裴宏謙,占江凡,秦 玲,李科靜,皮 杰,曾 聰*,李德亮*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院,中國湖南 長沙 410128;2.湖南應用技術學院農(nóng)林科技學院,中國湖南 常德 415000)

蜆屬(Corbicula)貝類隸屬于軟體動物門(Mollusca)、瓣鰓綱(Lamellibranchia)、簾蛤目(Venaroida)、蜆科(Corbiculidae),原產(chǎn)于亞洲、非洲、澳洲和中東地區(qū)[1～2]。1924年首次在北美洲太平洋沿岸被發(fā)現(xiàn)[3～4]后,蜆迅速在北美、南美和歐洲大陸擴散,目前已經(jīng)成為世界各地咸淡水水域的優(yōu)勢種群,且對當?shù)亟?jīng)濟和生態(tài)均造成嚴重威脅[5～7]。盡管如此,形態(tài)的高度可塑性和生殖方式的多樣性,導致蜆屬的分類尚未準確厘定[8～11]。蜆因其豐富的營養(yǎng)與藥用價值,一直深受我國東南沿海、日本和韓國民眾的喜愛,是重要的漁業(yè)資源[12～13]。近年來,受過度捕撈及生境破壞等因素的影響,我國蜆屬貝類資源日益衰退,亟待加強保護[14～15]。

研究表明,蜆具有二倍體、三倍體及四倍體3種倍性[16～19],且不同倍性蜆的分布具有明顯區(qū)域性,入侵地的蜆均為三倍體[20],而原產(chǎn)地水域則多種倍性的蜆均有分布,但四倍體蜆目前僅在我國四川省安岳縣的溪流中有報道[21]。蜆存在雌雄同體和雌雄異體兩套性別系統(tǒng),其中雌雄同體和雌雄異體的蜆在原產(chǎn)地共存[22],而入侵地的蜆則均為雌雄同體[23～24]。染色體核型分析是倍性鑒定最傳統(tǒng)和經(jīng)典的方法,隨著技術的發(fā)展,基于DNA含量的顯微熒光法和流式細胞術也逐漸應用于動物倍性的鑒定[25～26]。黃勤[27]利用核型分析法鑒定福建閩江地區(qū)的河蜆(Corbicula fluminea)為二倍體;Qiu等[21]同時采用核型分析及顯微熒光法,證實四川安岳縣的溪流中共存有三倍體及四倍體河蜆。流式細胞術是在顯微熒光法基礎上發(fā)展起來的一種細胞學分析方法,其可將4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染液與DNA特異性結合形成的特征熒光信號轉(zhuǎn)化為相應的DNA 含量值[28～29]。該方法已被用于鮑[30]、牡蠣[31]等多種軟體雙殼類的倍性分析,但尚未見其在蜆屬貝類倍性鑒定中的應用報道。

作為長江流域僅存的兩大通江湖泊之一,洞庭湖蜆資源豐富[32],但尚未見其倍性報道。本文以洞庭湖支流——沅江常德鼎城區(qū)江段的蜆屬貝類為研究對象,在傳統(tǒng)染色體核型分析的基礎上,采用流式細胞術對其倍性進行鑒定,并探討其倍性與形態(tài)、性別的關系,以期為其種質(zhì)資源評價和管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年7月,利用手操網(wǎng)于沅江常德鼎城區(qū)江段(111.693°E,28.987°N)采集蜆樣品。采集的樣品被帶回實驗室,置于曝氣水中暫養(yǎng)。

1.2 形態(tài)測量

將樣品置于吸水紙上吸干表面水分,用游標卡尺測量樣品殼長(shell length,SL)、殼寬(shell width,SW)及殼高(shell height,SH),用分析天平測量其濕重(wet weight,W)。

1.3 倍性鑒定

1.3.1 核型分析法

隨機選取性成熟個體,稱重后按4 μg/g濕重的劑量標準,向活體斧足注射質(zhì)量濃度為5 mg/mL的植物血凝素(phytohemagglutinin,PHA),處理24～25 h;同樣部位再以2 μg/g濕重劑量注射質(zhì)量濃度為10 mg/mL的秋水仙素,處理4～5 h。處理結束后,用剪刀撬開蜆殼,剪取鰓組織并剪碎,加1～2mL生理鹽水稀釋,在上清液中加入0.037 5 mol/L的KCl溶液,低滲處理30 min,再以2 500 r/min離心5 min,去除上清液后用卡諾式固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)固定鰓細胞30 min,以3 000 r/min離心5 min,去除上清液,重復固定兩次;熱滴片,10%Giemsa染液染色30 min,流水清洗玻片,風干后顯微觀察[33]。

1.3.2 流式細胞術

隨機選取蜆樣品,解剖并剪取閉殼肌組織,置于少量磷酸緩沖鹽溶液(pH 7.2～7.4)中用剪刀剪碎,過濾得到體細胞懸液,加入DAPI熒光染液;分別以二倍體太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)及二倍體泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)為參照,采用CyFlow?Space流式細胞儀(德國Partec公司生產(chǎn))測定體細胞的相對 DNA 含量[34～36]。

1.4 性別鑒定

參照文獻[15]的方法,先剪取新鮮樣品的性腺組織,隨后采用Bouin’s組織固定液將其固定,固定的組織經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明等操作后制成石蠟切片,用蘇木精-伊紅染液染色后封片,最后將切片樣品置于奧林巴斯顯微鏡下鏡檢并確定其性別。

1.5 數(shù)據(jù)分析處理

2 結果

2.1 倍性特征

此次分析的45個樣品中存在二倍體30個,三倍體15個。傳統(tǒng)的核型分析結果顯示:二倍體蜆的體細胞染色體數(shù)目為2n=36(圖1A),包括1對中部著絲粒染色體(metacentric,M)、1對亞中部著絲粒染色體(submetacentric,SM)以及16對近端著絲粒染色體(subtelocentric,ST)(圖1C);三倍體蜆的體細胞染色體數(shù)目為3n=54(圖1B),包括1對M染色體、5對SM染色體和12對ST染色體(圖1D)。

以二倍體太平洋牡蠣為參照,流式細胞儀所測二倍體蜆和三倍體蜆的DNA相對含量分別為12 921.82±217.43(圖 2A)和 19 041.39±375.31(圖2B)。以二倍體泥鰍為參照,流式細胞儀所測二倍體蜆和三倍體蜆的DNA相對含量分別為777.77±32.24(圖 2C)和 1 137.71±38.02(圖 2D)。

圖1 沅江蜆體細胞的染色體分裂相及核型(A)二倍體蜆的染色體分裂相;(B)三倍體蜆的染色體分裂相;(C)二倍體蜆的核型;(D)三倍體蜆的核型。Fig.1 Chromosome division and karyotype in somatic cells of Corbicula clams from the Yuan River(A)Chromosome division of diploid Corbicula clams;(B)Chromosome division of triploid Corbicula clams;(C)Karyotype of diploid Corbicula clams;(D)Karyotype of triploid Corbicula clams.

2.2 形態(tài)特征

45個蜆的濕重、殼長、殼寬和殼高分別為(5.42±1.63)g、(24.73±2.87)mm、(15.68±1.39)mm、(23.47±2.56)mm(表1)。單因素方差分析顯示,兩種倍性蜆的濕重、殼長、殼寬和殼高均無顯著性差異(P＞0.05),但二倍體蜆的SW/SL比值顯著大于三倍體(P＜0.05)。

圖2 流式細胞儀檢測的沅江蜆體細胞的相對DNA含量(A～B)以二倍體太平洋牡蠣為參照;(C～D)以二倍體泥鰍為參照。Fig.2 Relative DNA contents in somatic cells of Corbicula clams from the Yuan River detected by flow cytometry(A～B)Diploid Crassostrea gigas was used as reference;(C～D)Diploid Misgurnus anguillicaudatus was used as reference.

2.3 性別特征

45個蜆中有雌雄同體23個、雄性13個、雌性9個(圖3)。在30個二倍體蜆中,雌雄同體、雄性和雌性的個體數(shù)量分別為16、7、7;在15個三倍體中,雌雄同體、雄性和雌性的個體數(shù)量分別為 7、6、2(圖 4)。

表1 沅江不同倍性蜆的濕重和形態(tài)特征Table 1 Comparisons of wet weight and morphological characteristics of Corbicula clams with different ploidies from the Yuan River

3 討論

3.1 蜆的倍性特征

本研究首次采用流式細胞術對沅江蜆的倍性進行分析。與傳統(tǒng)核型分析方法相比,利用流式細胞術鑒定蜆的倍性,極大地降低了實驗人員對細胞生物學分析技術的依賴,簡化了倍性鑒定流程,提高了鑒定效率。研究表明,蜆屬貝類具有二倍體、三倍體、四倍體3種倍性,且不同倍性蜆的分布具有明顯區(qū)域性。通常,入侵地蜆均為三倍體,而原產(chǎn)地水域的蜆則是二倍體、三倍體及四倍體均有分布[20,22]。在我國,福建閩江河蜆為二倍體[27],臺灣基隆河河蜆為二倍體和三倍體[17],四川安岳縣溪流中的河蜆為三倍體和四倍體[21]。本研究采用傳統(tǒng)核型分析法和流式細胞術均證實二倍體和三倍體的蜆共存于沅江常德鼎城區(qū)江段。其中,二倍體蜆的體細胞染色體有36條,三倍體有54條,但染色體的單倍體數(shù)均為n=18(圖1)。已有研究表明,蜆染色體的單倍體數(shù)存在n=18或n=19兩種類型,其中n=19的蜆多分布于海水水域,且以二倍體為主[18];n=18的蜆則分布于淡水水域,且為多倍體[19]。這種染色體數(shù)目的變化或許是蜆屬貝類空間入侵演化的結果,即蜆在從海水到淡水的入侵演化過程中[37～38],1號和2號染色體逐漸融合[20],使單倍體數(shù)逐漸由n=19演化為n=18[27]。

圖3 沅江蜆的性腺組織切片(A～B)雄性;(C)雌性;(D)雌雄同體。Fig.3 Gonad tissue sections of Corbicula clams from the Yuan River(A～B)Male;(C)Female;(D)Hermaphrodite.

圖4 沅江不同倍性蜆的性別比例Fig.4 Sex ratio of Corbicula clams with different ploidies from the Yuan River

沅江二倍體蜆和三倍體蜆的核型公式分別為2n=36=2M+2SM+32ST和3n=54=3M+15SM+36ST,兩種核型中均僅有1對M染色體,且該染色體在形態(tài)上明顯大于其他染色體,此結果與黃勤[27]、Papk等[39]的研究結果相似。此外,二倍體蜆的SM染色體和ST染色體分別為1對和16對,而三倍體蜆則分別為5對和12對。福建閩江二倍體河蜆的M染色體、SM染色體和ST染色體分別為1對、13對和4對;四川安岳縣三倍體河蜆的上述染色體分別為2對、13對和3對,兩者均含有較多的SM染色體,而ST染色體相對較少。對比以上數(shù)據(jù)可知,沅江蜆的ST染色體數(shù)量高于福建閩江與四川安岳兩地的河蜆。有研究顯示,動物在進化過程中,體細胞核型將由含較多ST染色體逐漸向以M和SM染色體為主進行演化[40～41],因此推測沅江蜆較福建閩江和四川安岳縣溪流中的河蜆更為原始。

3.2 蜆的倍性與形態(tài)

動物的三倍體較其二倍體多一套染色體,且其個體一般較二倍體大,如三倍體太平洋牡蠣較二倍體表現(xiàn)出明顯的生長優(yōu)勢[42]。但本研究中的三倍體蜆較二倍體并無顯著的生長優(yōu)勢,表現(xiàn)為不同倍性蜆的SL、SW、SH均無顯著差異,僅SW/SL的比值存在顯著差異(P＜0.05)(表1)。此外,大量研究顯示不同殼色蜆的外殼形態(tài)之間差異不顯著。Qiu等[21]利用殼色特征對蜆的倍性進行比較分析,發(fā)現(xiàn)黃殼河蜆均為三倍體,而棕殼河蜆均為四倍體,且兩種殼色蜆的SL、SW和SH沒有顯著差異,僅三倍體蜆的SW/SL和SW/SH比值顯著大于四倍體。Wang等[11]研究報道,大通湖白色和紫色殼蜆的SL、SW和SH也均無顯著差異。雖然本研究顯示二倍體蜆的SW/SL比值顯著大于三倍體蜆,但是否可利用該比值簡便地判斷沅江蜆的倍性還需要進一步的驗證。盡管如此,洪澤湖棕殼河蜆的SL、SW、SH及濕重均大于黃殼河蜆,而SL/SH比值則小于黃殼群體[43]。相關研究對香港新界河蜆的4種等位酶(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、磷酸葡萄糖異構酶和磷酸葡萄糖變位酶1/2)進行分析,結果顯示白殼和紫殼河蜆的4個等位基因均沒有顯著差異,且遺傳距離小[44～45]。Britton等[46]也認為,蜆殼的顏色和大小的多樣性是環(huán)境作用的結果,而非遺傳差異所致。但也有研究表明,即使在同樣的環(huán)境條件下,蜆在殼色和形態(tài)特征方面也存在顯著差異,由此認為形態(tài)差異為遺傳因素所致,而非環(huán)境條件不同造成[17]。因此,蜆屬貝類形態(tài)特征多樣性的形成原因值得深入研究。

3.3 蜆的倍性與性別

已有研究表明,洞庭湖蜆存在雌雄異體和雌雄同體兩種性別系統(tǒng),且以雌雄同體為主,雌雄同體、雌性及雄性的個體比例約為16∶5∶4[47]。本研究結果顯示,沅江蜆中雌雄同體的個體共占51.1%,其次為雄性個體,占28.9%,雌性個體占20.0%(圖4),再次證實洞庭湖流域的蜆以雌雄同體為主,雌雄異體并存。相關研究報道,二倍體蜆均為雌雄異體,而多倍體蜆均為雌雄同體[48～49]。比如:中國福建閩江的二倍體河蜆[27]、日本琵琶湖的二倍體蜆C.sandai[50]、韓國二倍體蜆C.japonica[18]均為雌雄異體,入侵地蜆均為三倍體且雌雄同體[19],中國四川安岳縣溪流中的三倍體和四倍體蜆C.fluminea也均為雌雄同體。但是,本研究結果顯示沅江蜆的倍性與性別之間沒有顯著的相關性,即二倍體蜆中雌雄同體共占53.4%,雄性與雌性各占23.3%;三倍體蜆中雌雄同體占46.7%,雄性占40.0%,雌性僅占13.3%。Okamoto等[50]認為蜆在從沿海到內(nèi)陸的入侵演化過程中,染色體的單倍體數(shù)目減少,由n=19演化為n=18,但倍性逐漸多倍化,且性別也由雌雄異體逐步向雌雄同體為主演化[51]。因此,有必要從大尺度上分析鹽度等環(huán)境因子對蜆屬貝類倍性和性別特征的影響,從而全面解析蜆屬貝類倍性和生殖特征的空間演化機制。