常雪蕊 ，趙志顯 ，趙俊金 ，鄧曉彬 ，劉 剛 ，張永紅 ，郭 勇 ，倪和民 ，王楚端 ，邢 凱 ＊

（1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2.全國畜牧總站，北京 100193；3.北京田園奧瑞生物科技有限公司，北京100096；4.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100194）

脂肪是機(jī)體能量貯存最主要的形式，脂類代謝在機(jī)體生命活動(dòng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，而脂肪的代謝對于畜牧生產(chǎn)有重要意義。在畜禽生產(chǎn)中，脂肪對于維持生命活動(dòng)、生長發(fā)育和生產(chǎn)是至關(guān)重要的。近年來，研究者以豬為試驗(yàn)對象進(jìn)行了大量miRNA（小的非編碼單鏈RNA）的研究，研究表明，miRNA參與調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化、脂肪形成、脂肪酸代謝、膽固醇合成等多個(gè)生命過程[1,2]。目前有關(guān)調(diào)控豬脂肪代謝相關(guān)的miRNA研究十分欠缺。

許多miRNA已成為脂質(zhì)代謝和膽固醇代謝的重要調(diào)節(jié)因子。例如，已經(jīng)有研究確定了miR-33的功能，包括調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞激活和線粒體代謝豬脂肪發(fā)育相關(guān)。將miR-33識別為一種重要的非編碼RNA，可獨(dú)立于其在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝中的作用而控制心血管穩(wěn)態(tài)[3]。例如miR-148a和miR-128-1，是靶向調(diào)節(jié)細(xì)胞膽固醇代謝的重要蛋白質(zhì)，并有望治療動(dòng)脈粥樣硬化在內(nèi)的心臟代謝疾病[4]。

在豬的脂肪合成中，有實(shí)驗(yàn)證明miR-146a-5p能夠抑制脂肪生成[5]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-196a/b（miR-196a，miR-196b-5p）在皖南花豬中的表達(dá)水平最高，miR-196a/b通過一種新的途徑影響豬背長肌中的脂肪發(fā)生脂肪細(xì)胞因子信號通路[6]。

目前，關(guān)于miR-133a的報(bào)道多集中影響細(xì)胞的增殖和分化，研究用于抑制癌癥疾病的細(xì)胞增殖。例如下調(diào)miR-133a-3p對膀胱癌的腫瘤起抑制作用[7]，miR-133a-5p會抑制成肌細(xì)胞的增殖和分化等[8]。研究利用了生物信息學(xué)分析技術(shù)，預(yù)測miR-133a-5p的靶基因，并對其靶基因集合進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析、KEGG通路富集分析，為ssc-miR-133a-5p的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 保守性分析

從miRbase（www.miRbase.org）中檢索到成熟的miR-133a-5p候選序列，然后選擇人、小鼠、鯉魚、雞等多個(gè)物種與豬（ssc）miRNA序列進(jìn)行相似性分析。

1.2 ssc-miR-133a-5p靶基因預(yù)測

使用Targetscan（http://www.targetscan.org/vert_72/）、miRDB（http://mirdb.org/）和miRWalk（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）三種在線軟件進(jìn)行miR-133a-5p靶基因預(yù)測，并取3種結(jié)果的交集用于進(jìn)一步分析。使用Venny（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）對3種軟件預(yù)測的靶基因進(jìn)行可視化分析。

1.3 靶基因的生物信息學(xué)分析

使用STRING（https://string-db.org/）功能性蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)在線分析軟件，對候選靶基因進(jìn)行蛋白質(zhì)互作分析。使用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）生物信息功能分析軟件，對候選靶基因進(jìn)行KEGG通路分析。通過超幾何分析檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用Benjamini-Hochberg 算法進(jìn)行校正，顯著富集Pathways的閾值為BenjaminiP-value＜0.05KEGG通路。

1.4 脂肪沉積相關(guān)的關(guān)鍵靶基因篩選

在課題組的前期研究中，利用轉(zhuǎn)錄組測序篩選出的肥胖組與瘦組長白豬脂肪組織中差異表達(dá)基因564個(gè)。為了進(jìn)一步篩選ssc-miR-133a-5p調(diào)控脂肪沉積相關(guān)的靶基因，預(yù)測的靶基因與差異表達(dá)基因取交集。與ssc-miR-133a-5p表達(dá)趨勢相反的靶基因表示二者可能存在重要的反向調(diào)控關(guān)系。

2 結(jié)果

通過對不同物種的microRNA-133a-5p的序列相似性分析（表1），人與豬的序列完全相同，所以在線預(yù)測全部選用has-133a-5p。

通過miRWalk在線預(yù)測，獲得了has-133a-5p的5657個(gè)候選靶基因；通過TargetScan在線預(yù)測，獲得了has-miR-133a-5p的3353個(gè)候選靶基因；通過miRDB在線預(yù)測，獲得了has-133a-5p的496個(gè)候選靶基因；候選靶基因有239個(gè)在3個(gè)預(yù)測結(jié)果中重疊出現(xiàn)（圖1）。

在預(yù)測得到的239個(gè)候選靶基因存在蛋白質(zhì)互作關(guān)系（圖2）。并得到了靶基因所參與到的KEGG信號通路結(jié)果（圖3）。

對關(guān)鍵靶基因鑒定。將預(yù)測的靶基因與在同樣樣本中差異表達(dá)的基因取交集，發(fā)現(xiàn)6個(gè)基因MAPK6、RORA、TMEM182、POPDC2、PPARGC1A和FXR1同時(shí)出現(xiàn)在兩組中。這6個(gè)基因的表達(dá)水平與ssc-miR-133a-5p的表達(dá)水平呈相反的趨勢。通過比較分析得表2。

表1 不同物種間序列相似性分析

3 討論與分析

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，高通量測序技術(shù)在全基因組范圍內(nèi)鑒定功能miRNA發(fā)揮了重要的作用。在課題組前期的研究中，針對具有顯著背膘厚度差異的長白豬進(jìn)行了脂肪組織miRNAome測序[9]，結(jié)果顯示ssc-miR-133a-5p在肥胖組豬脂肪組織中的表達(dá)水平顯著高于瘦組。這預(yù)示著ssc-miR-133a-5p可能在脂肪沉積的過程中發(fā)揮著重要的作用。

MiRNA在生命活動(dòng)的各個(gè)方面都起著重要的作用，如生長發(fā)育、細(xì)胞分化及凋亡、能量代謝和多種疾病的發(fā)生等。通過KEGG信號通路分析，ssc-miR-133a-5p也涉及胰島素分泌、AMPK等的信號通路。胰島素是一種有效的營養(yǎng)物質(zhì)分解代謝協(xié)調(diào)器，在脂肪細(xì)胞中尤其如此，胰島素在脂肪細(xì)胞發(fā)育過程中以劑量依賴性方式?jīng)Q定脂質(zhì)的積聚，胰島素信號在豬脂肪細(xì)胞分化中起著基礎(chǔ)作用[10]。另外，豬脂肪組織合成并分泌許多直接或間接影響胰島素作用的脂肪因子（瘦素，脂聯(lián)素等）[11]。AMPK在豬的代償性生長中起著重要的作用。AMP激活的蛋白激酶（AMPK）在調(diào)節(jié)細(xì)胞能量平衡中起主要作用[12]。此外，AMPK信號通路的激活在減少豬的肌內(nèi)脂肪沉積中起積極作用[13]。通過得到靶基因顯著富集分析顯示，ssc-miR-133a-5p參與類固醇激素介導(dǎo)的信號通路、維持細(xì)胞葡萄糖穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)合成等多種功能。

表2 預(yù)測靶基因與樣本差異表達(dá)基因分析

在ssc-miR-133a-5p的候選靶基因中，與在同樣樣本中差異表達(dá)的6個(gè)基因都已經(jīng)有大量實(shí)驗(yàn)證明發(fā)現(xiàn)其在能量代謝中發(fā)揮重要作用。研究表明，TMEM182參與白色脂肪組織的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)極為突出，并且在體外成脂和成肌過程中，TMEM182轉(zhuǎn)錄物的急劇上調(diào)提示TMEM182可能在重要的脂肪細(xì)胞內(nèi)起作用[14]。實(shí)驗(yàn)表明，肝臟RORA參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)體內(nèi)平衡，介導(dǎo)肝脂質(zhì)代謝。當(dāng)進(jìn)行高脂肪含量飲食測試時(shí)，肝臟特異性RORA缺陷型小鼠會發(fā)展為肝脂肪變性，肥胖和胰島素抵抗。全局轉(zhuǎn)錄組分析顯示，RORA的肝臟特異性缺失會導(dǎo)致增加肝糖和脂質(zhì)代謝[15]。大量研究證明了參與調(diào)節(jié)脂肪生成和脂質(zhì)代謝的基因的表達(dá)可能影響豬的經(jīng)濟(jì)重要脂肪性狀，PPARGC1A在波蘭大白豬，波蘭長白豬和皮特蘭豬的脂肪沉積中等位基因特異性差異極顯著，PPARGC1A在豬脂肪組織中受到順式調(diào)節(jié)[16]。BMP6抑制葡萄糖的產(chǎn)生，頡頏糖原分解作用，從而調(diào)節(jié)糖代謝[17]。支鏈氨基酸（纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸）的補(bǔ)充通常有益于能量消耗，循環(huán)中支鏈氨基酸水平的升高與肥胖和糖尿病有關(guān)。棕色脂肪組織中的支鏈氨基酸的主動(dòng)分解代謝是由SLC25A44介導(dǎo)的，它將支鏈氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中。棕色脂肪組織是通過SLC25A44控制支鏈氨基酸分解代謝的關(guān)鍵[18]。

綜上所述，ssc-miR-133a-5p可能通過調(diào)控TMEM182、RORA、PPARGC1A等基因，進(jìn)而參與細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，調(diào)節(jié)能量平衡，以及參與AMPK等信號通路發(fā)揮重要調(diào)控作用。這些發(fā)現(xiàn)將有力支持ssc-miR-133a-5p參與豬的脂肪沉積調(diào)控機(jī)制的探索。

4 結(jié)論

Ssc-miR-133a-5p候選靶基因RORA與PPARGC1A等存在蛋白互作關(guān)系。TMEM182、BMP6、SLC25A44等多個(gè)候選靶基因參與葡萄糖和脂肪代謝平衡、脂肪沉積等，可能通過胰島素的分泌及晝夜節(jié)律、AMPK等信號通路影響豬的脂肪生成調(diào)控機(jī)制。