李慧中,劉紅梅,李 彥,李秋雨,龔姚謙,戴 幽,劉 焱*
(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長(zhǎng)沙 410128;2. 湖南省發(fā)酵食品工程技術(shù)中心,長(zhǎng)沙 410128;3. 芷江侗族自治縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,芷江 419100;4. 長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院,長(zhǎng)沙 410128)
中國(guó)的水產(chǎn)資源種類(lèi)繁多,魚(yú)卵作為魚(yú)副產(chǎn)物的一種,含有豐富的卵黃高磷蛋白(phosvitin, Pv),是仔魚(yú)獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的唯一來(lái)源,對(duì)幼魚(yú)生長(zhǎng)至關(guān)重要[1-2]。研究表明,鯉魚(yú)卵中的不飽和脂肪酸含量甚高,且不飽和脂肪酸對(duì)于腦的發(fā)育和心血管疾病的治療具有重要作用[1]。多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFA)含量同飽和脂肪酸(saturated fatty acid, SFA)含量以及單不飽和脂肪酸(monounsaturated fat, MUFA)含量的比值在鯉魚(yú)卵中約為1:1:1,已達(dá)到人體脂肪酸含量的科學(xué)攝入標(biāo)準(zhǔn),且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。國(guó)內(nèi)外對(duì)水產(chǎn)副產(chǎn)物的加工利用已有大量研究[3-7],但關(guān)于魚(yú)卵Pv方面的相關(guān)研究甚少。以鯉魚(yú)卵為原料提取Pv有利于提高鯉魚(yú)魚(yú)卵的利用價(jià)值,減少資源浪費(fèi)。本研究擬采用鹽溶法提取鯉魚(yú)卵Pv,并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行研究,這對(duì)鯉魚(yú)卵Pv在食品工業(yè)中的進(jìn)一步應(yīng)用具有實(shí)際意義。
成熟鯉魚(yú)卵采自湖南長(zhǎng)沙馬王堆農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。用生理鹽水將完整的鯉魚(yú)卵處理干凈后用高速勻漿機(jī)對(duì)其進(jìn)行勻漿處理(15 000 r/min);雞蛋Pv標(biāo)樣購(gòu)自Sigma公司。
1.2.1 鯉魚(yú)卵Pv的提取工藝
用4℃蒸餾水稀釋預(yù)處理后的鯉魚(yú)卵[V(蒸餾水): m(鯉魚(yú)卵)=10:1]并在低溫下進(jìn)行1 h不間斷的攪拌,靜置過(guò)夜(4℃),棄去上清液后高速冷凍離心,將沉淀與有機(jī)溶劑[V(95%乙醇): V(正己烷)=1:3]按照1:10的體積比進(jìn)行萃取、過(guò)濾(濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑可分離脂類(lèi))處理,用1.74 mol/L NaCl溶液對(duì)過(guò)濾后的沉淀進(jìn)行溶解并攪拌、靜置、再過(guò)濾后進(jìn)行透析脫鹽以及冷凍干燥處理,最終產(chǎn)物即為鯉魚(yú)卵Pv粗提物。
1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
首先對(duì)鯉魚(yú)卵的Pv粗提物進(jìn)行提?。?-9],經(jīng)天然聚丙烯酰胺凝膠電泳(native polyacrylamide gel electrophoresis, Native-PAGE)以及磷蛋白染色檢測(cè)確定其分子量以及純度;用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis, SDSPAGE)檢測(cè)Pv亞基的數(shù)量和分子大??;然后對(duì)鯉魚(yú)卵Pv進(jìn)行純化,根據(jù)天然凝膠電泳測(cè)得的結(jié)果對(duì)鯉魚(yú)卵Pv粗提物溶液進(jìn)行超濾分離、真空濃縮、冷凍干燥,得到其純品樣品,保存?zhèn)溆茫?40℃);最后分別檢測(cè)樣品中氮和磷的含量,計(jì)算氮磷含量比值和Pv得率,檢測(cè)紫外吸收特性、氨基酸含量及其螯合鐵離子的能力。
1.2.3 Native-PAGE
參照汪家政等[10-14]的試驗(yàn)條件并稍加調(diào)整:鯉魚(yú)卵Pv粗提物及雞蛋Pv標(biāo)樣的質(zhì)量濃度均為0.5 mg/mL,5%~10%分離膠,5%濃縮膠,注射上樣,4℃恒流電泳。
磷蛋白檢測(cè)方法:參照Sun等[15]的方法對(duì)凝膠進(jìn)行染色,然后用10%的磺基水楊酸溶液將染色的凝膠漂至蛋白條帶回顯清晰后終止。
電泳蛋白質(zhì)染色脫色方法:用0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250、25%乙醇、8%冰醋酸對(duì)鯉魚(yú)卵Pv凝膠進(jìn)行染色,用7%的冰醋酸溶液脫色,待蛋白條帶回顯清晰后進(jìn)行掃描成像。
1.2.4 SDS-PAGE
SDS-PAGE工作溶液的配制參照Native-PAGE的制備方法,在部分溶液中加入離子去污劑SDS。12%分離膠,5%濃縮膠。對(duì)凝膠進(jìn)行掃描成像,并根據(jù)Marker計(jì)算其亞基分子量。
1.2.5 得率測(cè)定
純化后的Pv重量占原料總重的百分比即為其得率。
1.2.6 氮磷含量及氮磷含量比值(N/P)的測(cè)定
氮含量的檢測(cè):依據(jù)凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定。
磷含量的測(cè)定[16-18]:本試驗(yàn)原料屬于有機(jī)磷,擬先將其消化為無(wú)機(jī)磷,再用未消化的原料做對(duì)比。磷蛋白絡(luò)合磷的含量=總的磷量-未消化原料中無(wú)機(jī)磷的含量。
1.2.7 紫外吸收檢測(cè)
將鯉魚(yú)卵Pv、雞蛋Pv標(biāo)樣分別配制成0.5 mol/L的溶液,并測(cè)定其光吸收特性(波長(zhǎng):190~300 nm[19])。
1.2.8 氨基酸組成檢測(cè)
用1 mL pH為2.2的檸檬酸鈉緩沖液溶解鯉魚(yú)卵Pv,用自動(dòng)分析儀分析除胱氨酸、色氨酸外的16種氨基酸[20]。其中色氨酸含量的測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB/T 18246-2000[21]。
1.2.9 鐵離子螯合能力測(cè)定
參照Fu等[22]介紹的方法測(cè)定鯉魚(yú)卵Pv的鐵離子螯合能力。采用分光光度法測(cè)定其在波長(zhǎng)為562 nm處的吸光度值。用螯合效應(yīng)表示Pv對(duì)鐵離子的螯合能力。
各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次,用Excel和SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖和顯著性方差分析。
圖1為在5%濃縮膠和10%分離膠時(shí)鯉魚(yú)卵Pv粗提物(泳帶2)與雞蛋Pv標(biāo)樣(泳帶1)的分離結(jié)果的對(duì)比。從圖1中可以看到,雞蛋Pv有2條清晰的條帶,對(duì)應(yīng)于Zhang等[23]發(fā)現(xiàn)的雞蛋Pv標(biāo)樣主要組分為α-Pv(α-phosvitin)和β-Pv(β-phosvitin)這一結(jié)果;鯉魚(yú)卵Pv粗提物經(jīng)過(guò)凝膠分離后顯示為P1、P2、P3 3條條帶,經(jīng)梯度凝膠電泳檢測(cè),其分子量分別為53.0、34.0和16.0 kD,其中P2(34.0 kD)、P3(16.0 kD)條帶的染色結(jié)果為陽(yáng)性,應(yīng)為鯉魚(yú)卵的Pv。這說(shuō)明鯉魚(yú)卵同雞蛋相似均含有Pv成分,同時(shí)也具有異質(zhì)性。
根據(jù)Native-PAGE檢測(cè)結(jié)果超濾分離粗提物,用超濾管(50 kD)超濾透析除鹽后的Pv,真空濃縮濾出部分冷凍干燥后進(jìn)行下一步分析。
圖1 雞蛋Pv標(biāo)樣和鯉魚(yú)卵Pv粗提物的Native-PAGE結(jié)果Fig. 1 Native-PAGE results of Pv crude extracts from egg and carp egg1:雞蛋卵Pv標(biāo)樣;2:鯉魚(yú)卵Pv粗提物。1: Standard sample of egg yolk of Pv; 2: Crude extract of egg yolk of carp Pv.
圖2為鯉魚(yú)卵Pv的SDS-PAGE結(jié)果。泳帶1顯示鯉魚(yú)卵Pv分為6條條帶,分別為P2和P3的亞基。它們的分子量從大到小分別為98.0、96.0、33.0、20.0、17.7、和15.0 kD,且亞基分子量分布范圍大。由圖2可知,鯉魚(yú)卵Pv在15.0~33.0 kD之間有4條條帶,其分子量分別為15.0、17.7、20.0、和33.0 kD。這與文獻(xiàn)中藍(lán)鱈卵Pv在相同范圍內(nèi)具有5條條帶[24]和鱸魚(yú)卵Pv中有2條條帶(其分子量分別為14.0 kD和21.0 kD)[8]的結(jié)果不同,說(shuō)明魚(yú)的品種對(duì)其Pv的組成存在一定的影響,但不影響其在一定范圍內(nèi)亞基分子量和數(shù)量上存在的相似性。
圖2 鯉魚(yú)卵Pv的SDS-PAGE結(jié)果Fig. 2 SDS-PAGE results of Pv carp egg1 :鯉魚(yú)卵Pv ;2 :蛋白marker。1. Egg yolk of carp Pv; 2: Protein marker.
圖3為制作的磷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,其線性回歸方程為y=0.067x+0.002,相關(guān)系數(shù)R2=0.999,說(shuō)明其線性關(guān)系良好。經(jīng)測(cè)定,鯉魚(yú)卵Pv的質(zhì)量濃度為8.56 μg/mL,其磷含量為4.28%。
表1中,鯉魚(yú)卵Pv的氮含量為11.74%,磷含量為4.28%,氮磷含量比值為6.07,與雞蛋Pv標(biāo)樣的氮磷含量比值2.49相比較高,說(shuō)明鯉魚(yú)卵Pv的純度比雞蛋Pv的純度低,這可能是因?yàn)轷庺~(yú)卵Pv磷酸化程度比雞蛋Pv磷酸化程度低。相比鯉魚(yú)卵Pv中0.40%的提取率,有研究表明雞蛋Pv粗提物的提取率約為0.78%,鯉魚(yú)卵Pv提取率低于雞蛋Pv。
由圖4可知,在波長(zhǎng)為190.0~350.0 nm時(shí),鯉魚(yú)卵Pv的吸收峰分別在201.0 nm處和257.8 nm處出現(xiàn),而雞蛋Pv標(biāo)樣僅在201.0 nm處出現(xiàn)吸收峰,鯉魚(yú)卵Pv吸收峰呈對(duì)稱(chēng)狀且沒(méi)有雜峰出現(xiàn),說(shuō)明鹽溶法分離提取的鯉魚(yú)卵Pv較純。在波長(zhǎng)為190.0~220.0 nm處鯉魚(yú)卵Pv和雞蛋Pv的光吸收趨勢(shì)整體是相同的,在201.0 nm(峰2)處均出現(xiàn)最高吸收峰,其主要是由共軛雙鍵肽鍵的作用導(dǎo)致的。與雞蛋Pv不同的是,鯉魚(yú)卵Pv在波長(zhǎng)為257.8 nm處出現(xiàn)吸收峰,這可能是由苯丙氨酸的作用導(dǎo)致的。苯丙氨酸是人體必需氨基酸之一,大部分在體內(nèi)經(jīng)苯丙氨酸羥化酶催化作用氧化成酪氨酸,并與酪氨酸一起合成重要的神經(jīng)遞質(zhì)和激素,參與機(jī)體糖代謝和脂肪代謝。結(jié)果顯示,鯉魚(yú)卵Pv中苯丙氨酸的含量高于雞蛋Pv,且兩者的紫外吸收特點(diǎn)不同,故反映其在氨基酸組成上也存在差異性。
表1 鯉魚(yú)卵Pv和雞蛋Pv成分比較Tab. 1 Comparison difference of Pv from egg yolk and carp egg yolk
圖3 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 3 The standard curve of inorganic phosphorus
圖4 鯉魚(yú)卵Pv和雞蛋Pv的紫外吸收?qǐng)DFig. 4 The result about UV absorption of Pv from carp egg yolk and egg yolka:鯉魚(yú)卵Pv ;b :雞蛋Pv。a: Egg yolk of carp Pv; b: Egg yolk of Pv.
從氨基酸分析結(jié)果可以看出(表2),鯉魚(yú)卵Pv和雞蛋Pv中共檢測(cè)出17種氨基酸,其中含有7種人體必需氨基酸。鯉魚(yú)卵Pv中除賴(lài)氨酸外,其余6種必需氨基酸的含量均高于雞蛋Pv,這能夠更好地促進(jìn)Pv的形成。由于在Pv的氨基酸總量中,絲氨酸占56%,且80%以上的絲氨酸被磷酸化,因此絲氨酸和總氨基酸的比值可作為評(píng)判Pv中磷含量高低的依據(jù)。鯉魚(yú)卵Pv中絲氨酸的含量為24.2%,明顯高于所含其他種類(lèi)氨基酸,但比雞蛋Pv中絲氨酸占總氨基酸含量的34.9%要低。這與Mecham等[24]的研究中提出的藍(lán)鱈卵Pv中14.6%的絲氨酸含量結(jié)果相近,說(shuō)明魚(yú)類(lèi)Pv絲氨酸含量比雞蛋Pv低,也說(shuō)明了鯉魚(yú)卵Pv中較低的絲氨酸含量正是導(dǎo)致其Pv含量低的主要原因。
鐵離子極易被氧化,能夠誘導(dǎo)自由基反應(yīng),研究中常以鐵離子為代表評(píng)價(jià)Pv的金屬離子螯合能力。如圖5所示,在鐵離子濃度相同的條件下,鯉魚(yú)卵Pv的鐵離子螯合能力小于雞蛋Pv。乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)螯合鐵離子的能力最強(qiáng)。鯉魚(yú)卵Pv的鐵離子螯合能力小于雞蛋Pv的鐵離子螯合能力,這主要與鯉魚(yú)卵Pv絲氨酸含量少、磷酸化程度小有關(guān)。
目前國(guó)內(nèi)外在對(duì)Pv的研究中多從雞蛋中獲取,魚(yú)類(lèi)中以鮪魚(yú)、黑魚(yú)、鱸魚(yú)以及鯽魚(yú)魚(yú)卵較為常見(jiàn),對(duì)鯉魚(yú)卵的提取研究很少。本文采用鹽溶法對(duì)鯉魚(yú)卵的Pv粗蛋白進(jìn)行了提取,并檢測(cè)到其粗提物中P2和P3為Pv,說(shuō)明鯉魚(yú)卵中含有Pv成分,且其同雞蛋Pv相似,具有異質(zhì)性(由P2、P3組成);SDS-PAGE檢測(cè)到鯉魚(yú)卵Pv亞基分子量分布范圍大,且在一定范圍內(nèi)Pv的組成在亞基分子量和數(shù)量上的相似性不受魚(yú)類(lèi)品種的影響;氨基酸測(cè)試結(jié)果顯示,在鯉魚(yú)卵Pv中檢測(cè)出的7種必需氨基酸中,除絲氨酸外,其余6種必需氨基酸的含量均高于雞蛋Pv中的含量,這有利于更好地促進(jìn)Pv的形成;鯉魚(yú)卵中含有的食物限制性氨基酸賴(lài)氨酸和蛋氨酸含量高,且其Pv含量高于多種魚(yú)類(lèi)。
表2 鯉魚(yú)卵及雞蛋[25]Pv的氨基酸組成及含量Tab. 2 Amino acid composition and content of Pv in egg yolk of carp and egg yolk[25]
圖5 鯉魚(yú)卵Pv,雞蛋Pv和EDTA的鐵離子螯合能力Fig. 5 The iron chelating ability of egg yolk of carp Pv, egg yolk of Pv and EDTA
通過(guò)鹽溶法提取分離鯉魚(yú)卵的Pv,可一次性獲得成分較為全面的目的蛋白。有采用葡聚糖凝膠(Sephadex G-200)過(guò)濾層析分離提取Pv的方法研究,但其試驗(yàn)速度較慢,且得到的目的蛋白較為單一;也有采用Tris緩沖溶液的提取方法,但結(jié)果顯示其提取率遠(yuǎn)低于鹽溶法。綜合來(lái)說(shuō),提取魚(yú)卵中的Pv宜采用鹽溶法。通過(guò)鹽溶法提取分離鯉魚(yú)卵的Pv并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行探究,對(duì)鯉魚(yú)卵在食品工業(yè)中的高值化利用存在實(shí)際意義。