陳雪純，郭夢雅，邵曉雯，黃佳寧，張寧，李詠梅

1 天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)系，天津300070；2 天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系

肝細(xì)胞肝癌（HCC）是當(dāng)今世界上最為常見的惡性腫瘤之一，我國每年有38.3 萬人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人數(shù)的50%以上［1］。男性肝癌發(fā)病率高于女性肝癌發(fā)病率，居腫瘤總發(fā)病率的第四位，致死率居于惡性腫瘤死亡率第三位，總生存率僅為36.9%。如何阻止早期HCC 患者術(shù)后復(fù)發(fā)及腫瘤肝內(nèi)播散，或使無法手術(shù)切除的晚期HCC 患者腫瘤控制在局部以實現(xiàn)帶瘤生存，是目前國內(nèi)外研究的熱點［2］。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是指長度超過200 個核苷酸的RNA 分子，其上沒有編碼蛋白的閱讀框［3］。雖然lncRNAs 不能編碼蛋白質(zhì)，但在不同組織和發(fā)育階段lncRNAs 的表達(dá)具有特異性，說明lncRNAs 具有重要生物學(xué)意義。越來越多的研究［4］表明，lncRNAs 通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)重構(gòu)、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平基因表達(dá)等機制，在細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等方面發(fā)揮著重要作用。我們前期研究中通過分析癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫中HCC 臨床樣本發(fā)現(xiàn)，位于8 號染色體上的一條lncRNA AC090809在HCC 組織中低表達(dá)，AC090809 高表達(dá)的HCC 患者的生存時間要遠(yuǎn)長于低表達(dá)AC090809 的HCC 患者，表明AC090809 高表達(dá)水平可能與患者預(yù)后良好相關(guān)聯(lián)，提示AC090809 可能與HCC 發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但AC090809 生物學(xué)功能未見報道。2019年10月—2020年12月，本研究觀察了lncRNA AC090809在不同轉(zhuǎn)移能力的人肝癌細(xì)胞系Huh7、MHCC97L、HCCLM3中的表達(dá)及對Huh7增殖凋亡的調(diào)控作用，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑 人肝癌細(xì)胞系Huh7細(xì)胞購自日本研究生物資源收集細(xì)胞庫，MHCC97L 和HCCLM3細(xì)胞來源于復(fù)旦大學(xué)湯釗猷院士實驗室。Trans 1-T1感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。DMEM 培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清，Opti-MEM 均購自于美國Gibco公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、細(xì)胞凋亡FITC-Annexin V and PI Apoptosis、反轉(zhuǎn)錄ueIris II RT-PCR System for First-Strand cDNA Synthesis、實時熒光定量AugeGreenTM qPCR Master Mix等試劑盒均購自蘇州宇恒生物科技有限公司；TRIzol購自美國In?vitrogen 公司；引物合成、shRNA所用表達(dá)質(zhì)粒載體合成自蘇州金唯智生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）購自以色列Biological Industries公司。

1.2 不同轉(zhuǎn)移能力的人肝癌細(xì)胞系Huh7、MHCC97L、HCCLM3 中AC090809 檢測 人肝癌細(xì)胞系Huh7、MHCC97L、HCCLM3 均使用含10%血清的DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2條件下在恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%～95%時，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS 沖洗2～3 次，加入TRIzol 裂解液1 mL，轉(zhuǎn)移至1.5 mL去酶去菌的EP管中，室溫靜置2～5 min，加入氯仿后用力渦旋震蕩15 s，待其充分乳化至溶液呈乳白色，室溫靜置2 min，4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min，吸取上層水相于新的去酶去菌1.5 mL EP 管中，加入相同體積的異丙醇，將1.5 mL EP 管上下顛倒混勻5 次，室溫靜置10 min，4 ℃條件下12 000 r/min 離心10 min，棄上清，管底沉淀即為RNA。去提取的RNA 加入75%乙醇洗2次，4 ℃條件下7 500 r/min 離心5 min，吸棄上清，沉淀于超凈工作臺內(nèi)室溫干燥2～5 min，加入20 μL用DEPC 處理 過的水溶 解RNA，取1 μL RNA 用Nanodrop測量濃度及RNA純度。取1μg模板RNA、4 μL ueIris ⅡRT MasterMix（5×）、1 μL dsDNase 于新的EP 管中，將RNase-free water 加至20μL。將以上體系輕輕混勻，瞬時離心后，在PCR 儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：37 ℃孵育2 min，55 ℃孵育10 min，85 ℃孵育10 s。，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 濃度進(jìn)行計算，按照說明書的比例將PCR 試劑與cDNA 加入新的EP 管中混勻，上機進(jìn)行實時熒光定量PCR 檢測。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，60 ℃，30 s，72 ℃、2min，35 個循環(huán)，72 ℃、10min。引物序列如下：AC090809 上 游 引 物 為5′-CGGCATCACG?CATTCGAATTTA-3′，游引物為5′-AGTGCCACAC?CATCAACAGT-3′，內(nèi)參18s-rRNA 上游引物為5′-GCTTAATTTGACTCAACACGGGA-3′，下游引物為5′-AGCTATCAATCTGTCAATCCTGTC-3′。 采 用2－ΔΔCT法計算AC090809 mRNA相對表達(dá)量。

1.3 Huh7 細(xì)胞的AC090809 降表達(dá)shRNA 轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖、凋亡情況觀察

1.3.1 Huh7 細(xì) 胞 的AC090809 降 表 達(dá)shRNA 轉(zhuǎn)染、分組及驗證 在細(xì)胞室超凈臺內(nèi)用EP管配制以下轉(zhuǎn)染體系：Opti-MEM 低血清培養(yǎng)基250 μL、目的質(zhì)粒（AC090809 降表達(dá)質(zhì)粒sh-AC090809 或?qū)φ召|(zhì)粒sh-NC）5μL、轉(zhuǎn)染試劑15μL。輕柔混勻后，室溫靜置20 min。將以上體系緩慢滴加到細(xì)胞密度70%～90%的Huh7 細(xì)胞中，上下左右搖晃混勻培養(yǎng)液與轉(zhuǎn)染體系，放入37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)6 h后，分別補加3 mL DMEM 培養(yǎng)液，待細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后，將6 孔板中的細(xì)胞進(jìn)行消化，加入含3 μg/mL 嘌呤霉素的DMEM 培養(yǎng)液重懸，傳代至10 cm 培養(yǎng)皿中。至未轉(zhuǎn)染的空白對照細(xì)胞全部死亡時停止藥物篩選，并使用1.5μg/mL 含嘌呤霉素的DMEM 培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。其中，轉(zhuǎn)染AC090809降表達(dá)質(zhì)粒sh-AC090809 的Huh7 細(xì)胞記為降表達(dá)組，轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒sh-NC 的Huh7 細(xì)胞記為對照組，參照“1.2”方法檢測轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞中AC090809的相對表達(dá)量。

1.3.2 轉(zhuǎn)染后兩組Huh7細(xì)胞增殖能力觀察 采用CCK-8 實驗。分別取100 μL 兩組細(xì)胞懸液至96 孔板中，每孔接種1 000 個細(xì)胞。將培養(yǎng)板在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h，向每孔加入100 μL CCK-8 溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24、48、72 h后，用酶標(biāo)儀測定在450 nm 處各個孔的OD 值，以O(shè)D值代表細(xì)胞增殖能力。

1.3.3 轉(zhuǎn)染后兩組Huh7細(xì)胞凋亡情況觀察 使用流式細(xì)胞儀。取2 組細(xì)胞接種于24 孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時，PBS 輕柔沖洗兩遍，加入37 ℃的胰酶消化1 min，加入含10%血清的培養(yǎng)基終止消化，室溫1 000 r/min 離心3 min，冰PBS 緩沖液洗兩遍，加入1×Annexin V 結(jié)合緩沖液100 μL 將細(xì)胞重懸，然后每管加入FITC -Annexin V、PI 各5 μL，輕輕混合均勻，室溫避光靜置30 min，每管加入200 μL 的1×Annexin V 結(jié)合緩沖液，混合均勻上機，用流式細(xì)胞儀檢測兩組細(xì)胞早期凋亡數(shù)、晚期凋亡數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，三組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用student-t檢驗。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Huh7、MHCC97L、HCCLM3 細(xì)胞中AC090809相對表達(dá)量比較 Huh7、MHCC97L、HCCLM3 細(xì)胞中AC090809 的相對表達(dá)量分別為0.96 ± 0.08、0.08 ± 0.04、0.03 ± 0.01，兩兩比較，P均<0.05，提示不同轉(zhuǎn)移能力的HCC 細(xì)胞中AC090809 相對表達(dá)量不同，且AC090809在Huh7細(xì)胞中表達(dá)量最低。

2.2 轉(zhuǎn)染后兩組Huh7 細(xì)胞中AC090809 相對表達(dá)量比較 降表達(dá)組Huh7細(xì)胞中AC090809相對表達(dá)量為0.16±0.03，對照組為1.01±0.07，兩組相比，P<0.05，提示降表達(dá)AC090809的Huh7細(xì)胞模型成功建立。

2.3 轉(zhuǎn)染后兩組Huh7細(xì)胞增殖能力比較 降表達(dá)組培養(yǎng)24、48、72 h 時的OD 值分別為2.31 ± 0.08、4.18 ± 0.09、8.22 ± 0.07，對照組培養(yǎng)24、48、72 h時的OD 值分別為2.10±0.06、2.64±0.08、6.62±0.20，兩組相比，P均<0.05。

2.4 轉(zhuǎn)染后兩組Huh7細(xì)胞凋亡情況比較 降表達(dá)組細(xì)胞早期凋亡數(shù)、晚期凋亡數(shù)分別為（222.72 ±11.61）個、（111.63±13.34）個，對照組細(xì)胞早期凋亡數(shù)、晚期凋亡數(shù)分別為（814.35 ± 11.96）個、（324.51±24.82）個，兩組相比，P均<0.05。

3 討論

HCC 在我國一直以來都是重要健康問題，中國肝癌病例數(shù)占全世界總數(shù)的55%。肝癌目前主要以手術(shù)切除、微創(chuàng)手術(shù)、介入手術(shù)［6］、局部放療［7］等為主要治療手段。盡管近年來HCC診斷方法和手術(shù)技術(shù)已得到顯著改善，但是晚期HCC 患者的5年生存率仍然很低，此現(xiàn)象的主要原因是HCC 具有高轉(zhuǎn)移能力和高復(fù)發(fā)率［8］。因此，為了提高HCC特別是晚期轉(zhuǎn)移性HCC的臨床治療效果，深入研究闡明HCC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的分子機制具有非常重要意義。

lncRNAs 是一類不具有編碼蛋白能力的長鏈非編碼RNA，起初被人們認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄的噪聲［9］。隨著科學(xué)發(fā)展，人們逐漸發(fā)現(xiàn)lncRNAs 即便不能編碼蛋白，但是它可以通過與蛋白、mRNA 之間的相互作用，影響轉(zhuǎn)錄、翻譯等生物學(xué)行為［10］。并且lncRNAs也存在于人類各種腫瘤中，在腫瘤中可以作為分子支架、分子誘餌、分子向?qū)グl(fā)揮功能，在一定程度上影響腫瘤的增殖或遷移［11-16］。目前研究較為明確的lncRNAs 尚不多［17］，仍有大量lncRNAs 值得我們繼續(xù)深入研究。

本研究中的lncRNA AC090809 是一條位于8 號染色體、長度為61 602 bp 且不具備蛋白編碼能力的非編碼RNA。本實驗室前期分析了TCGA 公共數(shù)據(jù)庫中HCC 患者AC090809 表達(dá)量情況與患者生存狀況與生存時間，結(jié)果顯示AC090809 基因高表達(dá)的肝癌患者的生存時間比AC090809 基因低表達(dá)的HCC 患者生存時間長，表明高表達(dá)AC090809 與患者的良好預(yù)后相關(guān)聯(lián)。TCGA 數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果提示我們，lncRNA AC090809 的表達(dá)可能與HCC 的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。MHCC97L 與HCCLM3 是兩株具有相同遺傳背景、高轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞株，且HC?CLM3 的轉(zhuǎn)移潛能更高，肺轉(zhuǎn)移率為100%［18］。Huh7是一株來源于52 歲日本男性高分化肝癌細(xì)胞株［19］，其轉(zhuǎn)移能力遠(yuǎn)低于MHCC97L 與HCCLM3 細(xì)胞［20］。因此為了驗證我們的猜想，在轉(zhuǎn)移能力依次增強的人 肝 癌 細(xì) 胞 系Huh7、MHCC97L、HCCLM3 中 對AC090809 的表達(dá)量進(jìn)行實時熒光定量PCR 實驗檢測，實驗結(jié)果顯示低轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株Huh7細(xì)胞中AC090809 的表達(dá)水平明顯高于高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞株MHCC97L 與HCCLM3 細(xì)胞，這提示AC090809 可能與HCC 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。因AC090808 在Huh7 細(xì)胞中表達(dá)量最高，所以我們選擇在Huh7 細(xì)胞中降表達(dá)AC090809 檢測AC090809對HCC 增殖能力的影響。接下來我們利用shRNA轉(zhuǎn)染Huh7 細(xì)胞，經(jīng)抗生素篩選獲得穩(wěn)定降表達(dá)AC090809 的Huh7 細(xì)胞。我們利用穩(wěn)轉(zhuǎn)的Huh7 細(xì)胞進(jìn)行了CCK-8 實驗，CCK-8 結(jié)果顯示降表達(dá)AC090809 對細(xì)胞的增殖具有明顯的促進(jìn)作用。最后我們用流式細(xì)胞儀檢測了FITC-Annexin 與PI 染色的細(xì)胞。Annexin V 選擇性結(jié)合磷酯酰絲氨酸（PS），細(xì)胞發(fā)生早期凋亡時，PS 會外翻到細(xì)胞表面，用綠色熒光探針FITC 標(biāo)記的Annexin V 可以結(jié)合外翻的PS。PI是一種DNA結(jié)合染料，常用來染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性細(xì)胞中的細(xì)胞核。PI經(jīng)488、532或546 nm的激光激發(fā)后呈現(xiàn)紅色熒光。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與對照組細(xì)胞相比，降表達(dá)組細(xì)胞的早期凋亡與晚期凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯減少。因此，通過CCK-8 實驗和凋亡實驗的檢測我們發(fā)現(xiàn)，降表達(dá)AC090809 可以明顯促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡，以上結(jié)果說明AC090809對HCC細(xì)胞增殖具有一定抑制作用。

綜上所述，AC090809 在轉(zhuǎn)移能力最低的Huh7細(xì)胞中表達(dá)量最高，并且在HCC 細(xì)胞中降表達(dá)AC090809會促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡。本研究展示了一個與HCC 細(xì)胞增殖相關(guān)的新的lncRNA，為HCC患者的早期診斷與治療提供了新的靶點。