孔嘯蘭，李 敏，陳作志，張 俊，許友偉，江艷娥

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部外海漁業(yè)開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510300）

竹?魚(yú)（Trachurus japonicus），隸屬于鱸形目（Perciformes），鲹科（Carangidae），竹?魚(yú)屬，因其體呈紡錘形，側(cè)線上均具高而強(qiáng)的棱鱗，形如用竹板編制的組合隆起?，由此得名，主要分布于我國(guó)渤海、黃海、東海、南海，以及日本海域、朝鮮半島海域、西北太平洋溫暖水域，是我國(guó)近海海域燈光圍網(wǎng)和拖網(wǎng)的主要捕撈對(duì)象，南海近海是竹?魚(yú)的主要漁場(chǎng)之一，年捕撈量約為2.5×104t，占全國(guó)總量的68%［1-4］。研究表明，東海及福建海域竹?魚(yú)資源早已衰退，至今難以恢復(fù)［4-7］；南海海域竹?魚(yú)雖然產(chǎn)量仍較為穩(wěn)定，但是也已經(jīng)被充分利用［4，8］。為了進(jìn)一步科學(xué)管理和合理利用南海區(qū)竹?魚(yú)資源，急需開(kāi)展竹?魚(yú)資源評(píng)估及種群遺傳特性的研究。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于竹?魚(yú)遺傳方面的研究主要有SONG等［9］、ZHAO等［10］、張艷麗等［11］、牛素芬等［12］采用線粒體和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）標(biāo)記對(duì)日本海域、北部灣和福建海域竹?魚(yú)遺傳特性的研究，涉及南海海域較少，且未見(jiàn)有關(guān)于竹?魚(yú)微衛(wèi)星標(biāo)記的研究。

微衛(wèi)星分子標(biāo)記是共顯性標(biāo)記，具有多態(tài)性高、變異性強(qiáng)、數(shù)據(jù)易統(tǒng)計(jì)等突出優(yōu)點(diǎn)［13］，被廣泛應(yīng)用于海洋生物遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性分析［14-15］。但是，由于微衛(wèi)星標(biāo)記通用性較差，常常具有極強(qiáng)的種屬特異性。因此，應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記開(kāi)展種群遺傳分析常常需要針對(duì)特定物種開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記。CHANG 等［16］早期采用構(gòu)建（CA）n文庫(kù)的方法開(kāi)發(fā)出10個(gè)竹?魚(yú)微衛(wèi)星標(biāo)記。文庫(kù)構(gòu)建方法開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記工作量大，效率低，難以滿足現(xiàn)今遺傳評(píng)估、圖譜構(gòu)建等需要大批和多樣化的微衛(wèi)星標(biāo)記。

因此，本研究通過(guò)基于酶切位點(diǎn)的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)（restriction-site associated DNA sequence，RAD-seq）開(kāi)發(fā)竹?魚(yú)2、3核苷酸微衛(wèi)星分子標(biāo)記并對(duì)測(cè)試群體進(jìn)行多樣性分析，旨在為竹?魚(yú)種群遺傳評(píng)估提供技術(shù)基礎(chǔ)，以促進(jìn)其種群資源的評(píng)估和管理。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與基因組DNA提取

竹?魚(yú)樣品采集于湛江東部海域（111°30′E、20°18′N(xiāo)），共32尾。剪取背部肌肉樣品加入無(wú)水乙醇保存。每個(gè)樣品剪取少量肌肉組織，使用 “海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒”（北京天根生化科技有限公司）提取基因組DNA，0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量，之后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 高通量測(cè)序與引物合成

使用Hiseq2000高通量測(cè)序儀（Illumina，USA）對(duì)竹?魚(yú)基因組DNA進(jìn)行RAD-seq高通量測(cè)序（測(cè)序服務(wù)由廣州基迪奧生物科技有限公司提供），經(jīng)生物信息學(xué)搜索出微衛(wèi)星位點(diǎn)［17］。使用Premier5.0軟件在重復(fù)單元側(cè)翼序列上選擇性設(shè)計(jì)出89條引物，主要參數(shù)為：GC含量為40% ～60%，引物長(zhǎng)度為18～25 bp，退火溫度為45～60℃，預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度150～350 bp。送上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成引物。

1.3 引物篩選與分型檢測(cè)

選取3個(gè)樣本混合成的基因組DNA為模板，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，對(duì)引物進(jìn)行首輪篩選。PCR反應(yīng)體系為15μL，其中包括10×PCR Buffer 1.5 μL，2.5 mmol·L-1MgCl21.2μL，2 mmol·L-1dNTPs 2μL，正反向引物（10μmol·L-1）各0.8 μL，Taq酶（5 U· μL-1）0.15μL，DNA模版1 μL，加雙蒸水至15μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55～60℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。瓊脂糖電泳檢測(cè)是否能擴(kuò)增出穩(wěn)定且均一目的片段。之后分別選取8尾個(gè)體的基因組DNA作為模板，對(duì)瓊脂糖電泳有穩(wěn)定且均一目的條帶的引物PCR擴(kuò)增后聚丙烯酰胺凝膠電泳和硝酸銀染色檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性。

多態(tài)且條帶清晰的引物使用三引物法［18］，利用M13熒光接頭引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并送華大基因公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳分型檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為15μL，其中包括10×PCR Buffer 1.5μL，2.5 mmol· L-1MgCl21.2μL，2 mmol· L-1dNTPs 2μL，M13正向引物（10μmol·L-1）0.2 μL，M13反向引物（10μmol·L-1）0.6μL，M13通用熒光引物（10μmol·L-1）0.5μL，Taq酶（5 U·μL-1）0.15μL，DNA模版1μL，加雙蒸水至15μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55～60℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；94℃變性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸45 s，8個(gè)循環(huán)；72℃延伸30 min。

1.4 群體遺傳學(xué)評(píng)價(jià)

使用32尾竹?魚(yú)個(gè)體的基因組DNA為模板，對(duì)通過(guò)篩選的微衛(wèi)星標(biāo)記的種群遺傳學(xué)特征進(jìn)行評(píng)價(jià)。PCR反應(yīng)體系和條件、等位基因分型方法如上。使用軟件Genepop4.0［19］對(duì)每個(gè)標(biāo)記的種群遺傳學(xué)特征值進(jìn)行計(jì)算，包括等位基因數(shù)（Na）、表觀雜合度（Ho）和期望雜合度（He），進(jìn)行“哈迪-溫伯格平衡” 檢驗(yàn)和連鎖不平衡檢測(cè)，并對(duì)P值進(jìn)行Bonferroni校正。使用Cervus3.0.7［20］軟件計(jì)算多態(tài)信息含量（PIC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測(cè)序結(jié)果與微衛(wèi)星位點(diǎn)分析

RAD-seq高通量測(cè)序共獲得竹?魚(yú)基因組原始數(shù)據(jù)1.26 G，GC含量為45.79%，Q20為95.33%，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果質(zhì)量較好，可用于后續(xù)分析。搜索后共獲得微衛(wèi)星序列19 920條，2～6核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星位點(diǎn)21 912個(gè)，其中2核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星位點(diǎn)最多，有12 478個(gè)，占總數(shù)的56.95%，具體見(jiàn)表1。說(shuō)明2核苷酸重復(fù)為主要的微衛(wèi)星重復(fù)類(lèi)型，其次為3核苷酸重復(fù)。

2.2 PCR引物設(shè)計(jì)和篩選

選取89條2、3核苷酸重復(fù)序列設(shè)計(jì)引物，其中2核苷酸重復(fù)為66條，3核苷酸重復(fù)為23條。經(jīng)過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選后，共有27對(duì)引物通過(guò)篩選（表2），27對(duì)引物擴(kuò)增的序列中21個(gè)位點(diǎn)為2核苷酸重復(fù)，重復(fù)次數(shù)為10～13次；6個(gè)位點(diǎn)為3核苷酸重復(fù)，重復(fù)次數(shù)為7～9次。

表1 竹?魚(yú)基因組中不同類(lèi)型SSR統(tǒng)計(jì)Tab.1 Different types of SSR statistics in T.japonicus genome

2.3 微衛(wèi)星標(biāo)記的種群遺傳學(xué)評(píng)價(jià)

使用采集于湛江東部海域的竹?魚(yú)群體對(duì)篩選合格的微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行種群遺傳學(xué)評(píng)價(jià)。如表3，所有27個(gè)標(biāo)記在測(cè)試群體中共檢測(cè)到265個(gè)等位基因，等位基因數(shù)分布范圍為3～19，表觀雜合度分布范圍為0.344～0.938，平均為0.654；期望雜合度分布范圍為0.336～0.880，平均為0.729。多態(tài)信息含量（PIC）分布范圍為0.318～0.882，平均為0.707，表明開(kāi)發(fā)的微衛(wèi)星位點(diǎn)具有較高的雜合度。除2個(gè)標(biāo)記外，其他標(biāo)記等位基因頻率均符合“哈迪-溫伯格”平衡（HWE）。連鎖不平衡檢測(cè)表明各位點(diǎn)間無(wú)連鎖不平衡現(xiàn)象。

3 討論

3.1 高通量測(cè)序發(fā)掘微衛(wèi)星序列的技術(shù)優(yōu)勢(shì)

傳統(tǒng)微衛(wèi)星標(biāo)記開(kāi)發(fā)方法耗時(shí)長(zhǎng)、花費(fèi)高、技術(shù)難度大。以磁珠富集法為例，標(biāo)記開(kāi)發(fā)過(guò)程中基因組DNA濃度、接頭連接效率、富集過(guò)程中的雜交溫度以及洗脫條件的控制等因素都會(huì)影響微衛(wèi)星篩選的效率［21-22］，且最終獲得的有效微衛(wèi)星序列僅幾百條［23-24］。相比較而言，高通量測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記，省略了建庫(kù)、克隆、篩選等，只需提取基因組DNA測(cè)序，利用生物信息學(xué)手段可直接獲取微衛(wèi)星序列，通常是傳統(tǒng)方法獲得微衛(wèi)星序列數(shù)目的幾百倍［25-27］，具有高效、便捷、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，能夠滿足于短時(shí)間內(nèi)大批量微衛(wèi)星位點(diǎn)的開(kāi)發(fā)需求，比如連鎖圖譜構(gòu)建、數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus，QTL）定位等［28-29］。同時(shí)，傳統(tǒng)的微衛(wèi)星開(kāi)發(fā)方法獲得的微衛(wèi)星重復(fù)類(lèi)型基本為2核苷酸重復(fù)，而高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，更加方便了研究者獲得3、4甚至更多核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星引物［26］?？梢?jiàn)，高通量測(cè)序技術(shù)較傳統(tǒng)微衛(wèi)星開(kāi)發(fā)的方法更為快速、高效。

本次RAD-seq高通量測(cè)序共獲得竹?魚(yú)基因組原始數(shù)據(jù)1.26 G，GC含量45.79%，測(cè)序質(zhì)量Q20為95.33%；共獲得微衛(wèi)星序列19 920條。說(shuō)明測(cè)序質(zhì)量穩(wěn)定高效，并獲得了數(shù)量龐大、類(lèi)型豐富的微衛(wèi)星序列，可用于后續(xù)竹?魚(yú)微衛(wèi)星標(biāo)記大規(guī)模開(kāi)發(fā)和相關(guān)遺傳學(xué)研究。

3.2 不同核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星位點(diǎn)比較

本次高通量測(cè)序結(jié)果表明在竹?魚(yú)微衛(wèi)星位點(diǎn)中2核苷酸重復(fù)為主要重復(fù)類(lèi)型，其中AC/TG類(lèi)重復(fù)數(shù)量最為豐富，占41.6%，GC/CG類(lèi)重復(fù)較為少見(jiàn)。此結(jié)果與其他水產(chǎn)動(dòng)物微衛(wèi)星位點(diǎn)研究結(jié)果相一致［30-32］。例如，熊良偉等［31］對(duì)中華鳑鲏（Rhodeus sinensis）微衛(wèi)星的分析中，2核苷酸占總微衛(wèi)星位點(diǎn)的53.59%，2核苷酸重復(fù)中AC/TG類(lèi)占60.63%；GC/CG類(lèi)僅占0.32%。在裸體異鰾鰍鮀（Xenophysogobio nudicorpa）中［30］，2核苷酸重復(fù)占總微衛(wèi)星位點(diǎn)比例高達(dá)83.15%，AC/GT類(lèi)重復(fù)占49.36%，GC/CG類(lèi)重復(fù)僅有4個(gè)。

盡管研究表明開(kāi)發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記以2核苷酸重復(fù)為主，仍有學(xué)者對(duì)3、4核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星標(biāo)記感興趣。對(duì)人類(lèi)基因組的研究中發(fā)現(xiàn)，3核苷酸重復(fù)序列與遺傳疾病的發(fā)生有關(guān)，并且具有較高的多態(tài)性和遺傳穩(wěn)定性［33］。在對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物3、4核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選中，部分學(xué)者的研究結(jié)果存在差異。例如，房祖業(yè)等［26］對(duì)大刺鰍（Mastacembelus armatus）2、3、4核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選發(fā)現(xiàn)，2核苷酸重復(fù)較3、4核苷酸重復(fù)具有更高的篩選效率和多態(tài)性；而魯翠云等［34］、譚照君等［35］和李文升等［36］的研究認(rèn)為3、4核苷酸具有更高的多態(tài)性和分型效果。本文考慮高通量測(cè)序結(jié)果中2、3核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)已占82%，因此，僅選取2、3核苷酸重復(fù)位點(diǎn)進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示，2、3核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性差異并不明顯。

表2 27對(duì)竹?魚(yú)微衛(wèi)星引物信息Tab.2 Information of 27 pairs of primers in T.japonicus

表3 竹?魚(yú)微衛(wèi)星標(biāo)記的種群遺傳學(xué)特征Tab.3 Characteristics of microsatellite loci in T.japonicus

3.3 微衛(wèi)星標(biāo)記的種群遺傳學(xué)特征

ELLEGREN［37］提出真核生物微衛(wèi)星位點(diǎn)重復(fù)大部分在30次以下，2核苷酸重復(fù)以15～19次為主?；赪EBER［38］的研究結(jié)果，重復(fù)次數(shù)高的微衛(wèi)星在種群中表現(xiàn)出的多態(tài)性較高。龔小玲等［39］對(duì)澳洲鰻鱺（Anguilla australis）進(jìn)行標(biāo)記開(kāi)發(fā)時(shí)發(fā)現(xiàn)，微衛(wèi)星重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)過(guò)高會(huì)影響PCR效果，選擇居中的重復(fù)次數(shù)為宜。因此，本研究選擇重復(fù)次數(shù)較為適中的位點(diǎn)，分別為2核苷酸重復(fù)10～15次、3核苷酸重復(fù)7～9次。

群體雜合度的高低反映了群體在多個(gè)基因座上的遺傳變異及群體遺傳多樣性豐富度［36］。本研究中竹?魚(yú)群體的平均表觀雜合度為0.654，平均期望雜合度為0.729，說(shuō)明該群體的遺傳多樣性較高。平均表觀雜合度和期望雜合度存在差異，說(shuō)明存在雜合子缺失或者純合子過(guò)剩的情況。多態(tài)信息含量（PIC）也是衡量群體遺傳多樣性的重要指數(shù)，研究者BOTSTEIN等［40］認(rèn)為當(dāng)基因標(biāo)記PIC＞0.5時(shí)，為高度多態(tài)位點(diǎn)；當(dāng)0.25＜PIC＜0.5時(shí)，為中度多態(tài)位點(diǎn)；當(dāng)PIC＜0.25時(shí)，為低度多態(tài)性位點(diǎn)，通常不作為遺傳多樣性分析。本文中竹?魚(yú)位點(diǎn)有5個(gè)為中度多態(tài)位點(diǎn)，其他均為高度多態(tài)位點(diǎn)。表明開(kāi)發(fā)所得的竹?魚(yú)微衛(wèi)星標(biāo)記在該群體中具有較好的遺傳穩(wěn)定性和豐富的遺傳多樣性。

在所有27個(gè)位點(diǎn)中有2個(gè)位點(diǎn)偏離了 “哈迪-溫伯格”平衡（HWE），近親雜交、無(wú)效等位基因、種群退化和自然選擇等因素皆可能導(dǎo)致微衛(wèi)星位點(diǎn)偏離HWE［25］。另外，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，樣本量小于25時(shí)，對(duì)平均等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)及表觀雜合度具有較明顯的影響［41］。本研究中，有效樣本量≥28，表明位點(diǎn)的多樣性參數(shù)結(jié)果較為可靠。