李海利，朱文豪，張青嫻，游一，方劍玉，焦文強(qiáng)，徐引弟，許峰，王治方，郎利敏，張立憲，王克領(lǐng)

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002)

豬傳染性胸膜肺炎是危害養(yǎng)豬業(yè)的一種嚴(yán)重的呼吸道疾病，在規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)普遍流行，其病原菌為胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)[1]。該病原血清型眾多，目前報(bào)道的有20多種，而且不同血清型之間缺乏交叉保護(hù)性，這也是豬傳染性胸膜肺炎難防難控的最主要原因[2]。生長(zhǎng)豬感染APP后出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育緩慢、飼料利用率低，育肥豬出現(xiàn)急性死亡、口鼻流血等癥狀[3]。目前，該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，嚴(yán)重威脅規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，給各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。四環(huán)素類抗生素是獸醫(yī)臨床常用的一類抗生素，應(yīng)用抗生素治療該病能挽回部分經(jīng)濟(jì)損失，但不能根治[5]?？祻?fù)后的豬往往成為帶菌者，持續(xù)排毒，成為傳染源，嚴(yán)重威脅其他健康豬。經(jīng)抗生素治療后常引起細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)，導(dǎo)致多重耐藥或者超級(jí)耐藥，給臨床治療帶來(lái)極大挑戰(zhàn)[6]。

四環(huán)素、土霉素等四環(huán)素類抗生素是臨床常用的抗生素，這類抗生素具有共同多環(huán)并四苯羧基酰胺母核衍生物[7]。四環(huán)素類抗生素易導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，并且具有交叉耐藥性。這類抗生素的殺菌機(jī)制是引起細(xì)菌細(xì)胞膜的通透和抑制蛋白質(zhì)的合成。四環(huán)素類抗生素耐藥決定因子TetM、TetO、OtrA、TetS、TetT、TetQ、TetB(P)、TetW、Tet(32)和Tet(36)與核糖體相互作用保護(hù)細(xì)菌自身免受四環(huán)素作用的蛋白質(zhì)。這些耐藥決定因子位于細(xì)菌質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子上[8]。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)APP對(duì)四環(huán)素類抗生素耐藥基因的研究報(bào)道較少，APP四環(huán)素類耐藥現(xiàn)狀和耐藥流行分子特征也不清楚。本研究就分離鑒定的胸膜肺炎放線桿菌對(duì)四環(huán)素類抗生素的耐藥基因進(jìn)行了系統(tǒng)研究，為今后豬傳染性胸膜肺炎的防制和新藥研發(fā)提供基礎(chǔ)，為臨床用藥和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基及試劑

腦心浸液肉湯(含有蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、甘油、脂肪酸、10%馬血清和100 μg/mL NAD)、Buffer、Taq酶等購(gòu)于Sigma生物技術(shù)有限公司。

1.2 APP菌株及其復(fù)蘇

2013—2019年臨床分離鑒定的85株胸膜肺炎放線桿菌菌株，-80 ℃保存。將分離鑒定的85株APP接種于腦心浸液肉湯(添加10%馬血清和100 μg/mL NAD)，置于37 ℃的CO2(5%～10%)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑取菌落進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.3 APP菌株藥物敏感試驗(yàn)

采用圓紙片擴(kuò)散法檢測(cè)APP對(duì)四環(huán)素類藥物的敏感性，包括：四環(huán)素、土霉素、金霉素、多西環(huán)素、美他環(huán)素、米諾霉素和替加環(huán)素，根據(jù)抑菌環(huán)直徑判定藥物的敏感度[9]。

1.4 APP核酸提取

將每株細(xì)菌接種腦心浸液肉湯(含有蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、甘油、脂肪酸、10%馬血清和100 μg/mL NAD)，置于37 ℃的CO2(5%～10%)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集細(xì)菌，提取DNA。

1.5 耐藥基因的PCR檢測(cè)

設(shè)計(jì)了10對(duì)特異性較高的引物(表1)，分別檢測(cè)tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tet1、tetL1和tetL2共10種耐藥基因[10]，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 耐藥基因引物及擴(kuò)增片段大小

PCR反應(yīng)體系為22 μL：0.22 mmol/L dNTPs 5 μL，0.04 U/μLTaq酶1 μL，10.5 μmol/L引物5 μL，1.5 mmol/L Mg2+2 μL，水9 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2.5 min；95 ℃變性50 s，55 ℃退火32 s，72 ℃延伸3.2 min，33個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸 4.2 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，然后進(jìn)行回收和測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥敏試驗(yàn)

APP對(duì)各藥物的耐藥率分別為：四環(huán)素76.5%(65/85)，土霉素28.2%(24/85)，金霉素54.1%(46/85)，多西環(huán)素45.9%(39/85)，美他環(huán)素48.2%(41/85)，米諾霉素25.9%(22/85)，替加環(huán)素22.3%(19/85)。

2.2 APP耐藥基因的PCR檢測(cè)

采用PCR方法對(duì)四環(huán)素類抗生素耐藥基因(tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tet1、tetL1、tetL2)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tet1、tetL2、tetL1耐藥基因的耐藥率分別為78.8%(67/85)、41.2%(35/85)、15.3%(13/85)、8.2%(7/85)、21.2%(18/85)、15.3%(13/85)、43.5%(37/85)、24.7%(21/85)、30.6%(26/85)、tetL1全部陰性，未檢出其耐藥基因。部分檢測(cè)結(jié)果的電泳圖譜見(jiàn)圖1至圖9。

M. DL2000 DNA Marker; 1～17. 部分樣品圖1 部分樣品耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

3 討論

四環(huán)素類抗生素是廣譜抗菌藥物，是獸醫(yī)臨床常用的一類抗生素類預(yù)防或者治療性藥物，在規(guī)?；B(yǎng)豬生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用，長(zhǎng)期應(yīng)用或者不合理應(yīng)用，常常造成細(xì)菌耐藥，出現(xiàn)多重耐藥菌株或者超級(jí)耐藥菌株[11]。四環(huán)素類藥物的抗藥性普遍存在于細(xì)菌中，其耐藥的主要機(jī)制是抑制蛋白質(zhì)的合成和誘導(dǎo)活性外排系統(tǒng)[12]。APP血清型眾多，根據(jù)報(bào)道目前有20多個(gè)，各血清型之間既無(wú)交叉反應(yīng)，又無(wú)交叉免疫力。市場(chǎng)上現(xiàn)有疫苗菌株大多是單個(gè)血清型或者雙重血清型，預(yù)防效果有限，這就給豬傳染性胸膜肺炎的防控帶來(lái)了極大挑戰(zhàn)。

APP是豬細(xì)菌病中最重要的一種病原菌，世界范圍內(nèi)均有分布。該菌可導(dǎo)致各種年齡段的豬發(fā)病，可引起育肥豬的急性死亡。感染該菌后，病原菌迅速導(dǎo)致豬肺臟纖維素性出血、壞死性胸膜肺炎、胸腔粘連。耐過(guò)的豬肺臟中常有壞死骨片，其含有致命性的載量細(xì)菌，抗生素類藥物很難穿透這種壞死骨片，成為帶菌傳染源，從而引起該病的暴發(fā)。該菌不同菌株的致病力差別較大，高毒力菌株可導(dǎo)致高死亡率[13]。

豬傳染性胸膜肺炎的防控主要依靠嚴(yán)格的生物安全措施、衛(wèi)生防疫制度及疫苗預(yù)防接種。市場(chǎng)上的疫苗主要有滅活疫苗和亞單位毒素疫苗[14]。由于本病原的血清型較多，互相之間的交叉免疫能力差，各血清型之間交叉保護(hù)性不強(qiáng)。豬感染APP后應(yīng)及早采取藥物治療，抗生素的選擇需要依據(jù)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果和現(xiàn)場(chǎng)藥物使用情況而定。

本研究結(jié)果表明，分離鑒定的85株APP對(duì)四環(huán)素類藥物耐藥基因tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tet1、tetL2的耐藥率分別為78.8%、41.2%、15.3%、8.2%、21.2%、15.3%、43.5%、24.7%、30.6%，tetL1全部陰性，未檢出其他耐藥基因。APP對(duì)四環(huán)素的耐藥率最高為76.5%，其他依次為金霉素、美他環(huán)素、多西環(huán)素、土霉素、米諾霉素和替加環(huán)素，藥敏試驗(yàn)結(jié)果與耐藥基因基本一致。本研究就APP對(duì)四環(huán)素類抗生素的耐藥性及耐藥基因進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，為抗生素的應(yīng)用和新藥研發(fā)及臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。