周伊敏，姜志梅

孤獨癥譜系障礙 （autism spectrum disorder，ASD） 是一組發(fā)生于兒童發(fā)育早期的發(fā)育障礙性疾病，以社交障礙、限制性重復刻板行為和興趣狹窄為核心癥狀［1］。美國疾病控制與預防中心于2020 年公布的 ASD 患病率由 1/59 增加至 1/54，中國 0～6 歲ASD 兒童患病率為 3.51‰，均呈逐年上升趨勢［2，3］。迄今ASD 病因與發(fā)病機制尚未闡明，常伴有的感知覺、胃腸道和睡眠等問題已嚴重影響了兒童的日常生活，導致 ASD 成為嚴峻的社會問題之一［4］。由于兒童早期的神經(jīng)系統(tǒng)可塑性強，研究者認為早期識別、及時診斷以及有效干預能明顯改善ASD 的不良預后［5］。然而現(xiàn)在大多是結(jié)合兒童的核心癥狀、典型行為以及量表對ASD 進行診斷，主觀性強，早期診斷難以實現(xiàn)［6］。故尋找和開發(fā)能客觀有效地預測ASD 危險因素或篩查可疑ASD 兒童的生物標志物，已成為ASD 領(lǐng)域的研究熱點。近年ASD 的外周血潛在生物標志物的研究取得較大進展，尤其在MicroRNA、lncRNA、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶、淀粉樣前體蛋白以及免疫活性物質(zhì)方面。該文就ASD 外周血潛在生物標志物的研究進展進行綜述，以期為ASD 的病理機制研究、早期診斷及開發(fā)藥物治療新靶點提供幫助。

1 ASD 與非編碼RNA

1.1 MicroRNA微小 RNA（microRNA，miRNA）是一類長度約20～24 個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，由內(nèi)源基因進行編碼并參與基因轉(zhuǎn)錄后的表達。相關(guān)研究表明尸檢腦組織、外周血和唾液中miRNA 表達的失調(diào)與 ASD 有關(guān)［7］。一項針對腦部尸檢標本miRNA 表達水平的高通量分析表明，與正常人對比，hsa-miR-21-3p 在ASD 中被上調(diào)，能夠靶向調(diào)節(jié)ASD 相關(guān)的神經(jīng)元基因并下調(diào)其表達；hsa_can_1002-m 在 ASD 中被下調(diào)，能夠調(diào)節(jié)涉及神經(jīng)發(fā)育和免疫功能的表皮生長因子受體和成纖維細胞生長因子受體的信號通路［8］。Nt 等［9］采用定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) （quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）對 30 例 3～11 歲 ASD 患者與 30 名健康對照組的血清miR-328-3p 和miR-3135a 表達水平進行檢測，結(jié)果顯示： 與健康對照組相比，ASD 患者中的miR-328-3p 和 miR-3135a 明顯下調(diào)； 血清 miR-3135a 和miR-328-3p 可將ASD 患者與健康對照組區(qū)分開，有望成為診斷ASD 的新型生物標志物。Kichukova 等［10］對 ASD 患者與健康對照組血清中的42 種 miRNA 進行了 qRT-PCR 分析，發(fā)現(xiàn) ASD 患者血清中的 3 種 miRNA （miR-365a-3p、miR-619-5p 和miR-664a-3p） 表達水平顯著高于對照組，血清中的 5 種 miRNA（miR-3135a、miR-328-3p、miR-197-5p、miR-500a-5p 和 miR-424-5p）表達水平顯著低于對照組，提出這8 種血清miRNA 可作為診斷 ASD 的潛在生物標志物。Nakata 等［11］采用 qRTPCR 方法檢測高功能 ASD （High Functioning Autism Spectrum Disorder，HFASD） 成人患者的血液miRNA 表達水平，結(jié)果與正常組相比，miR-6126在ASD 患者中下調(diào)顯著，且miR-6126 表達水平與ASD 的癥狀嚴重程度有關(guān)，但與智商（Intelligence Quotient，IQ） 無關(guān)，提示血液 miRNA 可能是診斷HFASD 的潛在生化指標。還有研究通過高通量測序技術(shù)（High-throughput sequencing）證明，血清miRNA表達水平可用作篩選和檢測ASD 患者自身免疫性疾病和線粒體功能障礙的潛在生物標志物［12］。由于不同組織、RNA 質(zhì)量和用藥狀態(tài)等因素，miRNA 尚未成為特異性診斷ASD 的生物標志物，后續(xù)研究需注重控制潛在影響因素，且擴大樣本進行miRNA亞型之間的重復驗證，從而確定最適用于ASD 診斷的miRNA 亞型。

1.2 lncRNA長鏈非編碼RNA （long non-coding RNA，lncRNA） 是長度大于200 個核苷酸的非編碼RNA，參與細胞分化、劑量補償效應(yīng)（Dosage compensation effect）、細胞周期以及表觀遺傳調(diào)控等神經(jīng)活動。Parikshak 等［13］采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA-seq） 檢測了48 例ASD 患者與49 名正常人的腦部尸檢標本的lncRNA 表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ASD 患者的lncRNA 存在靈長類動物特異性表達模式，于大腦中相對富集并富含ASD 風險基因，其中兩種靈長類特異性的lncRNA（即 LINC00693 和 LINC00689）在ASD 患者皮質(zhì)中被上調(diào)，而在正常發(fā)育期間是下調(diào)的。Wang 等［14］通過微陣列雜交（Microarray hybridization）和實時熒光定量 PCR（quantitative realtime PCR）比較 25 對 3～5 歲 ASD 和健康兒童的外周血 lncRNA 水平，發(fā)現(xiàn) ASD 中的 13 種突觸lncRNA 具有顯著差異性表達，與HOX 基因有關(guān)的lncRNA 也存在差異性表達，并提出外周血lncRNA可能是診斷ASD 的潛在生物標志物。至今國內(nèi)外對此研究存在樣本量小、缺乏重復驗證等局限性，進一步探究lncRNA 的分子作用機制與途徑將有助于發(fā)掘lncRNA 與ASD 發(fā)病的相關(guān)性。

2 ASD 與細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶

細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracelluar signalregulated protein kinase，ERK）是絲裂原活化蛋白激酶家族（mitogen-aetivated protein kinases，MAPKs）的重要一員，參與MAPKs 的三級酶促級聯(lián)反應(yīng)，即MAPK 激酶的激酶 （Raf）-MAPK 激酶 （MEK）-MAPK（ERK，其中 ERK1 和 ERK2 是主要亞型）信號傳導途徑。通過連續(xù)的磷酸化步驟，ERK 信號傳導通路將傳入的細胞外信號從細胞表面受體轉(zhuǎn)導至細胞核中，從而調(diào)控細胞存活、增殖、分化和遷徙以及細胞核內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄與表達，同時參與一系列神經(jīng)活動，包括突觸可塑性的調(diào)節(jié)、大腦發(fā)育的調(diào)控、學習和記憶的形成等。

已有ASD 基因集和通路網(wǎng)絡(luò)分析表明，MEK/ERK 信號傳導通路與 ASD 聯(lián)系密切［15］。Pucilowska等［16］發(fā)現(xiàn)小鼠模型 ERK1 基因或 ERK2 基因的缺失，均可導致孤獨癥樣表現(xiàn)。有研究進一步表明，ASD 小鼠模型大腦皮質(zhì)中MEK/ERK 信號通路的激活水平升高［17］。Faridar 等［18］發(fā)現(xiàn)剛出生和 30 日齡的BTBR 小鼠大腦的ERK 通路過度激活，尤其是剛出生的小鼠。Cheng 等［19］發(fā)現(xiàn)與對照組 B6 小鼠相比，剛出生的BTBR 鼠模型海馬裂解液中磷酸化的 MEK （Phospho-MEK，p-MEK） 和磷酸化的ERK（Phospho-ERK，p-ERK）表達水平均升高。孫艷秋等［20］發(fā)現(xiàn)ASD 仔鼠模型在發(fā)育過程中額皮質(zhì)ERK 的表達增加，于 14 日齡達到最大峰值，28 日齡趨于穩(wěn)定。一項研究表明MEK/ERK 通路的活性受 MEK 抑制劑 U0126 特異抑制后，VPA 聯(lián)合U0126 組大鼠海馬、小腦組織及前額葉皮質(zhì)中的p-MEK 和p-ERK 表達均顯著下降，明顯減輕了孤獨癥樣行為［21］。Pucilowska 等［22］對產(chǎn)前及出生后 90 日齡的ASD 小鼠模型均使用ERK 特異性抑制劑細胞滲透肽RB1/RB3，模型小鼠的行為缺陷得到有效改善。基于ASD 鼠模型腦組織的MEK/ERK 通路過度激活，F(xiàn)aridar 等［18］還揭示了 ASD 鼠模型淋巴細胞中MEK 蛋白和ERK 蛋白的表達水平與其在鼠模型腦組織中的表達水平呈顯著正相關(guān)性，提示ASD患者淋巴細胞中的MEK/ERK 通路可能失調(diào)，且推測或許可在ASD 患者外周血中開發(fā)相關(guān)生物標志物。對此，Erickson 等［23］首次通過免疫組化技術(shù)和蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting）對ASD 患者外周血淋巴細胞ERK 表達展開研究，發(fā)現(xiàn)ASD 患者p-ERK 較對照組增加顯著，并提出ERK 可考慮成為篩查ASD 的潛在生物標志物，但結(jié)果無法進行ASD 患者亞組的有效分析，包括臨床癥狀程度、年齡、智力、服用精神藥物等。下一步研究需擴大樣本重復驗證以確定外周血淋巴細胞中過度激活的ERK 是否等同于大腦中的ERK 失調(diào)，目前國內(nèi)對此實證研究尚屬空白，而且MEK 表達失調(diào)是否可在人外周血中檢測尚不明確。

3 ASD 與淀粉樣前體蛋白

淀粉樣前體蛋白 （Amyloid precursor protein，APP）是一種單次跨膜蛋白，廣泛存在于全身組織細胞中。APP 經(jīng)a 分泌酶裂解后生成具有神經(jīng)營養(yǎng)作用 的分泌 型 APP-α （secreted amyloid precursor protection alpha，sAPP-α）；但經(jīng) β 和 y 分泌酶裂解后的APP 產(chǎn)生在高濃度（nM）時表現(xiàn)為毒性作用的β-淀粉樣蛋白 （β-amyloid，Aβ），Aβ 包含 40 或 42個氨基酸殘基（Aβ1-40、Aβ1-42）。

近年有對照研究表明，ASD 兒童的外周血sAPP-α 水平較健康兒童增加明顯，而且差異在不同程度病情ASD 間具有統(tǒng)計學意義［24］。這一研究結(jié)果經(jīng)國內(nèi)汪鴻等人擴大樣本量后得到進一步證實，顯示重度ASD 兒童的外周血sAPP-α 水平較輕-中度ASD 的增加顯著，并發(fā)現(xiàn)父母親高齡受孕、早產(chǎn)小孕周、出生體重輕、新生兒高膽紅素血癥及缺氧缺血性腦病是ASD 兒童sAPP-α 升高的影響 因 素［25］。Bailey 等［26］通過酶聯(lián)免疫吸附 測定 法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA） 檢測了25 例2～4 歲 ASD 兒童和25 名年齡匹配的健康兒童的血漿 sAPP-α 水平，發(fā)現(xiàn) sAPP-α 在 60%的ASD 兒童中表達顯著增加，故考慮sAPP-α 可作為早期識別兒童患 ASD 的輔助指標。Ray 等［27］用ELISA 法分析了 6 例輕-中度 ASD 兒童、15 例重度ASD 兒童以及18 名健康兒童的血漿樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重度 ASD 兒童血漿 sAPP-α 表達顯著增高；Aβ1-40、Aβ1-42 與 sAPP-β 顯著下降； 輕-中度ASD 患兒與健康兒童對比無顯著差異。研究提示外周血sAPP-α 可能是輔助診斷重度ASD 的潛在生物標志物。為進一步探討APP 在ASD 外周血中表達的特異性，汪鴻等［28］對 103 例 ASD 兒童血漿總sAPP、sAPP-α 和 sAPP-β 采用 ELISA 法進行檢測，且與 78 名健康兒童、25 例注意缺陷多動障礙（attention deficit hyperactivity disorder，ADHD） 兒童和 25 例智力障礙（intellectual disability，ID）兒童進行對比，結(jié)果顯示：sAPP 和 sAPP-α 在 ASD、健康兒童、ADHD 和ID 之間差異有非常顯著統(tǒng)計學意義，sAPP-β 的表達差異無統(tǒng)計學意義，證明外周血sAPP 和sAPP-α 表達在ASD 兒童中具有特異性，可作為疾病篩查的實驗室指標。此外與36 名3～16歲健康兒童比較，52 例ASD 兒童的血漿Aβ1-40、Aβ1-42 和 Aβ40/Aβ42 比值均顯著下降，且受試者工作特征曲線 （receiver operator characteristic curve，ROC）在區(qū)分ASD 及健康兒童上顯示高度特異性與敏感性［29］。盡管以上研究尚未明確APP 是導致ASD 發(fā)病的直接原因，且sAPP-α 如何介導與ASD 相關(guān)的細胞信號傳遞仍是未解之謎，但APP 目前作為一種外周血生物標志物結(jié)合臨床癥狀診斷ASD 是有參考意義的。

4 ASD 與免疫活性物質(zhì)

4.1 細胞因子細胞因子（cytokine，CK）是一類由免疫細胞和某些非免疫細胞經(jīng)刺激而合成、分泌的具有廣泛生物學活性的小分子蛋白質(zhì)，可介導和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答，或作為生長因子促進靶細胞增殖、分化。Saghazadeh 等［30］對 38 項研究中涉及2487 名參與者 （1393 名 ASD 患者和 1094 名對照組） 的外周血細胞因子水平進行Meta 分析，發(fā)現(xiàn)ASD 患者外周血干擾素（Interferon，IFN）-γ、白介素（Interleukin，IL）-1β、IL-6 和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 的 濃 度 均 高 于 對 照 組 。Krakowiak 等［31］使用 Luminex Multiplex 技術(shù)對 214例 2～4 歲 ASD 兒童 （141 例重度 ASD，73 名輕-中度ASD）、62 名正常兒童和27 例發(fā)育遲緩（developmental delay，DD）兒童的出生48 h 內(nèi)儲存的血液樣本進行細胞因子水平檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新生兒期血清 IL-1β 和 IL-4 濃度增高者，患 ASD 風險增大；其中 IL-4 濃度升高者患重度ASD 風險增加1.4 倍，且與非語言的認知能力呈負相關(guān)；IL-1β 濃度升高者患輕-中度ASD 風險增加3 倍。研究提示IL-1β和IL-4 可為早期預測不同嚴重程度ASD 提供參考依據(jù)。有研究通過ELISA 法對42 例ASD 兒童和20名相匹配的正常兒童的血清細胞因子水平進一步分析，顯示 ASD 兒童的 IL-1β，IL-4，IL-6 和 IL-13濃度較正常兒童顯著升高，而且ROC 結(jié)果表明這4種因子可能是診斷 ASD 的潛在生物標志物［32］。Singh 等［33］對 30 例 ASD 兒童與匹配的正常兒童的血清成分進行檢測，發(fā)現(xiàn)ASD 兒童血清IL-8 水平較對照組的高，而且促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）和IL-8 較其他表達差異的血清蛋白具有更高診斷水平。其中IL-8 診斷ASD 的靈敏度達94%、特異性為55%、準確率為74%；TSH 診斷的靈敏度達94%、特異性為60%、準確率為76%；結(jié)合兩項指標診斷的靈敏度達89%、特異性為75%、準確率為 82%。Mostafa 等［34］用 ELISA 法檢測62 例4～11 歲的ASD 兒童的血清上皮細胞衍生的中性粒激活胎78（ENA-78）水平，發(fā)現(xiàn)ASD 兒童的ENA-78 水平顯著高于相匹配的健康對照組，且與ASD 兒童的血清抗神經(jīng)自身抗體的升高顯著相關(guān)，提出接下來應(yīng)探討ENA-78 拮抗劑對ASD 兒童的治療作用。另有研究對84 例 ASD 兒童、49 例DD兒童和159 名正常兒童在出生48 h 內(nèi)儲存的血液樣本進行檢測，顯示與正常兒童對比，ASD 兒童的單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1） 升高，DD 兒童的巨噬細胞炎癥蛋白 1α（macrophage inflammatory protein-1alpha，MIP-1α）降低，表明檢測新生兒血液中的免疫生化指標可能有助于早期識別異常的神經(jīng)發(fā)育疾病［35］。目前細胞因子在ASD 診斷中的特異性尚未明確，甚至出現(xiàn)研究結(jié)果相矛盾，后續(xù)跨文化的縱向研究需更嚴謹以增加數(shù)據(jù)的可靠性和臨床的應(yīng)用性。

4.2 自身抗體自身抗體指針對自身組織，器官、細胞及細胞成分的抗體，其中抗腦抗體是一類能在血清中作用于腦組織的自身抗體。已有研究報道ASD 患兒的血清抗核抗體、骨橋蛋白、抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體等抗腦抗體水較正常兒童顯著升高，并與ASD 病情的嚴重程度呈正相關(guān)［36］。Al-Ayadlhi 等［37］采用ELISA 法對60 例 3～12 歲 ASD 兒童的血漿抗核小體特異性抗體進行檢測，發(fā)現(xiàn)與健康兒童對比，ASD 兒童血漿內(nèi)存在高水平的抗核小體特異性抗體，且存在自身免疫病家族史的ASD 兒童的血漿抗核小體抗體水平顯著高于無自身免疫病家族史的ASD 兒童，提示可通過免疫生化指標來探究ASD 的發(fā)病機制及潛在的生物標志物。Frye 等［38］的研究發(fā)現(xiàn)，94 例ASD 兒童的葉酸受體α 自身抗體的封閉與ASD 特定的生理和行為特征有關(guān)，有助于進行ASD 的亞型分析。

4.3 其他ASD 患者體內(nèi)存在一定具有特異性的分子或蛋白，可考慮作為早期診斷ASD 的標志物，如γ-氨基丁酸、干擾素γ 和催產(chǎn)素誘導的蛋白16（IFI16）與 SRS 和 CARS 量表得分均明顯相關(guān)，三者可作為評估 ASD 嚴重程度的生物標志物［39］。Qasem等［40］發(fā)現(xiàn)ASD 患者體內(nèi)8-差向前列腺素和半胱氨酰白三烯的濃度較正常人顯著升高，提出二者可作為早期發(fā)現(xiàn)ASD 患者的生物標志物。此外，ASD 兒童的血漿新蝶呤水平增高，新蝶呤水平的檢測可作為 ASD 的輔助診斷，正常不超過 8.5 nmol/L［41］。還有ASD 兒童的血漿脂氧素A4 水平降低，檢測血漿脂氧素A4 也可作為診斷標準，正常兒童不低于81.5 pg/mL［42］。

5 展 望

迄今，ASD 病因與發(fā)病機制仍不明確，而且量表診斷主觀性強，導致ASD 的早期識別、及時診斷以及有效干預相對滯后，故建立一種結(jié)合生物標志物和臨床癥候群為一體的ASD 診斷系統(tǒng)具有重大意義。其中血液采集相對簡單快捷，侵入性和成本效益較低，是作為疾病診斷標志物的最佳來源之一，更適用于臨床大規(guī)模篩查和診斷ASD。然而由于血腦屏障（blood brain barrier，BBB）的存在，從外周血中找到ASD 蛋白標志物仍有一定難度，特別是源自大腦病變的相關(guān)疾病的特異性蛋白標志物。

目前，ASD 的生物學指標變化復雜多樣，不同程度的病情由不同的神經(jīng)系統(tǒng)病變決定，進而有不同的神經(jīng)生化改變，無法確定以哪種生物標志物為主要標準。而APP 及其分解物在ASD 中相對特異，但大部分研究仍存在樣本量小、方法學差異及缺乏跨文化的重復驗證等局限性，使得臨床應(yīng)用受到限制。未來針對ASD 兒童的實驗室檢測，需要全面考慮患兒的年齡、起病經(jīng)過、病情輕重程度以及有無并發(fā)癥等因素進行分層研究，還要在樣本量與標準化上獲取更多支持，以增加檢測結(jié)果的可靠性，進而開發(fā)不同階段的特異性生物標志物。