施亞磊，于靜芳，吳 珂，周 俊*

（1. 華南師范大學生物光子學研究院，激光生命科學教育部重點實驗室，廣州 510631；2. 華南師范大學生物光子學研究院，廣東省激光生命科學重點實驗室，廣州 510631；3. 河南大學生命科學學院，開封 475004）

擬南芥（Arabidopsis thaliana）作為模式生物已有將近50年的歷史，被廣泛應(yīng)用于植物生物學的遺傳發(fā)育研究。擬南芥是二倍體，含有5對染色體，大約27 655個蛋白編碼基因［1］。目前，基于正向遺傳學（forward genetics）的突變體篩選仍然是遺傳研究中十分重要的手段，通過自發(fā)突變或人工誘變獲得感興趣的表型性狀改變，然后找到這些特定性狀變化所對應(yīng)的突變基因，并揭示其生物學功能。由此可見，鑒定異常表型的基因突變是解決植物生物學問題的關(guān)鍵一步，然而該過程通常是困難并且費時的。目前，在擬南芥的研究中已經(jīng)發(fā)展出很多方法來鑒定突變基因。其中，圖位克隆是較常用的方法，它依賴于染色體上位置已知的遺傳或分子標記［2-3］。分子標記多指DNA標記，是能夠鑒定區(qū)別個體或物種差異的染色體上的DNA序列，其源自于不同類型的突變，如插入、缺失、替換、重構(gòu)或隨機重復DNA的復制錯誤等［4］。分子標記種類很多，如簡單序列長度多態(tài)性（simple sequence length polymorphism, SSLP）、擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism, AFLP）、酶切擴增多態(tài)性（cleaved amplified polymorphisms, CAPS）、限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）、隨機擴增多態(tài)性 DNA（random amplified polymorphic DNA,RAPD）、簡單重復序列（simple sequence repeat, SSR）和單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）等［5-8］?？煽糠肿訕擞浀拈_發(fā)將極大地促進擬南芥的圖位克隆。

插入或缺失（insertion/deletion, INDEL）標記是常用的基于聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）的分子標記。PCR產(chǎn)物通過電泳分析，可以直接獲得差異信息和連鎖數(shù)據(jù)［3］。目前，許多INDEL標記已經(jīng)被開發(fā)和報道，并收集在TAIR（Arabidopsis information resource）數(shù)據(jù)庫中。然而，一些已報道的分子標記只能在特定的PCR或電泳條件下工作，或者因不同擬南芥生態(tài)型的擴增產(chǎn)物差異太小而無法區(qū)分［9］。此外，這些可利用的標記并非均勻地分布在染色體上，通常只有那些與已報道研究的突變體緊密連鎖的分子標記才被提交到了TAIR數(shù)據(jù)庫，使得好用的標記數(shù)量非常有限，不利于基因定位和連鎖分析［10］。隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展和測序成本的大幅降低，越來越多的生態(tài)型的基因組序列被公布，這使得從全基因組層面開發(fā)分子標記成為可能［11］。因此，通過比較基因組學的方法，建立一個精細的、方便使用的分子標記非常有助于擬南芥的圖位克隆。

為了尋找盡可能多的分子標記以提高圖位克隆效率，本研究進行了哥倫比亞（Columbia, Col）和蘭茲伯格（Landsberg erecta,Ler）的全基因組序列比對分析，找出了2個基因組具有差異序列的保守區(qū)域。從插入或缺失染色體物理位置中，篩選得到2 321個INDEL標記。此外，我們提供了對應(yīng)每個分子標記位點的至少一對引物序列（共計4 764對）。本工作能夠極大地方便相關(guān)研究者找到合適的分子標記，提高擬南芥突變體的圖位克隆效率。

1 材料與方法

1.1 植物材料與培養(yǎng)

植物培養(yǎng)方法與之前文獻［12-14］所述一致，擬南芥野生型Col、Ler種子經(jīng)含0.05% Triton X-100的75%乙醇震蕩消毒10 min，隨后于超凈臺中用100%乙醇置換75%乙醇，并將種子轉(zhuǎn)移到滅菌濾紙上，干燥15 min后，撒種于1/2MS固體培養(yǎng)基上。培養(yǎng)板置于4℃冰箱中黑暗處理2 d，然后放置于人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，光周期為16 h（光）/8 h（暗），晝夜溫度為23℃（晝）/21℃（夜）。

1.2 參考基因組的獲取

從 NCBI（national center for biotechnology information）數(shù)據(jù)庫獲得擬南芥Col和Ler參考基因組。Col基因組下載地址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001735.4；Ler基因組下載地址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_001651475.1。

1.3 基于基因組比較的分子標記開發(fā)

使用MUMmer3.23軟件對Col和Ler的基因組進行比較，鑒定全基因組中具有INDEL差異的保守區(qū)域。取出INDEL在Col參考基因組的上游和下游各150 bp序列，通過Primer3批量設(shè)計引物（條件：引物長度為23個堿基，GC含量約43%，Tm值約53℃，引物對應(yīng)產(chǎn)物片段長度為80～150 bp）。使用MFEprimer2軟件對引物的結(jié)合位點數(shù)量、引物3'端穩(wěn)定性、退火溫度、GC含量等進行檢測。

1.4 DNA提取

DNA提取采用TPS方法［15］。取一片4周擬南芥葉片于 1.5 mL EP 管中，加入 200 μL TPS 緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0 ；10 mmol/L乙二胺四乙酸鈉，pH 8.0；1 mol/L氯化鉀），電動研磨均勻后，于60℃放置20 min，隨后 12 000 r/min離心 10 min。取上清，加入等體積的預冷異丙醇，12 000 r/min離心10 min后棄上清，沉淀用70%酒精懸浮，12 000 r/min再次離心10 min后棄去上清，干燥1 d，獲得DNA樣品。

1.5 PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳

從擬南芥全基因組中選取23個均勻分布在5條染色體上的候選標記合成引物，并進行PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳［16］。PCR 體系（20 μL）：10 μL 2×Green Taq Mix（Vazyme）；2 μL 引物 ；1 μL DNA 模板 ；7 μL H2O。PCR 擴增條件如下 ：94℃預變性 3 min ；94℃變性30 s；53℃復性30 s，72℃延伸30 s，35 個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。瓊脂糖凝膠電泳條件：在120 V電場強度下，經(jīng)4%瓊脂糖凝膠電泳30 min后，在紫外光下觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 Col和Ler全基因組INDEL標記開發(fā)和統(tǒng)計

為了開發(fā)Col和Ler全基因組的INDEL標記，我們先使用MUMmer3軟件將Col的基因組和Ler的基因組進行比對，找出含有INDEL的保守序列片段，再使用Primer3軟件進行引物設(shè)計，通過MFEprimer2軟件對引物進行驗證。表1為各個染色體上的INDEL及分子標記的統(tǒng)計。從表1可知，基因組中平均每0.1 Mbp染色體長度大約有2個分子標記，平均每4到5個基因就有1個分子標記。圖1展示的是全基因組的INDEL（≥6 bp）及分子標記的長度分布。我們可以看到，隨著分子標記差異長度的增加，INDEL及分子標記的數(shù)量呈遞減趨勢。

表1 Col和Ler之間INDEL數(shù)量的鑒定Tab. 1 Identification of INDEL numbers between Col and Ler

圖1 Col和Ler基因組INDEL（≥6 bp）及分子標記的長度分布Fig. 1 Length distribution of INDEL and putative markers between Col and LerINDEL長度不小于6 bp，藍色代表INDEL，紅色為分子標記。隨著長度增加，INDEL及分子標記的數(shù)量呈遞減趨勢。Col基因組為參考序列。The length of INDEL (blue) is no less than 6 bp, the molecular markers are labeled whth red. As the length increases, the number of INDEL and molecular markers decreases. The reference genome is from Col.

2.2 INDEL標記在各個染色體上精細分布

從10 449個不小于6個堿基插入或缺失染色體的物理位置中，我們篩選得到2 321個INDEL標記。為了更好地展示INDEL標記在各個染色體上的分布，我們將基因、INDEL和分子標記按照每50 kb的區(qū)間進行統(tǒng)計。圖2最外側(cè)為染色體的具體起始位置，基因（橙色）、INDEL（藍色）和分子標記（深灰色）依次排開。分子標記數(shù)目最多的是第一號染色體，有591個，而分子標記密度最大的是第五號染色體，平均每0.1 Mbp的染色體物理長度有2.09個（表1和圖2）。同樣，從圖3可以看到第一號染色體的15 Mbp處、第三號染色體14 Mbp處和第五號染色體的14 Mbp處的基因、INDEL和分子標記數(shù)量都較其他區(qū)域少，應(yīng)為著絲粒的區(qū)段。

2.3 隨機分子標記的驗證分析

圖2 INDEL及分子標記在Col和Ler全基因組上的分布Fig. 2 Distribution pattern of INDEL and markers of Col against Ler最外側(cè)為染色體。從第2圈向內(nèi)，依次為基因（橙色）、INDEL（≥6 bp，藍色）和分子標記（深灰色），每50 kb為1個統(tǒng)計單位。The outermost part represents Col chromosome. From the second circle inward, there are genes (orange), INDEL (≥6 bp, blue) and molecular markers(dark gray) in order, with a statistical unit of every 50 kb.

圖3 設(shè)計的分子標記在染色體上的分布Fig. 3 The distribution of designed molecular markers on chromosomes紅色豎線表示每個分子標記在染色體上的位置，藍色圓點表示為驗證的初定位分子標記位點。The red vertical bars indicate the position of each molecular marker on the chromosome, and the blue dots indicate the site of veri fied molecular marker used to first-pass mapping.

針對這2 321個INDEL標記，我們共設(shè)計了4 764對引物，使得每個位點有一對或多對引物可供選擇。詳細引物序列及其染色體的物理位置可從At_InDel_Marker［23］（https://github.com/zhoujun1988/AtMarker/blob/master/At_InDel_Marker）獲取。在此基礎(chǔ)上，我們選擇了均勻分布在擬南芥5條染色體的20個分子標記（表2），并通過PCR和瓊脂糖凝膠電泳對其特異性進行了驗證。圖4結(jié)果顯示，這些引物能夠在統(tǒng)一的反應(yīng)體系和擴增條件下獲得穩(wěn)定的結(jié)果。Col與Ler混合樣品能夠擴增出明顯差異條帶，使得該套分子標記可直接應(yīng)用于突變基因的初步定位分析。

圖4 PCR驗證用于鑒定突變位點的初定位分子標記Fig. 4 Verified the molecular markers used to first-pass mapping by PCR3個泳道的DNA模板依次來自于Col、Ler及Col與Ler混合樣品。DNA templates for the three lanes were obtained from the Col, Ler, Col and Ler mixed samples.

3 討論

圖位克隆是鑒定基因突變位點的經(jīng)典方法，其實施離不開可靠的遺傳標記或分子標記。Col和Ler是擬南芥最常用的2個生態(tài)型?；谶@2種生態(tài)型間的多態(tài)性，本研究利用比較基因組學，篩選得到應(yīng)用于擬南芥基因圖位克隆的2 321個新的INDEL標記，并通過PCR驗證了隨機均勻分布在5條染色體的20個分子標記，后者可直接應(yīng)用于基因的快速初定位。本工作提供的精細分子標記，能夠極大地方便研究者找到合適的候選標記，提高圖位克隆作圖效率。

經(jīng)過幾十年的發(fā)展，DNA分子標記已經(jīng)從最初的基于印跡反應(yīng)的RFLP，到基于PCR的SSLP、AFLP、SSR和INDEL，再到基于測序技術(shù)的SNP［17-18］。早期的RFLP、AFLP等雖然都對物種鑒定、進化分析和基因圖位克隆等有巨大的幫助和促進，但由于各自的不足（如試驗條件要求高、操作復雜、或者不是共顯性等），這些分子標記的應(yīng)用還是受到了極大的限制［19-20］。SNP的分子標記數(shù)量最多，卻因為鑒定需要特殊的條件（如酶切或者測序），使其應(yīng)用成本較高［23］。SSR和INDEL都可以通過PCR和凝膠電泳來使用［21］。SSR也屬于INDEL的范疇，然而，INDEL存在數(shù)量更大、對基因組的覆蓋更廣、應(yīng)用更便捷高效的優(yōu)勢。

在眾多分子標記中，PCR檢測多態(tài)性（如CAPS、SSLP、AFLP、RAPD）因操作相對簡單、結(jié)果直觀可靠成為標記首選［3，22］。針對擬南芥而言，在TAIR數(shù)據(jù)庫中，由于大多數(shù)分子標記并非同時開發(fā)，研究者需要事先對試驗條件進行優(yōu)化，一些分子標記往往不能使用相同的PCR反應(yīng)體系和擴增條件，使得操作變得繁瑣。本研究針對新開發(fā)的2 321個INDEL標記，設(shè)計了至少1對或多對（共計4 764對）可供選擇的引物（At_InDel_Marker［23］和表2）。重要的是，我們初步測試的20個分布于5條染色體的分子標記可采用相同的PCR條件得到穩(wěn)定的結(jié)果（圖4），這大大提高了工作效率。通過該研究能夠方便研究者找到合適的分子標記，在常見的儀器條件和較低的試驗成本下可快速進行突變體基因定位。