鄭劉芳

茶樹是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，我國具有悠久的茶樹種植和利用歷史，我國也是世界上最先發(fā)現(xiàn)和利用茶樹的國家。作為一種多年生異花授粉植物，經(jīng)過長期的自然選擇，茶樹具有豐富多樣的遺傳特性。SSR標(biāo)記技術(shù)具有數(shù)量多、共顯性、多態(tài)性好、引物通用性高、重復(fù)性好、操作程序簡單等優(yōu)點(diǎn)。目前在多種植物的研究上，SSR標(biāo)記技術(shù)已被廣泛應(yīng)用。本次利用SSR標(biāo)記技術(shù)和4300 DNA分析系統(tǒng)，更快速，準(zhǔn)確地完成了實(shí)驗(yàn)。

一、材料和方法

1.1材料

23個(gè)茶樹品種，包括10個(gè)安徽黃山茶區(qū)的，3個(gè)安徽江南丘陵茶區(qū)的，5個(gè)安徽大別山茶區(qū)的，3個(gè)福建地區(qū)的、1個(gè)云南地區(qū)的和1個(gè)日本數(shù)蓓種，取這23個(gè)茶樹品種的一芽二葉新梢，將采集的樣品儲(chǔ)藏于-80℃冰箱，備用。

1.2方法

1.2.1DNA的提取與SSR引物合成 采用改良的CTAB法提取DNA，凝膠電泳法觀察DNA的完整度，根據(jù)4300 DNA分析系統(tǒng)的檢測原理，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過4300 DNA分析系統(tǒng)進(jìn)行成像檢測。

1.2.2 23個(gè)茶樹品種的遺傳多樣性分析

（1）基于4300 DNA 分析系統(tǒng)的SSR-PCR擴(kuò)增

首先以23個(gè)茶樹樣品的等量混合液為模板、10μl初始體系對gSSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 電泳后有擴(kuò)增條帶的，再以優(yōu)化的體系對混合模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增;再分別擴(kuò)增所有23個(gè)樣品，電泳后統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

根據(jù)4300DNA分析系統(tǒng)使用手冊，優(yōu)化后的PCR擴(kuò)增體系：1.0 μl DNA（25 ng·μl-1），0.2 μlM13F-F、0.2 μl R 和0.4 μl IR-M13F，0.8 μl dNTPs（25mmol·L-1），1.0 μl 10× Buffer （含Mg2+），0.1 μl Ex-Taq聚合酶（5U·μl-1），6.3 μl無菌水定容至10 μl。所有引物濃度均為1μmol·L-1。

然后均如下程序擴(kuò)增：95℃預(yù)變性3 min;94℃變性45s，50～60℃（因引物而定）退火1.0 min ，72℃ 延伸45s， 10個(gè)循環(huán);再進(jìn)行 94℃變性30 s，51℃ 退火45s，72℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min，4 ℃保存。

（2）變性聚丙烯酰胺凝膠比較與PCR產(chǎn)物電泳檢測

配制acry：bis為29：1，濃度為6.5%的變性聚丙烯酰胺凝膠。在PCR-SSR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入5 μl 2×DNA Loading buffer，混勻離心，94 ℃變性5 min，然后取0.3 μl在4300 DNA自動(dòng)分析儀上進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。電泳條件：電壓1 500 V，電流40MA，功率40 W。

1.2.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果，采用人工讀帶方法統(tǒng)計(jì)條帶。在電泳圖上清晰的條帶記為“1”，沒有條帶或者有模糊條帶的記為“0”，建立原始數(shù)據(jù)分析，制作Excel表格，生成“0，1”數(shù)據(jù)矩陣。根據(jù)PIC=1-∑Pi2計(jì)算SSR 位點(diǎn)的多態(tài)性信息量

采用PopGen 1.32計(jì)算不同引物的平均期望雜合度He;平均觀測雜合度Ho，以及Nei基因多樣性（H）、Shannon信息指數(shù)I。使用NTSYSpc-2.10軟件系統(tǒng)對供試品種進(jìn)行聚類，構(gòu)建樹狀聚類圖。

二、結(jié)果與分析

2.1 茶樹基因組DNA提取及檢測

采用改良的CTAB法，成功地從供試茶樹鮮葉樣品中提取了基因組DNA。23個(gè)茶樹基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示提取的茶樹基因組DNA條帶清晰明亮，沒有降解，沒有彌散， DNA的完整性較好，沒有RNA和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的污染，符合SSR-PCR的要求。

2.2gSSR的多態(tài)性分析

利用23個(gè)茶葉品種，對8個(gè)gSSR進(jìn)行多態(tài)性分析，共檢測到32個(gè)等位基因，61個(gè)基因型 。平均每對引物能夠檢測到4.0個(gè)等位基因，最多6個(gè)，最少2個(gè);平均每對引物能夠檢測到6.4個(gè)基因型，最多11個(gè)，最少2個(gè)。供試材料的多態(tài)性信息量（PIC）變化范圍較大，其中引物的PIC最小為0.1190，PIC最大的為0.7209（引物TGS21），平均值為0.4994。

2.3 供試茶樹品種遺傳多樣性分析

依據(jù)材料的來源可以將供試的23份茶樹品種分為六個(gè)種群，采用8個(gè)gSSR標(biāo)記進(jìn)行群體間遺傳多樣性研究。結(jié)果表明Nei在0.1271（G228）-0.7543（TGS21）變動(dòng)，平均值為0.5829。Nei值表示在被檢測位點(diǎn)上群體中雜合子的頻率，是群體雜合程度的度量單位。Nei值越大，反映該群體的遺傳變異越多，群體的遺傳多樣性越高 。

群體的觀測雜合度Ho在0.0455（G227）-0.8696（TGS25）之間，平均值為0.4887。期望雜合度He在0.1300（G228）-0.7731（TGS42）之間，平均值為0.5546。Shannon信息指數(shù)（I）為0.2489（G228）-1.4901（TGS42），平均值為1.0295。結(jié)果說明供試的茶樹資源擁有較高的遺傳多樣性。

2.4 23個(gè)茶樹樣品的聚類分析

使用NTSYSpc-2.10軟件對供試品種進(jìn)行UPGMA聚類分析，繪制樹狀聚類分析圖。根據(jù)32個(gè)等位基因相似性矩陣的UPGMA聚類分析表明，在遺傳相似系數(shù)為0.65時(shí)，可以把23個(gè)供試品系（種）分為四個(gè)大類，第Ⅰ類與第Ⅱ類分別僅包括云抗10號(hào)和豬耳種;第Ⅲ類包括黃山種、楊樹林種、鐵觀音、福鼎大白茶;第Ⅳ類包括余下的17個(gè)品系（種）。當(dāng)以遺傳相似系數(shù)為0.67為閾值時(shí)，又可將第Ⅳ類劃分為三個(gè)亞類，第一亞類包括舒茶早、仙寓早、黃觀音、祁門櫧葉種和安徽1號(hào)，第二亞類僅為橫脈種，其余11個(gè)品系（種）聚為一類，其中茗洲種與日本數(shù)蓓種的遺傳相似系數(shù)較高，達(dá)到了0.78。聚類結(jié)果說明，安徽地區(qū)的主要茶樹栽培品種與福建地區(qū)的茶樹品種親緣關(guān)系較近，與云南地區(qū)的茶樹品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，符合品種演化規(guī)律。

三、結(jié)論

（1）茶樹鮮葉基因組DNA的提取在黃建安方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)，成功的從供試的23份茶樹鮮葉樣品中提取了高質(zhì)量的基因組DNA。

（2）建立了基于4300 DNA遺傳分析系統(tǒng)的SSR-PCR反應(yīng)體系，且可以以自行配制的聚丙烯酰胺凝膠溶液替代該系統(tǒng)指定用膠。

（3）對8個(gè)gSSR進(jìn)行多態(tài)性分析，共檢測出32個(gè)等位位點(diǎn)和61種基因型;SSR具有豐富的位點(diǎn)多態(tài)性。

（4）在遺傳相似系數(shù)為0.65時(shí)，可以把23個(gè)供試品系（種）分為四個(gè)大類，第一類與第二類分別僅包括云抗10號(hào)和豬耳種;第三類包括黃山種、楊樹林種、鐵觀音、福鼎大白茶;第四類包括余下的17個(gè)品系（種）。