何 明，王權(quán)勝，蒙帥杰，蔣 越，王東珊，楊德芬

(1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)， 南寧 530001； 2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 南寧 530023)

據(jù)統(tǒng)計(jì)資料顯示，約50%的不孕不育由男方原因引起[1]。男性不育的原因很多，如生精功能障礙、輸精管梗阻、附件腺功能缺陷、遺傳或環(huán)境因素等[2-3]，其中生精功能障礙是男性不育的主要原因[4]。精子發(fā)生是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，主要可分為有絲分裂期、減數(shù)分裂期和生殖期3個(gè)階段。生精細(xì)胞凋亡和分化在精子發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用[5]。細(xì)胞增殖和凋亡之間的動(dòng)態(tài)平衡決定了睪丸曲細(xì)精管中的細(xì)胞數(shù)量。在精子發(fā)生的整個(gè)過程中受到一系列激素的影響，其中睪酮在精子發(fā)生過程中起重要作用，精子發(fā)生缺乏睪酮會(huì)導(dǎo)致精子生成不足[6]?！袄m(xù)斷種子方”源于明·岳甫嘉《醫(yī)學(xué)正印》“補(bǔ)腎健脾益氣種子煎方”。前期研究表明，續(xù)斷種子方對精子具有抗氧化酶活性和減少氧化損傷作用，可提高精子質(zhì)量[7-8]，是改善男性精子質(zhì)量的有效藥物，但其潛在的機(jī)制尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)基于精子發(fā)生的睪丸微環(huán)境，探索續(xù)斷種子方對生精功能障礙模型小鼠精子發(fā)生的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。

1 材料

1.1 主要儀器

MACRO精子計(jì)數(shù)板和WLJY-9000型偉力彩色精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)(購自北京偉力新世紀(jì)科技發(fā)展有限公司)；TDL-4ZB型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(購自湖南星科科學(xué)儀器有限公司)；掃描電子光學(xué)顯微鏡，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科提供。

1.2 主要試劑與藥物

環(huán)磷酰胺粉針劑(批號(hào)K1625007，購自阿拉丁公司)；TUNE試劑盒(產(chǎn)品號(hào)11684817910, 購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；血清睪酮放射免疫試劑盒(批號(hào)S10940111，購自天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司)。

續(xù)斷種子方藥物組成：續(xù)斷15 g,杜仲 15 g,骨碎補(bǔ)15 g,菟絲子15 g,牛膝15 g,枸杞子10 g,女貞子10 g,黨參15 g,白術(shù)10 g,山藥15 g。采用單味中藥配方顆粒(免煎中藥，由江蘇省江陰市天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)1203002)，維生素E膠丸，生產(chǎn)廠家為桂南藥業(yè)股份有限公司(產(chǎn)品批號(hào)VE180402)。

1.3 動(dòng)物

45只雄性小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量24～28 g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)[SCXK(桂)2009-0002]。小鼠飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房，均自由采食飲水，隔日換水，3 d更換1次墊料，環(huán)境溫度20～25 ℃，12 h明暗周期。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)選取10只作為正常對照組，另外35只造模成功后按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、續(xù)斷種子方組、維生素E組各10只。本實(shí)驗(yàn)已通過廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查(批準(zhǔn)號(hào)2017JJA10462)。

1.4 造模方法

模型的制備方法參考文獻(xiàn)[9]，除對照組以外的小鼠均采用環(huán)磷酰胺以0.9%生理鹽水5 ml稀釋后，分別按2 mg/d[80 mg/(kg·d)]的劑量造模，連續(xù)腹膜內(nèi)注射5 d。此法先前已被證明可誘導(dǎo)精子發(fā)生功能障礙[10]。同時(shí)對照組注射等量0.9%生理鹽水。各組小鼠正常喂養(yǎng)4周后，隨機(jī)抽取模型組小鼠5只處殺,取下左側(cè)睪丸及附睪，光學(xué)顯微鏡下附睪精子檢測和組織病理學(xué)中見少量精子，提示少精子癥動(dòng)物模型造模成功。

2 方法

2.1 干預(yù)方法

造模成功后稱動(dòng)物體質(zhì)量，按人體等效劑量將藥物配成水溶液劑型灌胃給藥。模型組和對照組小鼠給予0.9%生理鹽水灌胃；續(xù)斷種子方組小鼠每天給予9 g生藥量/(kg·d)，濃度為1 g/ml的續(xù)斷種子方溶于生理鹽水中灌胃，維生素E組小鼠(黃油溶液)每天給予75 mg/(kg·d)，濃度為5 mg/ml的維生素E膠囊溶于生理鹽水中灌胃，每日1次，連續(xù)8周。

2.2 取材方法

末次給藥24 h后將小鼠稱重，各組所有小鼠行標(biāo)本眼眶采血檢測血清睪酮。然后頭頸脫臼法處死小鼠迅速取出睪丸和附睪，生理鹽水沖洗，除去血液將睪丸或附睪的質(zhì)量除以體質(zhì)量計(jì)算睪丸、附睪相對質(zhì)量用于評(píng)價(jià)小鼠生長發(fā)育狀態(tài)。將小鼠一側(cè)睪丸和附睪分別固定于Bouin溶液中24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟切片包埋，行HE染色。另一側(cè)附睪置于含2 mL培養(yǎng)液小皿中剪碎, 36.5 ℃孵育使精子充分游離泳動(dòng)30 min,做精液質(zhì)量分析。

2.3 精液全自動(dòng)檢測

采用精子計(jì)數(shù)板和精子檢驗(yàn)系統(tǒng)檢測精子濃度和活動(dòng)力,按WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊》[11]標(biāo)準(zhǔn)測定精子參數(shù)。

2.4 放射免疫法檢測

將血清以3000 r/min分離15 min，取上清液置于-40 ℃冰箱，采用睪酮測定試劑盒對血清睪酮水平進(jìn)行檢測。

2.5 HE染色

睪丸和附睪組織切片行蘇木精伊紅(HE)染色,每組制作10張切片,每張切片隨機(jī)取2個(gè)視野觀察(×200,即每組觀察20個(gè)視野),計(jì)數(shù)類圓形生精小管上皮層次、類三角形或類菱形間質(zhì)細(xì)胞團(tuán)內(nèi)細(xì)胞數(shù)。記錄顯示嚴(yán)重低細(xì)胞性(生精細(xì)胞數(shù)減少)和生精上皮變薄的受損小管，附睪組織(×400, 每組觀察20個(gè)視野)觀察附睪管精子濃度和早熟精子數(shù)量。

2.6 TUNEL法檢測

按試劑盒說明書操作,顯微鏡下生精細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中染成棕黃色顆粒者為細(xì)胞凋亡陽性表達(dá),每組制作5張切片,每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野觀察(×100,即每組觀察25個(gè)視野),計(jì)數(shù)生精細(xì)胞凋亡陽性率。每張切片計(jì)數(shù)每個(gè)生精小管內(nèi)凋亡陽性細(xì)胞各占所有生精細(xì)胞的比率(即凋亡陽性率),連續(xù)觀察5個(gè)生精小管斷面計(jì)數(shù)凋亡陽性率。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 造模后體征和行為表現(xiàn)

小鼠出現(xiàn)飲水和進(jìn)食減少、自主活動(dòng)減少、毛發(fā)干枯、精神不振、耳廓蒼白、上瞼下垂無力、反應(yīng)遲鈍等癥狀，1周后上述癥狀逐漸好轉(zhuǎn)。在造模中因體質(zhì)量和劑量計(jì)算誤差出現(xiàn)死亡2只(模型組1只，續(xù)斷種子方組1只)，灌胃過程中因血管破裂、刺破胃及食管等原因致大鼠死亡2只(維生素E組1只，模型組1只)。

3.2 續(xù)斷種子方對小鼠體質(zhì)量、睪丸附睪相對質(zhì)量、精子質(zhì)量、生精小管受損的影響

表1示，生殖器官的相對質(zhì)量和精子參數(shù)是常用于監(jiān)測男性生殖系統(tǒng)的損害指標(biāo)。與對照組比較，模型組小鼠睪丸相對質(zhì)量、精子濃度和精子活力顯著下降，受損生精小管增加(P<0.01)；與模型組比較，續(xù)斷種子方組小鼠睪丸相對質(zhì)量、精子濃度和精子活力顯著增加，受損生精小管減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，體質(zhì)量、附睪相對質(zhì)量無明顯變化。

表1 續(xù)斷種子方對小鼠體質(zhì)量、睪丸附睪相對質(zhì)量、精子質(zhì)量、生精小管受損的影響

3.3 續(xù)斷種子方對小鼠血清睪酮、間質(zhì)細(xì)胞、生精上皮層數(shù)的影響

表2示，與對照組比較，模型組血清睪酮、生精上皮層數(shù)顯著降低(P<0.01)，間質(zhì)細(xì)胞數(shù)值變化不明顯；與模型組比較，續(xù)斷種子方組血清睪酮、生精上皮層數(shù)均增加(P<0.01)。

表2 續(xù)斷種子方對血清睪酮、間質(zhì)細(xì)胞、生精上皮層數(shù)水平的影響

3.4 睪丸組織病理學(xué)

圖1示，在正常對照組中可見睪丸的正常組織學(xué)特征，如生精上皮層正常厚度，有大量生精細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞(圖1A)。相反，模型組小鼠表現(xiàn)出排列松散萎縮的曲細(xì)精管，變薄的生精上皮細(xì)胞，特別是在減數(shù)分裂階段生精細(xì)胞脫落增多和少量的間質(zhì)細(xì)胞減少(圖1B))。在維生素E組中，盡管生精上皮變薄，但在生精小管中可見許多成熟的精子細(xì)胞(圖1C)。在續(xù)斷種子方組中，生精上皮層變厚，不同階段的精子細(xì)胞排列分布，在曲細(xì)精管中可見許多成熟的精子細(xì)胞，此外續(xù)斷種子方治療組中的間質(zhì)細(xì)胞數(shù)增加(圖1D)。

3.5 附睪組織病理學(xué)

圖2示，正常對照組附睪組織的精子濃度正常，早熟精子細(xì)胞很少(圖2A)。模型組精子濃度降低，附睪尾部的曲細(xì)精管中早熟精子細(xì)胞的數(shù)量增加(圖2B)。續(xù)斷種子方組和維生素E組均能改善精子濃度，降低附睪尾部早產(chǎn)精子細(xì)胞數(shù)量(圖2C)和(圖2D)。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.維生素E組；D.續(xù)斷種子方組圖中黑色箭頭指示早熟精子圖2 光鏡顯微鏡下各組小鼠附睪尾組織切片比較(HE染色×400)

3.6 生精細(xì)胞凋亡陽性率比較

圖3示，特異性免疫組織學(xué)染色c-kit陽性信號(hào)是細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)的棕黃色顆粒,染色陰性為未著色細(xì)胞或僅可見棕黃色，陽性細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞。在光鏡顯微鏡下(×100)可看到，細(xì)胞凋亡大多發(fā)生于精母細(xì)胞和精原細(xì)胞。模型組 (12.54±2.88)%，維生素E組(6.46±2.19)%，續(xù)斷種子方組(2.71±2.13)%，與模型組比較，續(xù)斷種子方組凋亡陽性率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.維生素E組；D.續(xù)斷種子方組(圖中黑色箭頭示凋亡細(xì)胞)圖3 光鏡顯微鏡下各組小鼠睪丸組織切片比較(HE染色 ×100)

4 討論

少精子癥是男性不育癥中最常見的類型，其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，是目前男性不育研究的熱點(diǎn)之一。根據(jù)2017年歐洲泌尿外科學(xué)會(huì)公布的數(shù)據(jù)顯示，男性不育患者中少精子癥比例呈上升趨勢[12]。我國不孕不育率已高達(dá)15%，其中由男方引起的不育約占50%[13]。內(nèi)分泌激素異常是導(dǎo)致男性不育或生育力低下的主要原因之一[14]。前期臨床實(shí)踐及實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)，續(xù)斷種子方可提高精子質(zhì)量[7-8，15]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索續(xù)斷種子方促生精功能障礙模型小鼠精子發(fā)生的潛在機(jī)制。

環(huán)磷酰胺作為烷化劑，是引起生精功能障礙的因子之一。在本研究中，成年雄性小鼠腹膜內(nèi)注射環(huán)磷酰胺5 d后可誘導(dǎo)生精功能障礙，能直接引起大量精原細(xì)胞和精母細(xì)胞凋亡,干擾生精細(xì)胞增殖和分化，從而阻礙生精細(xì)胞有絲分裂,導(dǎo)致精子數(shù)量生成減少[10]。有研究報(bào)道，環(huán)磷酰胺可通過增強(qiáng)Bax基因的表達(dá)誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞大量凋亡,睪酮分泌減少,最終導(dǎo)致生精上皮細(xì)胞凋亡[16]，精子數(shù)量減少。研究發(fā)現(xiàn)，注射環(huán)磷酰胺可明顯降低小鼠精子濃度及活動(dòng)，引起睪丸附睪的組織學(xué)損傷。在模型組，可見小鼠睪丸組織曲細(xì)精管萎縮明顯，生精上皮變薄，生精細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞明顯減少。相反，續(xù)斷種子方組經(jīng)治療后睪丸相對質(zhì)量、精子濃度和活動(dòng)力顯著增加，睪丸組織生精上皮層變厚，間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加，分泌高水平睪酮。與模型組比較，續(xù)斷種子方治療后可明顯增加附睪管中精子濃度和活力，減少附睪管中早熟的精子細(xì)胞。研究表明，續(xù)斷種子方組可明顯修復(fù)環(huán)磷酰胺所致小鼠睪丸組織的損傷，促進(jìn)精子發(fā)生。

睪酮是精子發(fā)生的主要調(diào)節(jié)因子，通過與雄激素受體(AR)結(jié)合起作用。睪酮自間質(zhì)細(xì)胞分泌后，可經(jīng)支持細(xì)胞進(jìn)入生精小管轉(zhuǎn)變?yōu)殡p氫睪酮，與生精細(xì)胞的雄激素受體結(jié)合促進(jìn)精子生成。在缺乏睪酮或AR功能失調(diào)的情況下，精子發(fā)生在減數(shù)分裂過程中將會(huì)停滯，使少數(shù)生殖細(xì)胞發(fā)育到單倍體精子細(xì)胞階段和細(xì)長精子細(xì)胞階段后不能發(fā)育為成熟精子[17-19]；另外，附著到圓形精子或方形精子的間質(zhì)細(xì)胞不能維持生殖細(xì)胞營養(yǎng)，使精子細(xì)胞過早成熟[20]，形成畸形精子、少弱精子；此外，在沒有睪酮信號(hào)傳導(dǎo)的情況下，成熟的精子細(xì)胞被支持細(xì)胞保留和吞噬[17]，精子減少。模型組小鼠睪酮水平的低下可能是由于睪丸及附睪組織損傷、間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量分泌減少所致；續(xù)斷種子方組小鼠間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多，睪酮明顯升高，生精細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)明顯減少。有研究報(bào)道，睪酮水平升高可抑制生精細(xì)胞凋亡，促進(jìn)精子發(fā)生，二者有密切關(guān)系[21]。因此課題組認(rèn)為，續(xù)斷種子方提高模型小鼠精子濃度機(jī)制可能與增加間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，分泌高水平睪酮，抑制生精細(xì)胞凋亡，促進(jìn)精子發(fā)生有關(guān)。

中醫(yī)多從“腎虛”“脾腎兩虛”“肝腎同源”論治男性不育癥。通過文獻(xiàn)研究和臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，課題組認(rèn)為“營氣不從，腎精虧虛”是男性不育癥的主要病因病機(jī)，“營氣不從”即指睪丸附睪局部氣血不足?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》云：“邪之所湊，其氣必虛”。睪丸局部氣血不足，營衛(wèi)失和，血管通透作用失調(diào)，血郁熱聚，經(jīng)絡(luò)阻隔，日久腎子失養(yǎng)則不育，治以“健脾益腎，活血生精”的續(xù)斷種子方。該方源于明·岳甫嘉《醫(yī)學(xué)正印》“補(bǔ)腎健脾益氣種子煎方”,岳甫嘉[22]認(rèn)為此方乃“蓋精神氣血，皆脾土所化生。此方得種子生息之元，生精最速，陽事易舉，若能節(jié)欲，生子更易。真方之王道而神奇者”。“續(xù)斷種子方”由續(xù)斷、骨碎補(bǔ)、杜仲、牛膝、菟絲子、枸杞子、女貞子、黨參、白術(shù)和山藥組成，方中續(xù)斷、黨參補(bǔ)腎生精、健脾補(bǔ)血；枸杞子、菟絲子、女貞子補(bǔ)腎生精、益氣活血；牛膝、紅藤、杜仲、骨碎補(bǔ)活血通絡(luò)、補(bǔ)腎生精；山藥、白術(shù)健脾益氣、生精固精，諸藥合用共奏健脾益腎、活血生精通絡(luò)功效。藥理研究表明，枸杞子、菟絲子含有總黃酮類物質(zhì)，可以提高睪酮激素水平，抑制生精上皮細(xì)胞凋亡，同時(shí)具有清除自由基、抗氧化損傷作用[23-24]。女貞子含有大量微量元素Zn，可刺激生精細(xì)胞增殖，增加間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，為精子發(fā)生和成熟提供條件[25]。續(xù)斷、杜仲可降低睪丸組織中的活性氧，減少睪酮的合成和DNA損傷，達(dá)到抗自由基損傷功效[26-27]。牛膝能抑制精索靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，有效預(yù)防脂多糖對精子的損傷[28]。

本研究表明，續(xù)斷種子方促進(jìn)少精子癥模型小鼠精子發(fā)生的機(jī)制可能為，通過改善睪丸微環(huán)境，增加間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，分泌高水平睪酮，抑制生精細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)精子發(fā)生。但升高的睪酮抑制生精細(xì)胞凋亡的機(jī)制以及是否通過基因調(diào)控來實(shí)現(xiàn)，尚有待進(jìn)一步探討。