石 峰，宋福強

(1.農業(yè)微生物技術教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2.黑龍江省寒地生態(tài)修復與資源利用重點實驗室，哈爾濱 150080)

0 引 言

煤炭開采是世界范圍內的主要環(huán)境問題，在中國尤為重要，由于煤炭開采活動對土壤生態(tài)系統(tǒng)造成了相當?shù)呢撁嬗绊?，因此煤炭開采活動一直引起極大的環(huán)境關注[1]。據統(tǒng)計，全國已形成2.88×106hm2的廢棄地，現(xiàn)約以9.67×104hm2·a-1的速度繼續(xù)擴大，大面積的廢棄地毀壞了大片森林草原和農田，將生產性用地變成非生產性用地，除此還造成水土流失，使土地貧瘠化以及土地干旱化，從而使耕地急劇減少，同時對空氣、水體、土壤造成污染，且這些污染將長期存在[2]。因此，對于煤礦廢棄地污染的治理刻不容緩。

目前，一般采用表土剝離或挖高墊淺的混推方式對煤礦區(qū)土壤進行工程修復[3]。但工程復墾后的土壤結構嚴重破壞，上下土層錯位翻動，裸露的表土層往往是原基底土層；土體緊，孔隙小，結構不良，通透性很差，植物根系難以定植；微生物活動微弱，喪失了原有土壤孔隙結構的保水保肥能力，而且土壤有機質和養(yǎng)分缺乏[4]。生物修復是近年來新興的一種前景廣闊的治理污染的技術[5]，其中微生物—植物聯(lián)合修復技術具有成本低、抵抗力強等優(yōu)點。叢枝菌根(Arbuscular mycorrhizal，AM)真菌在自然界分布廣泛，可以與80%的陸生植物形成共生體，是土壤微生物區(qū)系中與農業(yè)生產關系最為密切的一類真菌[6]。AM真菌通過借助宿主植物光合固定的碳骨架和能量來完成自身的生長，同時發(fā)生營養(yǎng)元素的轉化和運輸，最終傳遞給宿主植物供其利用，增強其抗逆性[7]。AM真菌能夠促進植物對土壤中氮、磷、鉀等元素的吸收，改善植物的營養(yǎng)情況[8]。此外，AM真菌能夠產生球囊霉素、有機酸等次生代謝物質，直接或間接地影響宿主植物及其根際環(huán)境，從而提高植物的修復效率[9]。因此運用AM真菌與植物聯(lián)合修復技術在煤礦廢棄地修復方向具有很大的前景。

國內外對應用AM真菌和植物形成共生體來修復煤礦廢棄地進行了研究，但結果仍不完善并且缺少較大型的試驗。本文主要討論AM真菌對煤礦廢棄地易造成的重金屬污染、有機化學物質污染的修復作用以及增強礦區(qū)植物的生存能力，為AM真菌修復煤礦廢棄地的后續(xù)應用提供科學依據。

1 AM真菌對煤礦廢棄地植物生長的促進作用

1.1 AM真菌對采煤沉降區(qū)植物根系損傷的修復作用

我國90%的煤炭資源采用地下開采方式開采，造成地表沉陷環(huán)境破壞，采煤沉陷引起的地裂縫會使土壤結構退化，改變水分蒸散量，并對植物根系造成機械損傷[10]。采煤沉陷區(qū)植物根系的損傷是由多個外部因素綜合作用的結果，這些外部因素包括受損根系處土壤含水量和礦物質元素的變化、植物根際微生物數(shù)量的減少及其和土壤酶內在聯(lián)系的改變、植物根系所處不同坡位的塌陷、受損根系所處裂縫的寬度和落差、植物根系距裂縫的距離等。生長素(IAA)、赤霉素(GA)、細胞分裂素(CTK)和脫落酸(ABA)為植物重要內源激素，也是植物響應逆境的最敏感組分，根系受損必然引起這些根系內源激素相應的變化。弄清楚根系損傷的的誘因是研究AM真菌修復植物根系損傷機制和機理的基礎，目前對于AM真菌修復根系損傷，已經有了一定的研究和結果。

畢銀麗等[11]發(fā)現(xiàn)AM真菌可降低根系損傷對內源激素分泌的影響，AM真菌在修復根損傷中具有一定的作用。孫金華等[12]將采煤沉陷區(qū)檸條作為宿主植物接種AM真菌，發(fā)現(xiàn)檸條株高、冠幅和地徑顯著提高；接菌檸條葉片可溶性糖含量和過氧化氫酶活性顯著增加。Bi Y等[13]研究發(fā)現(xiàn)AM真菌顯著提高了地上部和根生物量和N、P、K含量，增加了葉面積和葉綠素含量，增加了IAA、CTK水平，降低了根系ABA水平；此外，接種AM真菌摩西管柄囊霉改善了受地裂縫影響植物的激素平衡，有助于減輕根系對玉米生理和生長的損害效應。因此，AM真菌與礦區(qū)植物形成共生體，對增強礦區(qū)植物耐受力，促進其生長發(fā)育，改善礦區(qū)環(huán)境、恢復礦區(qū)植被具有重要的應用意義。

1.2 AM真菌改善礦區(qū)植物生存環(huán)境

煤礦廢棄地土壤貧瘠，表現(xiàn)之一為土壤中各種元素缺乏和難以利用。磷是植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素之一，土壤中能夠被植物吸收利用的磷稱為土壤有效磷[14-15]。當植物體內缺磷時，會使蛋白質的合成受阻，細胞質、細胞核的形成也受阻，進而影響細胞的正常分裂分化的同時還會使植物矮化、葉片變小，夜色暗綠缺少光澤等癥狀[16]。研究表明AM真菌能促進根際有機磷礦化，提高其生物有效性[17]。作為植物需求量最大的營養(yǎng)元素，氮素是陸地生態(tài)系統(tǒng)初級生產力的主要限制因子[18-19]。無機氮是植物的重要氮源，其中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮是植物可以直接利用的兩種主要氮源[20]。AM真菌可以使土壤中的有機氮分解為無機氮，供給植物吸收利用。相比于其它土壤氮素循環(huán)過程，固氮過程是一個被研究較多的過程，固氮促進了全球范圍內土壤中氮素的累積。很多研究證明接種AM真菌可以增強豆科植物根瘤的固氮能力[21]。氮素在供體和受體之間的這種傳遞具有重要的生態(tài)意義，可以影響到植物之間的生長和競爭，進而維持生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。

同時AM真菌對不同養(yǎng)分元素活化具有特異性。蘆筍接種摩西球囊霉(Glomusmosseae)后，顯著提高了土壤中鉀、鎂、錳元素有效性，AM真菌增強了蘆筍根系從土壤中吸收這些元素能力，而對于鋅的吸收量卻減少[22]。菌絲能進入根系不能進入的直徑較小的土壤孔隙內，吸收毛管水和礦質營養(yǎng)。菌絲穿插進入土壤小孔隙中，顯著增加土壤水穩(wěn)性和大團聚體數(shù)量，改良土壤結構[23]。菌根分泌還原物質, 使Mn (Ⅳ) 還原至Mn (Ⅱ) ，增強礦物錳溶解和植物對其的吸收[24-25]。由此可見，AM真菌可以通過與植物形成的共生體來溶解土壤中難分解的礦質元素，改善礦區(qū)植物所處的土壤環(huán)境，使得植物更好的生長。

2 AM真菌對煤礦廢棄地重金屬污染的修復作用

煤炭資源的開采、加工和利用過程會引起土壤環(huán)境污染、地表塌陷等生態(tài)環(huán)境問題，對人居環(huán)境、人群健康、生態(tài)安全等產生重要影響，而重金屬污染治理是煤礦廢棄地修復的重要內容[26]。

2.1 AM真菌修復重金屬污染的表現(xiàn)形式

AM真菌借助根外菌絲為共生宿主植物提供水分和無機礦物質營養(yǎng)，如磷素養(yǎng)分等，在促進植物生長發(fā)育、改善植物營養(yǎng)狀況、增強植物逆境抗性、提高植物重金屬耐性等方面起著重要作用[27]。楊玉榮[28]的研究表明，在鉛污染土壤中接種AM真菌的刺槐植株中N、P、S和Mg元素含量較未接種植物有明顯提高，說明AM真菌能改善植物養(yǎng)分吸收狀況，從而促進植物生長。鈾可以抑制蜈蚣草地上部的生長，而接種AM真菌能夠減輕這一問題，說明AM真菌能夠有效緩解鈾毒害[29]。AM真菌可以通過調節(jié)植物對重金屬的吸收和轉運，從而有助于增強宿主植物對重金屬脅迫的抗性[30]。AM真菌能夠增加煤矸石綠化基質的可利用性營養(yǎng)物質含量，提高基質肥力，促進植物生長，在煤矸石綠化利用中具有重要的應用價值[31]。AM真菌能夠增加煤矸石的速效磷鉀、微生物量碳氮磷、根外菌絲長度，提高過氧化氫酶和磷酸酶活性，最終促進煤矸石的分解和綠化，木霉菌與叢枝菌根真菌混施后，進一步促進了煤矸石的分解和綠化，其中中劑量的木霉菌協(xié)助促進效果最好，使煤矸石分解率、紫花苜蓿的菌根侵染率和紫花苜蓿鮮重分別顯著提高了37.98%，39.70%和39.77%[32]。Wu S L等[33]將蒲公英接種AM真菌，發(fā)現(xiàn)與未接種AM真菌相比，接種AM真菌顯著降低了蒲公英根系和地上部的Cr濃度,降低了Cr對蒲公英的毒害影響。這些說明，AM真菌擴增后大規(guī)模地接種到植物體中可能是未來增強植物在煤礦重金屬污染土壤中耐受性的應用之一。

在諸多研究報道中，對植物進行Cd處理，相當于對照組而言，接種AM真菌能夠促進植物生長，植物的生物量以及氮、磷等營養(yǎng)物質的含量顯著增加[34]。AM真菌還能夠提高植物根系的Cd含量，降低地上部含量，減輕Cd對植物地上部的毒害。劉靈芝等[35]發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫下AM真菌能夠影響宿主植物對重金屬的吸收轉運，接種AM真菌的玉米根系中Cd濃度顯著高于對照未接種AM真菌的玉米，地上部則情況相反，接種AM真菌的玉米植株地上部Cd濃度低于對照。Rask K A等[36]認為，在菌根化程度高的植物中，更能減少Cd向植物地上部的轉運。即使在復合重金屬脅迫條件下，AM真菌也能提高植物Cd積累能力[37]。由此可見，AM真菌在修復礦區(qū)重金屬污染方面具有良好的效果和潛力。

2.2 AM真菌修復重金屬污染的機制

AM真菌代謝產物增強植物對重金屬污染的耐受性。球囊霉素可由絕大多數(shù)種的叢枝菌根分泌，并且能夠與多種重金屬結合，可促進重金屬的遷移運輸?shù)冗^程，能夠有效增加土壤有機碳庫，改善土壤團聚體結構及性能。作為一種金屬離子專性糖蛋白，特定的某些金屬能與球囊霉素發(fā)生絡合作用從而被固定。而某一蛋白的分泌與基因表達必然相關，可以聯(lián)想叢枝菌根影響重金屬遷移的原因之一是通過影響植物體內某些基因表達，促使植物體內能夠和重金屬特異性結合或固定重金屬元素的物質分泌[38]。植物提取過程就是通過重金屬相應地超富集植物轉運該重金屬的作用，將土壤中的重金屬向植物地上部通常是莖部轉運，通過對植物的收割及焚燒等方法去除重金屬。一般情況下這種超富集植物不會是糧食作物，這樣就避免了重金屬進入食物鏈。

AM真菌能通過調控自身以及宿主植物抵御重金屬污染的毒害作用。在紫花苜宿上接種根內球囊霉(Glomusintraradices)后，發(fā)現(xiàn)植物螯合素合成酶MsPCS1和金屬硫蛋白MsMT2均下調，可能是因為Cd已被固存在根內細胞的真菌結構中，從而導致宿主植物紫花苜宿根細胞中Cd濃度降低[39]。Cd進入根內，細胞內的氧化還原平衡遭到破壞，產生活性氧基團，AM真菌能刺激植物激活自身的防御機制來抵御重金屬的危害，通過提高植物體內一些抗氧化物酶的活性，達到清除自由基、避免對細胞造成傷害的目的，例如植物葉片過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)等活性升高[40]。孫紅[41]利用RNA-seq測序技術研究Cd脅迫下，根內根生囊霉接種柳枝稷后，AM真菌如何調節(jié)植物基因表達。通過試驗發(fā)現(xiàn)，接種后的柳枝稷根系POD、SOD等抗氧化酶基因上調，表明脅迫條件下，植物體內活性氧基團累積引發(fā)氧化應激反應。當Cd進入到植物的組織或細胞后，植物會產生相應的配體螯合劑，螯合Cd并將Cd固定在植物的根細胞質或液泡內，對Cd起到“區(qū)室化隔離”的作用,避免細胞器與Cd接觸，達到對Cd降低毒性或者解除毒性的目的，這類螯合劑包括植物絡合素(phytochelatins,PCs)和金屬硫蛋白(metallothioneins,mMTs)等[42]。目前對于AM真菌修復重金屬污染的機制方面有了充足的研究，修復機制和修復機理也較為清晰，這為AM真菌修復煤礦廢棄地重金屬污染提供了理論基礎，表明了AM真菌具有修復煤礦廢棄地污染的潛力。

3 AM真菌對煤礦廢棄地有機化學物質污染的修復作用

我國煤炭資源開采以井工礦為主，為了保證井下的安全生產，必須排出大量礦井水[43-44]。常規(guī)的礦處理工藝可以去除水中大部分污染物，但是油類等有機污染物則難以去除(特別是溶解性有機污染物)[45]。這些污染物的排放在污染水體的同時也污染土壤。土壤的有機污染主要包括石油污染、多環(huán)芳烴類 (Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs) 污染、多氯聯(lián)苯類 (Polychlorinated Biphenyls，PCBs) 污染等。這些物質殘留于土壤中，不僅影響了土壤正常的結構和功能，抑制了植物的生長，還能通過食物鏈的傳遞進入人體，引起生殖系統(tǒng)障礙和內分泌系統(tǒng)失調，有些甚至具有明顯的致畸、致癌和致突變作用[46]。對此將從修復機制以及應用來介紹AM真菌對煤礦廢棄地有機化學物質污染的修復作用。

3.1 AM真菌修復煤礦廢棄地有機化學污染物的潛力

多氯聯(lián)苯是一種典型的持久性有機污染物，具有化學穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、抗氧化性高及高疏水性，由于PCBs的高度持久性、生物累積性及潛在致癌性，因而受到更多的關注[47]。

在植物—AM真菌這一共生體系中，菌根作為真菌與植物的結合體，對土壤的影響具有微生物和植物的雙重特性，不僅能從微生物修復角度改變土壤微生物種類和數(shù)量，影響有機降解，還能從植物修復角度通過改善根系的吸收面積、降低植物與土壤之間的質流阻力、促進根系對水分和養(yǎng)分的吸收和利用等方式來影響有機物的降解[48]。滕應等[50]在盆栽條件下研究了叢枝菌根真菌和苜蓿根瘤菌對PCBs污染土壤的聯(lián)合修復效應，結果表明無論是單獨還是同時接種均顯著促進了土壤PCBs的降解率[49]。有研究結果表明，接種AM真菌與添加豬炭均表現(xiàn)出提高土壤PCBs降解率的趨勢，其中，接種AM真菌同時添加大粒徑豬炭的修復效果最為顯著。秦華等[51]在對美國南瓜(Cucurbita pepo L.)接種不同AM真菌后發(fā)現(xiàn)，AM真菌提高根系生物量，促進微生物生長的同時，也提高了PCBs 的降解率，且根際土壤中降解率顯著高于非根際土壤。有研究論證了叢枝菌根菌絲在不同多氯聯(lián)苯同系物降解效率中的重要作用：通過細菌生長、BPH基因豐度和細菌群落組成的分析，顯示了不同的土壤菌根菌絲生物量是不同的，支持了菌根菌絲可以通過改變菌根圈的細菌生長和群落組成來加速低氯聯(lián)苯的消散的假設，并形成土壤多氯聯(lián)苯的同系物剖面。由于AM真菌—植物共生在陸地生態(tài)系統(tǒng)中普遍存在，因此AM真菌對多氯聯(lián)苯同系物消散的影響在陸地生態(tài)系統(tǒng)修復多氯聯(lián)苯污染土壤中具有廣泛的相關性，同時對煤礦廢棄地有機化學污染物的修復具有很大的潛力。

多環(huán)芳烴(PAHs)是土壤中的持久性有機污染物，被美國環(huán)境保護局列為優(yōu)先污染物，因其致癌和致突變特性而受到全世界的關注。楊振亞等[52]通過研究發(fā)現(xiàn)摩西球囊霉和層狀球囊霉處理土壤中AM真菌菌絲密度、總球囊霉素含量均與土壤中菲和芘的去除率之間存在極顯著正相關關系，表明接種AM真菌提高了土壤中AM真菌菌絲密度和總球囊霉素含量，并促進了土壤中PAHs的去除。研究表明，AM真菌可以促進植物在碳氫化合物污染土壤中的建立和存活，也有助于提高植物根際對碳氫化合物的生物降解率[53]。AM真菌利于南瓜轉移根系吸收的高濃度PAHs化合物至地上部，降低PAHs對根系的脅迫,增強南瓜在高濃度PAHs污染土壤中存活[54]。 AM真菌在處理有機化學污染物方面已有了相當?shù)难芯?，取得了較好效果，在修復煤礦廢棄地有機化學污染物方面具有了理論基礎和一定的實例，應用前景樂觀。

3.2 AM真菌對有機化學污染物的修復機制

AM真菌對于有機化學污染物污染的修復機制分3個方面：

1) 修復植物生長面臨的問題之一是土壤中碳氫化合物的疏水性限制了其對水分和無機養(yǎng)分的吸收。一些研究的結果表明，應用AM真菌可以克服這些困難[55]。AM真菌對非生物脅迫下植物生長產生的有利作用，是使植物根系抗氧化活性增強的結果。AM真菌的侵染可以提高被多環(huán)芳烴和石油烴污染的植物在水分脅迫和鹽分脅迫下的酶和非酶抗氧化劑活性[56]。由此可知，AM真菌通過提高宿主植物的生長狀態(tài)來提高植物對有機污染的修復能力。

2) AM真菌在清理碳氫化合物污染場地中的重要作用主要是通過AM真菌介導的根際降解來實現(xiàn)的，短暫的根外菌絲體擴大了根際的范圍，從而形成了高磷層，為土壤微生物的活動和增殖提供了有利的棲息地[57]。在根的降解過程中，來源于微生物的酶和根系分泌物參與其中。后者除植物胞外酶外，還含有系列共代謝物，構成了負責有機污染物生物降解的微生物的碳和能量來源。促進多環(huán)芳烴降解的共代謝產物主要包括酚類化合物、溶解有機碳以及小分子有機酸[58]。在絲狀層和菌絲層中，氧化還原酶活性較高，如脫氫酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶、過氧化物酶以及超氧化物歧化酶等，這些酶主要負責多環(huán)芳烴的氧化轉化和降解，此外，它們還保護植物免受氧化脅迫[59]。因此，叢枝菌根真菌通過介導的植物根際來降解有機污染物，以此修復污染土壤。

3) 由于高度疏水性，植物對多環(huán)芳烴的吸收和向地上部的轉移是有限的，主要發(fā)生在根組織中。在根組織中，多環(huán)芳烴被控制在活細胞的親脂性隔間，從而對細胞膜和細胞結構產生不利影響。Lenoir I等[60]證實，菌根侵染減少了多環(huán)芳烴在地上部的積累，根系對多環(huán)芳烴的吸收比未接種對照增加0.2%，此外，菌根組織中的總積累量占多環(huán)芳烴總量的6.6%，而生物降解的多環(huán)芳烴占總積累量的17.8%。多環(huán)芳烴既可被菌根吸收，也可被菌絲外真菌結構吸收，利用菌根植物的菌絲和菌絲—根室分離系統(tǒng)進行的實驗表明，菌根中的多環(huán)芳烴主要被莖外菌根菌絲吸收，然后轉移到根中[61]。所以，叢枝菌根真菌能夠促進植物對多環(huán)芳烴的吸附和生物積累來修復土壤的有機化學物質污染。

4 結論和展望

叢枝菌根真菌在環(huán)境及農林領域都有著巨大發(fā)展的研究潛力，然而叢枝菌根真菌在大規(guī)模純培養(yǎng)方面仍有較難的技術問題，因此如何將其大規(guī)模地應用于污染土壤修復是目前亟待解決的問題?？紤]到叢枝菌根真菌對同種植物的侵染情況有所不同，同種叢枝菌根真菌對不同植物的侵染情況也各有不同，通過研究菌根侵染率可以有效提高叢枝菌根這一共生體修復重金屬污染土壤的效率。

AM真菌輔助植物修復在清除碳氫化合物污染土壤方面顯示出巨大的潛力，但要優(yōu)化該方法并克服其局限性，還需要進行更全面的實驗。尤其需要在多環(huán)芳烴混合污染的土壤上進行野外條件下的實驗，因為實驗室研究消除了一些環(huán)境因素，而且通常是在單一AM真菌物種和單一污染物的情況下進行的。AM真菌輔助植物修復的設計還應包括選擇合適的寄主植物，因為不同的植物種類和生態(tài)型對有毒有機污染物的抵抗力不同。要特別注意植物根系的特點。最好的菌株應該對AM真菌侵染敏感，并通過提高根系分泌物的產量來強烈響應菌根侵染。

叢枝菌根真菌分為土著菌種和外來菌種，而土著菌種由于長期生活在已受污染的環(huán)境中，本身對污染物具有一定耐性，與植物形成共生體系后，在共生系統(tǒng)中能夠發(fā)揮較外來種更明顯和穩(wěn)定的作用。因此土著叢枝菌根真菌菌劑的制備困難是現(xiàn)在叢枝菌根真菌尚未使用大面積污染土壤修復的重要限制因素。

利用AM真菌修復廢棄礦地進行了很多的研究，但仍缺乏較大規(guī)模的系統(tǒng)性的實驗，而且對于AM真菌修復煤礦廢棄地的修復機理方面，目前還不完全清楚。采煤沉陷區(qū)土壤結構被擾動，AM真菌如何改善土壤結構，協(xié)調水肥供應，也是生態(tài)修復需要深入探討的問題之一。廢棄礦地生態(tài)修復存在實驗周期長，修復過程中易損傷的問題。繼續(xù)深入發(fā)掘和利用AM真菌的對于修復煤礦廢棄地污染中的各種機制和機理是十分重要的，且具有重大的理論價值和現(xiàn)實生態(tài)意義。