代永霞， 任杰， 崔慶標(biāo)， 李露， 陳曉宇

(1.河南省第二人民醫(yī)院皮膚科，河南 鄭州 451191;2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450001)

皮膚鱗癌是起源于表皮或附屬器的一種惡性腫瘤，多見于50歲以上老年人，好發(fā)于頭面部[1]。常發(fā)生于某些皮膚癌前病基礎(chǔ)上，或由各種癌前病演變而來，少數(shù)為原發(fā)性[2]。早期皮膚鱗癌患者采用手術(shù)、光動力及放化療等治療，但由于癌細胞易發(fā)生轉(zhuǎn)移或?qū)Ψ派浠煵幻舾?，?dǎo)致患者晚期預(yù)后不良。因此，從分子角度深入探討皮膚鱗癌的發(fā)展機制至關(guān)重要。microRNAs (miRNAs)是一組非編碼的小RNA(長度約22 nt)，通過調(diào)節(jié)特定mRNA靶點的活性，在人類疾病的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[3-4]。miRNAs參與細胞分化、增殖和凋亡等生物學(xué)過程，這些過程在癌癥發(fā)展中非常重要[5-6]。多項研究表明，miRNA的調(diào)控異常與癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，包括肝癌中的miR-122、結(jié)直腸癌中的miR-25、乳腺癌中的miR-125b[7-9]。此外，也有miRNA在皮膚鱗癌發(fā)病機制中的報道，如miR-373表達下調(diào)明顯抑制皮膚鱗癌A431細胞的侵襲，并能明顯下調(diào)MMP-2和MMP-9蛋白的表達[10]。因此，皮膚鱗癌中miRNA靶點的識別至關(guān)重要。miR-195位于染色體17p13.1上6881953～6862065 bp之間，屬于microRNA-15/16/195/424/497家族[11]。廣泛的研究表明，miR-195在許多腫瘤中解除調(diào)節(jié)并發(fā)揮腫瘤抑制作用，包括肺癌、腎上腺皮質(zhì)癌和結(jié)腸癌[12-13]。然而，miR-195在皮膚鱗癌細胞中的作用尚不清楚，因此本研究擬探討miR-195在皮膚鱗癌細胞中的作用，為進一步闡明其在皮膚鱗癌中發(fā)揮的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、設(shè)備

A431細胞(上海通派生物科技有限公司)；HaCaT細胞(武漢普諾賽生命科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(中國賽默飛世爾科技公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；蛋白裂解液、點突變試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、山羊抗鼠IgG二抗(上海碧云天生物有限公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(日本Takara公司)；Bax、Bcl-2、GAPDH、鈣粘附蛋白E、鈣粘附蛋白N抗體(上海圣克魯斯生物公司)；實驗中用到的質(zhì)粒由GenePharma公司合成。 熒光定量 PCR儀(美國 Thermo Fisher Scientific公司)； 蛋白電泳儀、 蛋白半干轉(zhuǎn)印槽(美國伯樂公司)；37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(黑龍江東拓儀器制造有限公司)；高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) A431細胞和HaCaT細胞在含有10% FBS和青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，細胞長滿后進行消化傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 顯微鏡下觀察細胞長到95%后，加入PBS進行清洗，再用胰酶消化細胞，將稀釋后的細胞按1×105個/孔的細胞密度鋪到12孔板，細胞密度達70%時，用Turbofect試劑轉(zhuǎn)染組質(zhì)粒，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，收集各組細胞RNA樣和蛋白樣。

1.2.3 CCK-8法檢測miR-195、MYB對細胞增殖的影響 顯微鏡下觀察細胞長到95%后，加入PBS進行清洗，再用胰酶消化細胞，將稀釋后的A431細胞鋪于96孔板中，細胞匯合達70%～80%時，通過Turbofect轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染組分為：①對照組;②mimics NC組；③miR-195 mimics組;④inhibitor NC組;⑤miR-195 inhibitor組;⑥陰性對照組(siRNA NC);⑦MYB siRNA組;⑧過表達對照組[pcDNA-3.1(+)];⑨pcDNA-MYB組;⑩MYB過表達+LY294002組[pcDNA-MYB+LY294002(20 μmol/L)],在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，PBS清洗細胞，小心滴加10 μL CCK-8工作液至細胞內(nèi)，孵育2 h，在酶標(biāo)儀讀取各孔細胞在450 nm處的吸光值。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因活性檢測細胞的熒光素酶活性 TargetScan預(yù)測miR-195的潛在靶基因，構(gòu)建MYB wt載體，再通過點突變試劑盒構(gòu)建MYB mut載體。將狀態(tài)良好的A431細胞接種于12孔板，細胞匯合至70%～75%時，利用Turbofect試劑將MYB wt、MYB mut分別與miR-195mimics、mimics NC質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至A431細胞，48 h后利用雙熒光素酶報告基因盒測定細胞的熒光素酶活性。

1.2.5 RT-qPCR檢測細胞內(nèi)miR-195、MYB的表達 分別用mimics NC、miR-195 mimics、inhibitor NC、miR-195 inhibitor、siRNA NC、MYB siRNA、pcDNA-3.1(+)、pcDNA-MYB重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，同時設(shè)置未轉(zhuǎn)染組細胞作為對照。48 h后收取細胞RNA樣品和培養(yǎng)的A431細胞、HaCaT細胞，利用Trizol法提取細胞總RNA，RNA溶液濃度和純度測定正確后，反轉(zhuǎn)錄總RNA為cDNA。以cDNA為模板，按照預(yù)變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 30 s，40個循環(huán)的程序，進行實時熒光定量PCR，實驗結(jié)果使用GAPDH為內(nèi)參，2-△△Ct法分析各組A431細胞、HaCaT細胞內(nèi)miR-195和MYB的表達量。實驗所用的引物見表1。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.2.6 Western blot檢測miR-195、MYB對Bax、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin表達的影響 分別用mimics NC、miR-195 mimics、inhibitor NC、miR-195 inhibitor、siRNA NC、MYB siRNA、pcDNA-3.1(+)、pcDNA-MYB重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，另外一組細胞將LY294002(20 μmol/L)作用細胞12 h后轉(zhuǎn)染pcDNA-MYB質(zhì)粒，同時設(shè)置未轉(zhuǎn)染組細胞作為對照。48 h后收取細胞蛋白樣品，用裂解液充分裂解細胞。BCA法測定上清蛋白樣品的濃度后，每個孔50 μg點樣，參照75 V 30 min、120 V 1.5 h的程序進行SDS-PAGE凝膠電泳。分析Bax、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin的表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過表達miR-195抑制A431細胞增殖和EMT

結(jié)果顯示，A431細胞中miR-195的表達量明顯低于HaCaT細胞(t=14.70，P=0.005)。miR-195 mimics組的miR-195表達量較對照組或mimics NC組明顯升高(t值分別為13.80、14.75，P值均<0.01)，說明miR-195 mimics質(zhì)粒在細胞內(nèi)表達成功。miR-195 mimics組的細胞增殖能力明顯降低(t值分別為9.20、9.20，P值均<0.05)，Bax蛋白表達量明顯上升(t值分別為20.40、21.58，P值均<0.01)，Bcl-2蛋白表達量明顯下降(t值分別為21.87、22.63，P值均<0.01)，E-cadherin蛋白表達量明顯上升(t值分別為9.24、9.25，P值均<0.05)，N-cadherin蛋白表達量明顯下降(t值分別為12.56、12.72，P值均<0.01)，詳見圖1A～1G。表明miR-195在A431細胞中低表達，過表達miR-195抑制了A431細胞的增殖和EMT。

2.2 下調(diào)miR-195促進A431細胞增殖和EMT

與對照組或inhibitor NC組相比，miR-195 inhibitor組的miR-195表達量明顯降低(t值分別為10.83、10.89，P值均<0.01)，細胞增殖能力增強(t值分別為9.08、9.09，P值均<0.05)，Bcl-2蛋白表達量明顯上升(t值分別為16.22、16.57，P值均<0.01)，Bax蛋白表達量明顯下降(t值分別為14.86、14.93，P值均<0.01)，N-cadherin蛋白表達量明顯上升(t值分別為10.85、11.73，P值均<0.01)，E-cadherin蛋白表達量明顯下降(t值分別為20.54、21.63，P值均<0.01)，詳見圖2A～2F。表明下調(diào)miR-195促進了A431細胞的增殖和EMT。

圖1 過表達miR-195抑制A431細胞增殖和EMT 1A：RT-qPCR檢測miR-195在HaCaT和A431細胞中的表達；1B：RT-qPCR檢測過表達miR-195后A431細胞中miR-195的表達量；1C：CCK-8檢測過表達miR-195對A431細胞增殖的影響；1D：Western blot檢測過表達miR-195對A431細胞內(nèi)Bcl-2和Bax表達的影響；1E：Bcl-2和Bax蛋白相對表達量；1F：Western blot檢測過表達miR-195對A431細胞內(nèi)E-cadherin、N-cadherin表達量的影響；1G：E-cadherin、N-cadherin蛋白相對表達量

2.3 miR-195與MYB的靶向和調(diào)控關(guān)系

預(yù)測miR-195和MYB之間的結(jié)合位點見圖3A。當(dāng)質(zhì)粒攜帶MYB 3’UTR wt時，miR-195的熒光素酶活性明顯降低(t=15.87，P=0.004)；攜帶MYB 3’UTR mut時，miR-195的熒光素酶活性無變化(P>0.05)。表明MYB是miR-195在A431細胞中的下游靶點。與對照組或mimics NC組相比，miR-195 mimics組MYB表達量明顯降低(t值分別為15.81、16.25，P值均<0.01)，而miR-195 inhibitor組MYB表達量明顯升高(t值分別為18.37、17.58，P值均<0.01)，詳見圖3B、3C。表明miR-195與MYB之間具有靶向和負調(diào)控關(guān)系。

2.4 下調(diào)MYB抑制A431細胞增殖和EMT

RT-qPCR結(jié)果顯示，A431細胞中MYB的表達量明顯高于HaCaT細胞(t=16.02，P=0.004)。在細胞內(nèi)表達MYB siRNA質(zhì)粒后，與對照組或siRNA NC組相比，MYB siRNA組的MYB表達量明顯降低(t值分別為18.37、18.53，P值均<0.01)，細胞增殖能力明顯降低(t值分別為9.03、9.04，P值均<0.05)，Bax蛋白表達量明顯上升(t值分別為13.48、13.27，P值均<0.01)，Bcl-2蛋白表達量明顯下降(t值分別為17.63、18.54，P值均<0.01)，E-cadherin蛋白表達量明顯上升(t值分別為23.41、22.37，P值均<0.01)，N-cadherin蛋白表達量明顯下降(t值分別為14.84、15.26，P值均<0.01)，詳見圖4A～4G。表明MYB在A431細胞中高表達，下調(diào)MYB抑制了A431細胞的增殖和EMT。

2.5 MYB通過PI3K-Akt通路調(diào)控A431細胞的增殖和EMT

結(jié)果顯示，與對照組或pcDNA-3.1(+)組相比，pcDNA-MYB組細胞內(nèi)MYB表達量明顯升高(t值分別為16.12、17.48，P值均<0.01)，說明pcDNA-MYB質(zhì)粒在細胞內(nèi)表達成功；與pcDNA-3.1(+)組相比，pcDNA-MYB組細胞內(nèi)PI3K、Akt蛋白磷酸化水平明顯升高，p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值明顯升高(t值分別為18.76、13.26，P值均<0.01)；細胞增殖能力明顯升高(t=10.77，P=0.009)，Bax蛋白表達量明顯降低(t=12.74，P=0.006)，Bcl-2蛋白表達量明顯升高(t=12.72，P=0.006)，E-cadherin蛋白表達量明顯降低(t=16.54，P=0.004)，N-cadherin蛋白表達量明顯升高(t=14.64，P=0.005)。LY294002作用細胞后,pcDNA-MYB+LY294002組與對照組相比，細胞PI3K蛋白磷酸化水平明顯受到抑制(t=21.06，P=0.002)；與pcDNA-MYB組相比，細胞增殖能力明顯降低(t=13.94，P=0.007)，Bax蛋白表達量明顯升高(t=15.62，P=0.004)，Bcl-2蛋白表達量明顯降低(t=13.63，P=0.004)，E-cadherin蛋白表達量明顯升高(t=13.87，P=0.003)，N-cadherin蛋白表達量明顯降低(t=13.19，P=0.006)，詳見圖5A～5J。表明過表達MYB能夠激活細胞內(nèi)PI3K-Akt通路，從而促進A431細胞的增殖和EMT。

圖2 下調(diào)miR-195促進A431細胞增殖和EMT 2A：RT-qPCR檢測下調(diào)miR-195后A431細胞中miR-195的表達量；2B：CCK-8檢測下調(diào)miR-195對A431細胞增殖的影響；2C：Western blot檢測下調(diào)miR-195對A431細胞內(nèi)Bcl-2和Bax表達的影響；2D：Bcl-2和Bax蛋白相對表達量；2E：Western blot檢測下調(diào)miR-195對A431細胞E-cadherin、N-cadherin表達量的影響；2F：E-cadherin、N-cadherin蛋白相對表達量

圖3 miR-195與MYB的靶向和調(diào)控關(guān)系 3A：TargetScan預(yù)測miR-195的潛在靶基因；3B：雙熒光素酶報告基因活性檢測；3C：RT-qPCR檢測過表達或下調(diào)miR-195對A431細胞內(nèi)MYB表達的影響

圖4 下調(diào)MYB抑制A431細胞增殖和EMT 4A：RT-qPCR檢測MYB在HaCaT和A431細胞中的表達量；4B：RT-qPCR檢測下調(diào)MYB后A431細胞中MYB的表達量；4C：CCK-8檢測下調(diào)MYB對A431細胞增殖的影響；4D：Western blot檢測下調(diào)MYB對A431細胞內(nèi)Bcl-2、Bax表達的影響；4E：Bcl-2和Bax的相對表達量；4F：Western blot檢測下調(diào)MYB對A431細胞內(nèi)E-cadherin、N-cadherin表達量的影響；4G：E-cadherin、N-cadherin蛋白的相對表達量

3 討論

越來越多的研究表明miR-195在多種癌癥中異常表達，說明miR-195可能在腫瘤發(fā)生和腫瘤進展中發(fā)揮重要作用。目前，有報道稱miR-195在肝細胞癌和腎上腺皮質(zhì)癌中下調(diào)，發(fā)揮腫瘤抑制的作用[14]。然而，它在乳腺癌患者血清中表達量明顯上調(diào)，與乳腺癌臨床分期相關(guān)[15]。因此，miR-195可能以組織特異性的方式發(fā)生在不同類型的癌癥中。然而，miR-195在皮膚鱗癌中的作用還有待進一步研究。在之前的研究中，Guo等[16]報道了miR-195在NSCLC組織和細胞系中均明顯下降，過表達miR-195可明顯抑制NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲。此外，研究表明在結(jié)腸癌中，miR-195 表達也明顯下調(diào)[17]。本研究使用RT-qPCR方法檢測miR-195在A431細胞和HaCaT細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)與HaCaT細胞相比，miR-195在A431細胞中的表達量明顯下調(diào)，提示miR-195的低表達可能參與了皮膚鱗癌細胞的癌變。

為了更詳細地評估m(xù)iR-195在皮膚鱗癌中的作用，本研究將miR-195 mimics作用于A431細胞后，發(fā)現(xiàn)A431細胞增殖能力明顯降低，EMT能力下降，表明過表達miR-195抑制了A431細胞增殖與EMT，促進細胞凋亡。因此，miR-195可能作為抑癌基因在皮膚鱗癌發(fā)病機制中發(fā)揮作用，其具體機制及作用靶點值得進一步研究。有研究表明miR-195通過靶向WNT3A抑制結(jié)腸癌的增殖和轉(zhuǎn)移[18]，靶向CHEK1調(diào)控非小細胞肺癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲[19]。本研究通過TargetScan預(yù)測了miR-195的潛在靶基因，通過熒光素酶報告實驗證實在A431細胞中MYB是候選基因。

MYB是多種癌癥中的致癌基因。轉(zhuǎn)錄因子MYB最初被鑒定為v-MYB的細胞同源物，v-MYB是與禽類白血病相關(guān)的轉(zhuǎn)化逆轉(zhuǎn)錄病毒癌基因。在后續(xù)研究中MYB被進一步確定為人類幾種腫瘤類型中的致癌基因[20-21]。當(dāng)MYB表達不當(dāng)時，MYB會激活幾個重要的基因靶標(biāo)，如環(huán)氧合酶-2、Bcl-2和c-Myc，從而促進腫瘤的發(fā)展，影響多種過程，如增殖、侵襲和遷移。這對探索MYB在癌癥發(fā)展中的調(diào)控機制尤為重要。本研究發(fā)現(xiàn)MYB在A431細胞中表達上調(diào)，而下調(diào)MYB明顯抑制了A431細胞的增殖和轉(zhuǎn)移；過表達MYB激活了細胞內(nèi)PI3K-Akt信號通路。此外，miR-195可以調(diào)控A431細胞關(guān)鍵癌基因MYB的表達。推測miR-195參與了皮膚鱗癌發(fā)展的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制，進一步表明特異性miRNA的變化可以通過關(guān)鍵靶基因引起癌細胞一系列表型變化。

圖5 MYB通過PI3K-Akt通路調(diào)控A431細胞的增殖和EMT 5A：Western blot檢測過表達MYB對A431細胞PI3K-Akt通路的影響； 5B：p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值；5C：Western blot檢測LY294002作用細胞后對PI3K磷酸水平的影響；5D：p-PI3K/PI3K比值；5E：RT-qPCR檢測過表達MYB后A431細胞內(nèi)MYB表達量；5F：CCK-8檢測MYB通過PI3K-Akt通路對A431細胞增殖的影響； 5G：Western blot檢測MYB通過PI3K-Akt通路對A431細胞內(nèi)Bcl-2和Bax表達的影響； 5H：Bcl-2和Bax蛋白相對表達量；5I：Western blot檢測MYB通過PI3K-Akt通路對A431細胞內(nèi)E-cadherin、N-cadherin表達量的影響； 5J：E-cadherin、N-cadherin蛋白相對表達量

綜上，本研究證明了miR-195表達缺失是A431細胞中的常見事件，miR-195可能通過直接靶向MYB激活PI3K-Akt通路作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用。該發(fā)現(xiàn)有助于我們更好地理解皮膚鱗癌的發(fā)病機制和發(fā)展，并可能對未來皮膚鱗癌的治療具有重要意義。