賈王強(qiáng) 倪紅諺 袁龍

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（鄭州450008）

癌癥在全世界的病死率和發(fā)病率仍然居高不下，每年新增患者1 810 萬(wàn)例，僅2018年因癌癥死亡人數(shù)達(dá)960 萬(wàn)［1］。目前癌癥治療方法主要包括手術(shù)、化療、放療、免疫治療以及它們的組合療法，而免疫治療被學(xué)術(shù)界廣泛認(rèn)為是治療各種癌癥最重要的研究成果之一［2］。腫瘤特異性T 細(xì)胞在腫瘤進(jìn)展期間獲得的多種抑制性受體的表達(dá)可導(dǎo)致其功能失調(diào)，而免疫治療作用于這些抑制性受體以逆轉(zhuǎn)其功能失調(diào)，并阻斷抗腫瘤免疫反應(yīng)中抑制T 細(xì)胞的途徑，重新激活腫瘤特異性T細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)以促進(jìn)腫瘤消除［3］。免疫檢查點(diǎn)（immune checkpoint）是負(fù)向調(diào)節(jié)T 細(xì)胞功能的抑制信號(hào)分子，能夠抑制細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（CTL）在腫瘤中殺傷癌細(xì)胞的能力［2，4］。盡管免疫檢查點(diǎn)治療在臨床中取得了重大突破，但腫瘤內(nèi)在抗性導(dǎo)致在實(shí)體腫瘤中大量使用免疫檢查點(diǎn)抑制劑的反應(yīng)率很低［2，5］。為了讓更多患者從免疫治療中受益，免疫治療的重點(diǎn)已轉(zhuǎn)向針對(duì)腫瘤微環(huán)境中的新型替代免疫檢查點(diǎn)［6］，例如淋巴細(xì)胞活化基因-3（LAG-3）及其配體纖維介素蛋白-1（fibrinogen like protein 1，F(xiàn)GL-1）等。

LAG3 是一種免疫檢查點(diǎn)受體蛋白，主要表達(dá)在活化的T 淋巴細(xì)胞上［7］。研究表明，主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ類（MHC-Ⅱ）作為L(zhǎng)AG-3的經(jīng)典配體，LAG-3 與MHC-Ⅱ分子的結(jié)合可以下調(diào)T 細(xì)胞的活性。然而，MHC-Ⅱ是否僅對(duì)LAG-3 有抑制功能仍是不清楚的。同時(shí)，LAG-3 也可增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Tregs）的抑制活性，通過(guò)治療性抗體抑制LAG-3，可解除LAG-3 對(duì)T 細(xì)胞的抑制作用，增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答［8-9］。纖維介素蛋白-1 是一種肝細(xì)胞分泌蛋白，屬于纖維蛋白原家族。在正常生理?xiàng)l件下，F(xiàn)GL-1蛋白主要由肝細(xì)胞分泌并促進(jìn)其有絲分裂和代謝功能［10-11］。最近有研究顯示FGL-1 是LAG-3的一個(gè)重要的功能性配體，并揭示了LAG-3-FGL-1通路在腫瘤免疫中的作用［12］。FGL-1 作為L(zhǎng)AG-3的配體，其在體外和體內(nèi)以受體-配體相互依賴的方式發(fā)揮其對(duì)T 細(xì)胞的抑制功能。阻斷FGL-1-LAG-3 相互作用可以刺激腫瘤微環(huán)境中T 細(xì)胞的活化和增殖以提高機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫與清除能力。癌癥患者血漿中FGL-1升高與預(yù)后不良和免疫治療效果有關(guān)［13］。雖然有一些研究對(duì)LAG-3 腫瘤免疫中的作用進(jìn)行了研究，但對(duì)于LAG-3-FGL-1通路在腫瘤免疫中的作用及可能的機(jī)制相關(guān)研究較少。本文旨在總結(jié)腫瘤患者與FGL-1 的關(guān)系，以及總結(jié)FGL-1 蛋白的生物學(xué)特征，揭示其可能的免疫學(xué)機(jī)制，期望能為腫瘤免疫治療提供新的思路。

1 LAG-3 的結(jié)構(gòu)及功能

LAG-3 是在活化的T 細(xì)胞上被發(fā)現(xiàn)的含有498個(gè)氨基酸的跨膜蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)3 個(gè)部分組成［7-8］。該蛋白的編碼區(qū)位于人12 號(hào)染色體短臂的遠(yuǎn)端部分，與CD4 的編碼區(qū)相鄰。TRIEBEL 等［14］對(duì)LAG-3 的氨基酸序列的分析顯示，其具有4 個(gè)與CD4 高度同源的細(xì)胞外IgSF 域（D1～D4），而D1 的親和力高于CD4，因此其可以通過(guò)干擾MHC-Ⅱ與CD4 的結(jié)合來(lái)抑制T 細(xì)胞活化；LAG-3 可與MHC-Ⅱ相互作用以阻止相同的MHC分子與TCR 和CD4 結(jié)合，從而直接阻斷免疫反應(yīng)中的TCR 信號(hào)傳導(dǎo)通路。然而有研究［15］發(fā)現(xiàn)，LAG-3 不能普遍結(jié)合MHC-Ⅱ，而是選擇性地結(jié)合穩(wěn)定的MHC-Ⅱ復(fù)合物（peptide-MHC class Ⅱ，pMHC-Ⅱ），并可優(yōu)先抑制與穩(wěn)定的pMHC-Ⅱ反應(yīng)的T 細(xì)胞的活化。此外，LAG-3 不會(huì)干擾CD4-pMHC-Ⅱ和TCR-pMHC-Ⅱ的相互作用。LAG-3 的IC 區(qū)由約60 個(gè)氨基酸殘基組成，LAG-3 的抑制功能需要其細(xì)胞內(nèi)的IC 區(qū)域參與，這表明LAG-3 會(huì)通過(guò)其IC 區(qū)域轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制信號(hào)。LAG-3 細(xì)胞質(zhì)尾部的分子結(jié)構(gòu)與其他免疫檢查點(diǎn)截然不同，它具有3 個(gè)結(jié)構(gòu)域：第1 個(gè)區(qū)域是絲氨酸磷酸化位點(diǎn)；第2 個(gè)區(qū)域是含有KIEELE 基序的單個(gè)賴氨酸殘基，此結(jié)構(gòu)域?qū)φ{(diào)節(jié)CD4+T 細(xì)胞的功能至關(guān)重要；第3 個(gè)區(qū)域是谷氨酸-脯氨酸重復(fù)序列，與LAG-3 相關(guān)蛋白（LAG-3 related protein，LAP）結(jié)合，有助于定位LAG-3。在這3 個(gè)區(qū)域中，KIEELE 基序?qū)π盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和LAG-3 的抑制功能是不可或缺的［16］。

2 腫瘤及TIL 中的LAG-3

2.1 LAG-3 在腫瘤中的表達(dá)與作用LAG-3 在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。在慢性淋巴細(xì)胞性白血病中，LAG-3高表達(dá)患者的療效較差［17］。在肝細(xì)胞癌中LAG-3的高表達(dá)與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)［18］。在胃癌中，LAG-3 在CD4+T 和CD8+T 細(xì)胞上的表達(dá)升高，可能會(huì)損害細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能［19］；LAG-3 在黑色素瘤的CD8+腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL）上表達(dá)與黑色素瘤的TNM 分期及預(yù)后有關(guān)［20］；LAG-3 在乳腺癌患者中的表達(dá)與其存活率呈正相關(guān)，與復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)［21-23］；在卵巢癌中，LAG-3在紐約食管鱗狀細(xì)胞癌-1（NY-ESO-1，New York esophageal squamous cell carcinoma-1）誘導(dǎo)的特異性CD8+T 細(xì)胞上高表達(dá)，使其產(chǎn)生IFN-g 和TNF-a 的能力下降；此外，LAG-3 在肺癌及結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中均高表達(dá)且與疾病預(yù)后有一定的關(guān)系［23］。

2.2 LAG-3 在TIL 中的表達(dá)與作用在腫瘤進(jìn)展期間，腫瘤浸潤(rùn)性CD4+T 細(xì)胞會(huì)慢慢衰竭，LAG-3的表達(dá)也會(huì)升高［24］。編碼LAG-3 分子與編碼CD4分子基因的染色體定位相同，擁有共同的外顯子和內(nèi)含子，因此LAG-3 與CD4 可能是同一基因復(fù)制進(jìn)化而來(lái)的。TRIEBEL 等［14］發(fā)現(xiàn)MHC-Ⅱ類分子是LAG-3 和CD4 的共同配體，LAG-3 與CD4 的同源性表明其可以結(jié)合MHC-Ⅱ類分子，LAG-3 通過(guò)與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合并相互作用抑制特異性CD4+T 細(xì)胞的增殖。ASCIERTO 等［9］發(fā)現(xiàn)，在CD4+T 細(xì)胞中的Th1 上可檢測(cè)到LAG-3，而在大部分Th2 上不能檢測(cè)到，這說(shuō)明LAG-3 可作為區(qū)分Th1和Th2 的表面標(biāo)志物。然而后來(lái)又有研究［25-26］認(rèn)為，LAG-3 表達(dá)可能無(wú)法可靠地區(qū)分Th1 和Th2。LAG-3 在未活化的CD8+T 細(xì)胞表達(dá)較少，而當(dāng)受相應(yīng)的抗原刺激后，LAG-3 的表達(dá)顯著升高。LAG-3在活化的CD8+T 細(xì)胞上高水平表達(dá)，抑制CD8+T 細(xì)胞的活化及增殖，從而抑制CD8+T 細(xì)胞的抗腫瘤活性。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，LAG-3 可在各種類型腫瘤的腫瘤浸潤(rùn)性CD8+T 細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，如卵巢癌、肺癌、結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌、腎細(xì)胞癌和其他實(shí)體腫瘤［23，27］。此外，LAG-3 分子的mRNA 在CD8+T 細(xì)胞表面高表達(dá)可導(dǎo)致CD8+T 細(xì)胞的功能缺陷。LAG-3 也在Treg 中高表達(dá)。最近的研究［28］發(fā)現(xiàn)，LAG-3 可以促進(jìn)Treg 分化，而阻斷LAG-3 可以減弱其對(duì)Treg 的誘導(dǎo)作用，腫瘤浸潤(rùn)性Treg 在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中與PD-1、CTLA-4、LAG-3 和T 細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋-3（TIM-3，T-cell immunoglobulin mucin-3）等抑制性分子一起可以增強(qiáng)Foxp3 的積累。有研究發(fā)現(xiàn)［29］，LAG-3+Foxp3+Treg 細(xì)胞在外周血單個(gè)核細(xì)胞（包括淋巴細(xì)胞和DC 等）、TIL 及黑色素瘤、結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織中高表達(dá)，活化的LAG-3+Treg 能夠產(chǎn)生IL-10 和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-b1（TGF-b1），LAG-3+Treg 細(xì)胞具有免疫抑制作用，與腫瘤免疫逃逸相關(guān)。LAG-3 潛在的生物學(xué)機(jī)制最初在活化的NK 細(xì)胞上被發(fā)現(xiàn)，但LAG-3 對(duì)NK 細(xì)胞的調(diào)控作用在小鼠模型和人細(xì)胞模型中的結(jié)果并不一致。在小鼠身上的研究發(fā)現(xiàn)，敲除LAG-3基因可以導(dǎo)致小鼠NK 細(xì)胞自然殺傷活性降低［30］。另有研究發(fā)現(xiàn)，LAG-3抗體對(duì)人類的NK細(xì)胞自然殺傷活性沒(méi)有特異性影響，然而其機(jī)制尚不清楚［31］。根據(jù)最近的研究［32］，LAG-3 在漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞（plasmacytoid dendritic cell，pDC）上表達(dá)水平比在任何其他DC 亞群上都高。LAG-3 可以負(fù)向調(diào)節(jié)pDC 的活化，LAG-3 也被認(rèn)為是pDC 重要的功能標(biāo)志物。LAG-3 通過(guò)基于免疫受體酪氨酸的激活基序（ITAM，immunoreceptor tyrosine-based activation motif）抑制性信號(hào)傳導(dǎo)途徑與MHC-Ⅱ的相互結(jié)合抑制DC 的增殖和成熟［33］。LAG-3 在pDC 上高度表達(dá)，有助于維持pDC 內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［34］。

3 PD-1 聯(lián)合LAG-3 在腫瘤中的作用

PD-1 作為一種免疫檢查點(diǎn)，可以抑制T 細(xì)胞活化。許多研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)特異性抗體阻斷PD-1可以明顯抑制多種腫瘤的進(jìn)展，如乳腺癌、黑色素瘤、肺癌和結(jié)直腸癌等［35-37］。同樣，與PD-1 一樣，LAG-3 也是一種免疫抑制檢查點(diǎn)分子，LAG-3 通過(guò)對(duì)T 細(xì)胞的調(diào)節(jié)，使抗原特異性CD4+T 細(xì)胞增殖減少［38］。已有多項(xiàng)研究使用LAG-3 抗體治療多種惡性腫瘤，其中包括黑色素瘤、胰腺癌和晚期腎細(xì)胞癌［39-40］。然而，關(guān)于抗PD-1/LAG-3雙特異性抗體在惡性腫瘤中的研究較少，所以有必要開(kāi)發(fā)針對(duì)PD-1 和LAG-3 的新型雙特異性抗體。FGL-1 作為L(zhǎng)AG-3 的配體，在體外和體內(nèi)以受體-配體相互依賴的方式發(fā)揮對(duì)T 細(xì)胞的抑制作用，阻斷FGL-1-LAG-3 的相互作用可以刺激腫瘤微環(huán)境中T 細(xì)胞的活化和增殖，以提高機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫與清除能力［41-42］。因此，通過(guò)阻斷FGL-1-LAG-3 通路和阻斷PD-1，可以為腫瘤的免疫治療提供一種新的治療方法。

4 FGL-1 的結(jié)構(gòu)及功能

FGL-1 是一種肝細(xì)胞分泌蛋白，最初是從人肝癌細(xì)胞中克隆得到的，并發(fā)現(xiàn)其在肝癌患者中高度表達(dá)。FGL-1 屬于纖維蛋白原家族，其C 端部分有與纖維蛋白原相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域存在于肌腱蛋白、纖維白蛋白、血管生成素、纖維蛋白原b和c 鏈中。FGL-1 與纖維蛋白原β-亞基和γ-亞基的羧基末端氨基酸具有高度同源性，但它不具有纖維蛋白原的3 個(gè)功能域：血小板結(jié)合位點(diǎn)、交聯(lián)區(qū)和凝血酶敏感位點(diǎn)。以前的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GL-1 的表達(dá)在再生肝臟中升高，并且FGL-1 可以刺激原代肝細(xì)胞中3H-胸苷的攝取，這說(shuō)明FGL-1 可以促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，因此有人認(rèn)為FGL-1 是肝臟再生因子。然而另有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GL-1 對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用，提示其在肝細(xì)胞增殖中具有抗增殖作用［43］。

5 FGL-1 作為L(zhǎng)AG-3 的主要功能配體在腫瘤中的表達(dá)及作用

KIM 等［44］采用BioGPS 組織微陣列數(shù)據(jù)庫(kù)和蛋白質(zhì)組分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GL-1 mRNA 和蛋白質(zhì)主要在人類正常的肝臟和胰腺組織中表達(dá)。Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)的Meta 分析揭示了FGL-1 mRNA 在人類實(shí)體腫瘤中高表達(dá)的現(xiàn)象，這些腫瘤包括肺癌、前列腺癌、黑色素瘤和結(jié)直腸癌等，與正常組織相比，F(xiàn)GL-1 mRNA 在肺癌中具有最高的上調(diào)百分比（35%），而在胰腺、肝臟和頭頸癌中的表達(dá)有所降低。此外，惡性腫瘤基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，F(xiàn)GL-1 在肺腺癌中上調(diào)程度最高。FGL-1 在前列腺癌和乳腺癌中也顯著上調(diào)，但在肝癌中下調(diào)。ZHANG 等［45］通過(guò)分析50 例胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織中FGL-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中FGL-1 的表達(dá)在mRNA 和蛋白水平上均明顯高于癌旁組織，F(xiàn)GL-1 在胃癌組織中上調(diào)與預(yù)后不良相關(guān)。

WANG 等［41］采用基因組規(guī)模受體陣列技術(shù)，使用IgFc 標(biāo)記的LAG-3 細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域融合蛋白（LAG-3-Ig）來(lái)檢測(cè)LAG-3 的結(jié)合蛋白，F(xiàn)GL-1 被證實(shí)是LAG-3-Ig 的主要結(jié)合蛋白。FGL-1 與LAG-3相互作用具有高度特異性，WANG 等［41］通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了這種相互作用。LAG-3 蛋白由4 個(gè)Ig 樣細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域D1～D4 組成，通過(guò)結(jié)構(gòu)域缺失研究發(fā)現(xiàn)，LAG-3 中D3～D4 結(jié)構(gòu)域的缺失不影響其與FGL-1 的結(jié)合，而單獨(dú)的D1 或D2 可以部分降低結(jié)合能力，表明D1 和D2 可以影響FGL與1-LAG-3 的相互作用［7-8］。之前有研究發(fā)現(xiàn)，LAG-3 D1 結(jié)構(gòu)域的C 鏈中的單點(diǎn)突變（Y73F）可以抑制其與MHC-Ⅱ的結(jié)合，然而，該單點(diǎn)突變不影響其與FGL1-Ig 結(jié)合，這表明FGL-1-LAG-3 相互作用與MHC-Ⅱ-LAG-3結(jié)合并不是無(wú)用的。WANG等［41］經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GL1 作為L(zhǎng)AG-3 的主要功能性配體，在體外和體內(nèi)以受體-配體相互依賴的方式對(duì)T 細(xì)胞起抑制作用，F(xiàn)GL1-LAG-3 相互作用也可能影響記憶T 細(xì)胞的產(chǎn)生?；蛳騿慰寺】贵w可以阻斷FGL1-LAG-3 相互作用以增強(qiáng)T 細(xì)胞應(yīng)答并促進(jìn)抗腫瘤免疫能力。此外，抗FGL-1單克隆抗體在LAG-3 缺陷型小鼠中沒(méi)有抗腫瘤作用，而抗LAG-3 單克隆抗體同樣在FGL-1 缺陷型小鼠中喪失功效。FGL-1 是LAG-3 抑制T 細(xì)胞反應(yīng)的主要配體，WANG 等［41］使用FGL1-KO 小鼠的腫瘤模型研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GL-1 對(duì)依賴于LAG-3 的抗腫瘤免疫具有免疫抑制作用，抗FGL-1 單克隆抗體的抗腫瘤作用依賴于LAG-3，而抗LAG-3 的作用依賴于FGL-1 但不依賴于MHC-Ⅱ或其它LAG-3 配體。鑒于FGL-1 在大多數(shù)正常組織中表達(dá)有限，而在幾種人類惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并且與這些腫瘤的預(yù)后不良和療效不佳相關(guān)，因此可以高度選擇性地對(duì)高表達(dá)FGL-1 的腫瘤患者進(jìn)行靶向抗體療法。FGL-1 與LAG-3 相互作用是一種獨(dú)立的腫瘤免疫逃逸機(jī)制，阻斷這種相互作用可能與抗PD 治療產(chǎn)生協(xié)同作用。

6 結(jié)語(yǔ)

LAG-3 分子作為一種免疫檢查點(diǎn)受體蛋白，在黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌及結(jié)直腸癌等多種實(shí)體腫瘤中異常表達(dá)且與疾病預(yù)后有關(guān)，說(shuō)明LAG-3 在腫瘤免疫中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。MHC-Ⅱ是LAG-3 的經(jīng)典配體，LAG-3 可通過(guò)與MHC-Ⅱ分子的結(jié)合下調(diào)T細(xì)胞的活性。然而，MHC-Ⅱ是否僅對(duì)LAG-3 的抑制功能負(fù)責(zé)還存在爭(zhēng)議。FGL-1是LAG-3 的一種新發(fā)現(xiàn)的配體，在體外和體內(nèi)以受體-配體相互依賴的方式對(duì)T 細(xì)胞抑制功能起作用，F(xiàn)GL-1-LAG-3 信號(hào)通路可能與惡性腫瘤的免疫逃逸有關(guān)，通過(guò)阻斷此信號(hào)通路的傳導(dǎo)可能有助于惡性腫瘤的免疫治療。然而，F(xiàn)GL-1-LAG-3 信號(hào)通路具體的免疫逃逸機(jī)制仍然未知。此外，LAG-3不同配體的作用機(jī)制以及各配體之間是否存在結(jié)構(gòu)與功能的相關(guān)性也不清楚。因此，解決這些關(guān)鍵問(wèn)題有助于優(yōu)化LAG-3 靶向治療策略，提高惡性腫瘤的治療效果。