷?；慕z氨酸殘基，使其去磷?；謴?fù)乙酰膽堿酯酶活性［23］。因此，Ellman 法可用于膽堿酯酶抑制劑的篩選和肟類化合物重活化能力的評估。而且，有機(jī)磷化合物、肟和乙酰膽堿酯酶之間相互作用的體外動力學(xué)研究為評估體內(nèi)動力學(xué)提供了重要參考依據(jù)。

3.2.1 膽堿酯酶抑制劑篩選

膽堿酯酶抑制劑來源廣泛，既有化學(xué)合成物也有天然產(chǎn)物。天然產(chǎn)物種類繁多，Ellman 法可以快速地實現(xiàn)其最優(yōu)抑制劑的篩選，從而節(jié)省時間成本。賴東海［24］在研究生物堿類的乙酰膽堿酯酶抑制劑時，提取了22 種植物的總生物堿，并用Ellman 法對提取物進(jìn)行抑制活性篩選，這為以后開發(fā)出具有價值的活性先導(dǎo)物提供了依據(jù)。基于多奈哌齊的結(jié)構(gòu)，胡玉恒等［25］設(shè)計了芳基香豆素類衍生物，隨后利用Ellman 法測定了被合成物質(zhì)對膽堿酯酶的抑制率。綜合以上及其它類似的膽堿酯酶抑制活性篩選［26］，Ellman 法是相關(guān)研究中使用頻率較高，被科研人員所認(rèn)同的活性測定方法。

3.2.2 肟重活化能力的評估

肟對被抑制的乙酰膽堿酯酶再活化的能力研究，是乙酰膽堿酯酶體外活性動力學(xué)的重要應(yīng)用之一［27］。張軼輝［23］以Ellman 法為主要檢測手段，系統(tǒng)地評價了3 種肟類化合物及其不同濃度對乙酰膽堿酯酶的重活化作用。肟的重活化反應(yīng)較為復(fù)雜，需要考慮各種各樣的干擾因素，比如未反應(yīng)的有機(jī)磷化合物、有機(jī)磷化合物的自發(fā)脫烷基不可逆地抑制乙酰膽堿酯酶，以及具有極高抑制性的磷肟副產(chǎn)物的產(chǎn)生等。簡單來說，針對肟的親和性和反應(yīng)活性的差異性，大致可遵循兩種可調(diào)節(jié)的實驗方案：間斷測量［28］和連續(xù)測量［29］。當(dāng)肟的親和性較低時，采用高濃度的肟與被抑制的乙酰膽堿酯酶、DTNB在緩沖液中孵育，每隔一定時間間斷監(jiān)測NTB2-。當(dāng)肟的親和性高時，由于反應(yīng)過快不易操控，間斷測量不再適用，此時可在短時間內(nèi)連續(xù)測量NTB2-，依據(jù)依賴于濃度的曲線，進(jìn)行非線性回歸分析。

3.2.3 在線監(jiān)測分析系統(tǒng)的開發(fā)

Eckert 等［30-32］開發(fā)了一種動態(tài)的體外模型，可實時監(jiān)測膜結(jié)合的乙酰膽堿酯酶活性，并成功地運(yùn)用到評價不同種類肌肉勻漿的有機(jī)磷化合物、氨基甲酸酯和肟的動力學(xué)。動態(tài)的實時監(jiān)測是通過將8種不同的溶劑，如緩沖液、底物、顯色劑、有機(jī)磷化合物（抑制劑）和肟（再活化劑），連續(xù)或同時地泵入酶反應(yīng)器，流出液被輸送到紫外-可見光檢測器，實現(xiàn)在線實時記錄吸光度。這種基于Ellman 法的系統(tǒng)，不僅可以在線記錄在有抑制劑及再活化劑存在下乙酰膽堿酯酶的活性，還可以計算后續(xù)的動力學(xué)參數(shù)。

3.3 應(yīng)用于表面增強(qiáng)拉曼光譜

表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）是一種強(qiáng)大的光譜技術(shù)，可用于分析生物樣品和分子結(jié)構(gòu)，以及檢測低濃度的分析物或者污染物。許多由銀、金、銅、鋰等金屬材料制成的具有SERS 活性的底物可顯著增強(qiáng)其信號響應(yīng)。DTNB 是拉曼活性信號分子之一，已成功地被用作基于SERS 的免疫分析和診斷技術(shù)的探針。

Kaminska 等［33］以DTNB 修飾的金納米粒為探針，開發(fā)了基于SERS 的免疫分析方法，并成功地檢測了人血漿中的白細(xì)胞介素-8（IL-8）。Pang等［34］以Fe3O4＠Ag-DNA-Au＠Ag＠DTNB 偶 聯(lián) 物為SERS 探針，提出了一種用于檢測外周血和上清血漿中microRNA-10b 的一步檢測法，為胰腺癌的診斷提供了依據(jù)。通過對患者外周血和上清血漿中microRNA-10b 的定量分析，可以準(zhǔn)確地區(qū)分胰腺導(dǎo)管腺癌與慢性胰腺炎和正常對照組，這也為之后檢測多種microRNA 提供了可能性。

快速、靈敏地診斷細(xì)菌感染，對食品安全監(jiān)測和臨床治療具有重要意義。Wang 等［35］基于M13噬菌體構(gòu)建了SERS 模型來進(jìn)行選擇性檢測和滅活金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌特異性的SERS探針是通過在M13 噬菌體表面原位生長金納米粒子（AuNPs），然后用DTNB 在金納米粒表面修飾構(gòu)建而成。加入該探針后，M13 噬菌體選擇性地與金黃色葡萄球菌結(jié)合，誘導(dǎo)AuNPs 錨定在金黃色葡萄球菌表面，并標(biāo)記金黃色葡萄球菌細(xì)胞，離心收集用于SERS 檢測。此檢測方法對金黃色葡萄球菌顯示出了高選擇性和高靈敏度。

此外，Tanis 等［36］也使用由DTNB 修飾的金納米粒作為SERS 探針快速地計數(shù)大腸桿菌。隨著時代的發(fā)展，越來越多的技術(shù)和分析方法可用于細(xì)菌檢測，比如熒光光譜、表面等離子體共振、酶聯(lián)免疫吸附測定、酶聯(lián)免疫聚合酶聯(lián)反應(yīng)和石英晶體微電化學(xué)方法等。相比于其它分析方法，Tanis 等［36］開發(fā)的基于SERS 的光譜方法，具有更經(jīng)濟(jì)、更快速、高靈敏度的特點。此外，通過使用不同的抗體，該方法還可用于定量檢測其它復(fù)雜基質(zhì)（全血、血清、尿液或食物基質(zhì)等）中的多種靶點。

3.4 新二硫鍵的形成

巰基-二硫鍵的交換方法是一種有力的手段，因為它提供了將報告分子、阻斷基團(tuán)和交叉連接部分引入蛋白的可能性。近年來，Guo 等［37］采用兩步硫醇-二硫鍵交換過程，引入了新的二硫鍵，包括巰基修飾的非病毒蛋白衣殼（與DTNB 反應(yīng)生成的蛋白衣殼和NTB2-的偶聯(lián)物）和巰基修飾的客體分子與上一步偶聯(lián)物反應(yīng)，成功實現(xiàn)了姜黃素的包封，后續(xù)客體分子很容易在還原條件下，從非蛋白衣殼內(nèi)釋放出來，形成了一個良好的載藥-釋放系統(tǒng)。相比于游離的姜黃素，被蛋白衣殼包封的姜黃素有較高的溶解性，提高了藥物的生物利用度。目前，藥物遞送系統(tǒng)正是熱點話題之一，提高載藥率無疑是對藥物遞送系統(tǒng)的重大挑戰(zhàn)。上述研究證明了Ellman 試劑是良好的中間反應(yīng)試劑，可推廣用于其它載體對藥物的包封，比如類病毒顆粒和各種納米顆粒等。

4 結(jié)語

雖然Ellman 法還有待改進(jìn)的方面，比如在定量測定巰基修飾的殼聚糖類生物大分子時［38］，殼聚糖類物質(zhì)的自身難溶問題限制了它的使用，但Ellman法自開發(fā)以來，逐漸被實驗室廣泛使用，并應(yīng)用于測定巰基活性、乙酰膽堿酯酶活性和拉曼光譜，總的來說Ellman 法為一種快速、方便、有效的方法。