吳憶春
(濱州職業(yè)學院生物工程學院,山東 濱州 256603)
禽流感(avian influenza,AI)是由禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)引起的一種高度接觸性傳染病,可感染各種家禽和野禽。根據AIV致病性的不同可分為高致病性禽流感病毒和低致病性禽流感病毒,其中H9亞型AIV屬于低致病性禽流感病毒[1]。H9病毒最早于1966年在患有溫和呼吸道癥狀的火雞中首次分離出來,我國最早于1994年由陳伯倫等[2]在蛋雞產蛋量下降14%~75%的廣東雞場中首次分離。雖然H9亞型AIV對禽類造成的臨床癥狀較溫和,但其可以引起免疫抑制[1,3],常常與其他致病原混合感染加重疫病的危害程度,例如與大腸桿菌[4-5]、沙門菌[6]、呼腸孤病毒[7]等致病原的混合感染均對養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損失。H9亞型AIV能與其他亞型AIV進行基因重組形成新型重組病毒[1,8],例如2013年以來國內發(fā)生的人感染H7N9高致病性禽流感病毒中,H9亞型AIV即向H7N9高致病性禽流感病毒提供了內部基因[9],因此H9亞型AIV對公共衛(wèi)生安全可造成不容忽視的潛在威脅。H9亞型AIV經過數十年的遺傳演化,目前已成為我國當前AIV流行的主要亞型,加強對H9亞型AIV流行毒株的分離鑒定和致病性研究對我國AI綜合防控具有重要的理論和現實指導意義。鑒于此,本研究對山東地區(qū)疑似H9亞型AIV感染的3份病料進行了病毒分離、HA基因序列分析、致病性分析、交叉保護性分析等系列試驗研究,最終獲得了3株H9亞型AIV流行毒株,為探討我國H9亞型AIV流行與遺傳變異規(guī)律,研究H9亞型AIV抗原差異性,指導H9亞型AIV免疫預防工作奠定了基礎。
SPF雞、SPF雞胚均購自濟南斯帕法斯家禽有限公司。
病毒基因組RNA提取試劑盒為AXYGEN公司產品;一步法RT-PCR擴增試劑盒、pMD18-T載體均為寶生物工程(大連)有限公司產品;柱式離心式DNA凝膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒均為生工生物工程(上海)股份有限公司產品;禽流感(H9亞型)滅活疫苗(NJ01株)為山東綠都生物科技有限公司產品。
對3份山東地區(qū)(濱州、東營、濰坊各1份)疑似H9亞型禽流感病毒感染的病料,無菌采集病死雞的氣管、肺臟、腎臟等病變組織,按1∶3比例加入滅菌生理鹽水溶解、搗碎、碾磨,研磨后的組織勻漿經12 000 r/min離心15 min,吸取上清液經0.45 μm 濾膜過濾,濾液即為處理后的臨床病料樣品,用于后續(xù)的RT-PCR檢測和病毒分離試驗。
取處理后的臨床病料樣品2.0 mL,接種10日齡SPF雞胚10個,0.2 mL/胚,接種后每天照胚觀察雞胚死亡情況,舍棄24 h內死亡胚,將24~120 h死胚放置4 ℃冰箱保存,120 h后收集死亡雞胚尿囊液,并觀察雞胚的病變情況。按照同樣的試驗方法在雞胚上連續(xù)傳三代,無菌收集雞胚尿囊液,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
取分離毒株的第三代雞胚尿囊液,按照常規(guī)微量血凝試驗操作方法測定其對1%雞紅細胞的凝集效價。
取分離毒株的第三代雞胚尿囊液,利用滅菌生理鹽水將其依次作10倍系列稀釋,每一個稀釋度尿囊腔接種5枚10日齡SPF雞胚,0.1 mL/胚,37 ℃孵育觀察120 h,24 h以內的死胚棄去不計,記錄24~120 h各稀釋度雞胚死亡情況。至120 h將全部雞胚解剖,死胚與活胚均測定其對1%雞紅細胞的凝集效價,凝集效價大于等于1∶128即判為感染,按照Reed-Mench方法計算分離毒株的EID50。
1.7.1 引物設計
根據GenBank中H9亞型AIV基因序列設計合成擴增HA基因全長引物,引物序列為H9-F:5′-ATGGAGACAGTATCAC-3′,H9-R:5′-TTATATACAAATGTTG-3′,預期擴增片段大小約為1 683 bp。
1.7.2 HA基因PCR擴增
分別取3個分離毒株的第三代雞胚尿囊液200 μL,用病毒基因組RNA提取試劑盒提取病毒基因組RNA。利用一步法試劑盒擴增HA基因,反應體系為:2×Buffer 25 μL,上、下游引物各1 μL(20 μmol/L),酶1 μL,RNA 10 μL,補水至50 μL。一步RT-PCR反應程序為:50 ℃ 60 min;95 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s,52 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,30個循環(huán);72 ℃ 10 min。RT-PCR擴增結束后經核酸電泳觀察擴增片段大小。
1.7.3 HA基因遺傳變異特征
利用膠回收試劑盒對RT-PCR擴增的目的片段進行回收純化,回收產物連接至pMD18-T克隆載體,連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,利用質粒小量提取試劑盒提取重組質粒,克隆質粒分別命名為pMD-BZ、pMD-DY、pMD-WF,利用BamHⅠ、XhoⅠ進行雙酶切鑒定,鑒定正確的重組質粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序測定。下載GenBank中登錄的部分H9亞型AIV HA基因序列,利用DNAStar生物學軟件將分離毒株HA基因測序結果與GenBank中登錄的H9亞型AIV HA基因序列進行核苷酸同源性比較分析,并構建系統(tǒng)進化樹。
將40只14日齡SPF雛雞隨機分為4組(A、B、C、D),每組10只SPF雛雞,A、B、C組的10只SPF雛雞以點眼、滴鼻方式分別接種3個分離毒株,0.2 mL/只,D組的10只SPF雛雞以點眼、滴鼻方式接種滅菌生理鹽水,各處理組分別置于不同隔離器中隔離飼養(yǎng),觀察至14 d,每日觀察SPF雛雞的精神狀態(tài)、食欲以及呼吸道臨床癥狀,記錄發(fā)病和死亡情況。
將分離毒株用終濃度為0.1%的甲醛滅活后,以1∶3的比例加入油相中,中速混合均勻后高速乳化,制備成油乳劑滅活疫苗。將150只21日齡SPF雛雞隨機分為5組,每組30只雛雞,1~3組試驗雛雞分別胸部肌肉注射3個分離毒株制備的滅活疫苗,0.2 mL/只;第4組試驗雛雞胸部肌肉注射禽流感(H9亞型)滅活疫苗(NJ01株),0.2 mL/只;第5組試驗雛雞注射滅菌生理鹽水,0.2 mL/只。至免疫后21 d,將每組的30只雞隨機分為3個小組,每個小組10只,3個小組分別攻擊3個分離毒株。至攻毒后5 d,逐只采集各處理組SPF雛雞的喉拭子和泄殖腔拭子,按照1.3的方法對采集的拭子進行處理,按照1.4和1.5的方法對處理后的拭子接種SPF雞胚進行病毒分離和血凝性測定,通過病毒分離結果確定試驗雛雞的排毒情況,分析不同分離毒株與商品化疫苗的交叉保護情況。
3份臨床病料樣品接種SPF雞胚后,SPF雞胚均在接種后72~96 h全部死亡,無菌收集第三代雞胚尿囊液,分別命名為BZ株、DY株和WF株。
取分離毒株的第三代雞胚尿囊液,按照常規(guī)微量血凝試驗操作方法測定BZ株、DY株和WF株分離毒株對1%雞紅細胞的凝集效價分別為10log2、11log2和10log2。
按Reed-Muench法測定BZ株、DY株和WF株分離毒株對SPF雞胚的EID50分別為10-8.83/mL、10-9.50/mL和10-9.0/mL。
如圖1所示,BZ株、DY株和WF株的HA基因RT-PCR擴增產物在1 683 bp處出現特異性擴增條帶,擴增片段大小均與預期相符。如圖2所示,克隆質粒pMD-BZ、pMD-DY、pMD-WF經BamHⅠ、XhoⅠ酶切后的酶切產物均具有大小為1 683 bp的特異性條帶,與預期結果完全一致。HA基因核苷酸同源性比較和系統(tǒng)進化樹分析分別如圖3、圖4所示,綜合比較3個H9亞型AIV分離毒株與2010—2018年的部分H9亞型AIV分離毒株的基因組序列,BZ株、DY株、WF株分離毒株與2018年分離自上海的幾株AIV(MK552788.1、MK552797.1、MK552786.1、MK053846.1、MK552795.1)親緣關系較近,進化樹處于同一分支。BZ株與DY株核苷酸同源性較高,達99.8%;WF株與BZ株核苷酸同源性達98.6%;WF株與DY株核苷酸同源性達98.5%。BZ株、DY株、WF株與2011年分離自廣西的JF715044毒株同源性均較低,核苷酸同源性分別為86.8%、86.8%和87.0%,BZ株、DY株、WF株與大部分H9亞型AIV核苷酸同源性在93.6%~98.6%之間,從分子水平鑒定3株分離毒株均為H9亞型禽流感病毒。
M. DL2000 Marker;1. BZ株;2. DY株;3. WF株;4. 陰性對照圖1 HA基因RT-PCR擴增結果
M. DL2000 Marker;1. BZ株;2. DY株;3. WF株圖2 重組質粒酶切鑒定結果
圖3 分離毒株HA基因核苷酸同源性比較
注:?表示本試驗分離株圖4 分離毒株HA基因系統(tǒng)進化樹分析
各處理組試驗雛雞的發(fā)病和死亡情況如表1所示,DY株攻擊的10只試驗雛雞在攻毒后第3天即有部分SPF雛雞表現出精神沉郁、食欲下降、以及咳嗽、噴嚏、甩頭等呼吸道癥狀,隨后癥狀逐漸加重,并伴隨有綠色糞便排出,至攻毒后第8 天呼吸道癥狀逐步減輕,精神和食欲逐步恢復正常。DY株病毒攻擊的10只試驗雛雞均發(fā)病,其中嚴重呼吸道癥狀發(fā)病率和輕微呼吸道癥狀發(fā)病率分別為70%和30%。BZ株、WF株攻擊的10只試驗雛雞也有精神沉郁、食欲下降、以及咳嗽、噴嚏、甩頭等呼吸道癥狀,但均較DY株攻毒雞臨床癥狀輕。BZ株、WF株攻擊雛雞后的發(fā)病率分別為80%和90%,嚴重呼吸道癥狀發(fā)病率分別為10%和20%,輕微呼吸道癥狀發(fā)病率均為70%。3個分離毒株攻擊的試驗雛雞均未出現死亡,表明BZ株、DY株、WF株均為低致病性毒株,其中DY株的致病性稍微強于BZ株和WF株。
表1 試驗雛雞發(fā)病和死亡情況
如表2所示,生理鹽水免疫組的30只試驗雛雞經3株分離毒株分別攻擊后,均能分離到病毒。在4個滅活疫苗免疫組中,只有禽流感(H9亞型)滅活疫苗(NJ01株)經DY株攻擊后有1只雛雞能分離到病毒,其余雛雞經3株分離毒株分別攻擊后均未能分離到病毒,說明3株分離毒株彼此之間均具有100%的交叉保護力,禽流感(H9亞型)滅活疫苗(NJ01株)對BZ株、WF株均具有100%的交叉保護力,對DY株具有90%的交叉保護力。研究表明,當前商品化H9亞型禽流感滅活疫苗對H9流行毒株仍具有較好的免疫保護效果。
表2 拭子病毒分離結果
AIV屬于正黏病毒科A型流感病毒屬,基因組包括8個單股負鏈RNA,依次編碼聚合酶蛋白PB2、PB1、PA,血凝素蛋白(HA),核蛋白(NP),神經氨酸酶(NA),基質蛋白(M)和非結構蛋白(NS),其中HA蛋白是病毒最主要的2種表面糖蛋白之一,在AIV復制過程中起關鍵作用,直接參與AIV的致病過程,是AIV的主要毒力因子和保護性抗原。根據HA抗原性的不同可將AIV分為18種HA亞型(H1~H18)[10-12]。近年來H9亞型AIV疫苗免疫雞群仍然不斷發(fā)生H9亞型AIV感染,使得該亞型AIV的變異性研究成為熱點。研究學者陸續(xù)進行了不同地區(qū)H9亞型AIV流行毒株HA基因的遺傳變異監(jiān)測。高緒慧等[13]對2017年山東地區(qū)16株H9亞型AIV流行毒株HA基因進行同源性分析,結果發(fā)現核苷酸序列同源性為91.2%~99.8%,氨基酸同源性為93.6%~100.0%,表明山東地區(qū)H9亞型AIV發(fā)生了部分新的遺傳進化。萬永虎等[14]對2015—2017年貴州省13株H9亞型AIV流行毒株HA基因進行遺傳變異分析,證實均屬于DK/HK/Y280/97分支,但HA基因核苷酸和氨基酸序列同源性分別為96.1%~99.9%和95.7%~100%,病毒一直處于不斷的變異之中。仇微紅等[15]對2013—2018年中國部分地區(qū)分離的69株H9亞型AIV的HA基因進行分析,69株毒株屬于H9.4.2.5分支,核苷酸相似性為83.7%~99.9%,氨基酸相似性為85.8%~99.9%,與現有疫苗毒株核苷酸同源性存在較大的差異。本試驗結果表明3株H9亞型AIV分離毒株與2018年上海分離毒株親緣關系較近,HA基因核苷酸同源性較高,而與2011年廣西分離毒株同源性較低,表明H9亞型AIV分離毒株HA基因呈現區(qū)域性分化的特點,其在我國隨著流行時間發(fā)生了較大遺傳分化。
H9亞型AIV分離毒株HA基因序列的變異是否引起分離毒株致病性的增加,以及現有商品化疫苗對流行毒株是否具有保護效果,這是對當前指導H9亞型AIV綜合防控工作最為重要的。本研究交叉保護性試驗結果顯示,3株分離毒株彼此之間均具有100%的交叉保護效果,商品化的禽流感(H9亞型)滅活疫苗(NJ01株)對3株分離毒株的保護效果達90%~100%,說明當前商品化H9亞型AIV滅活疫苗對流行毒株仍然具有良好的免疫保護效果,也在一定程度上說明現有商品化疫苗能夠滿足H9亞型AIV流行毒株的疫病防控要求。對于當前H9亞型AIV疫苗免疫養(yǎng)殖場仍然發(fā)生H9亞型AIV流行的情況,分析可能與飼養(yǎng)管理不當、疫苗質量下降、免疫程序不合理、注射方法不準確、免疫抑制病感染等因素密切相關,而不能完全歸結于H9亞型AIV流行毒株發(fā)生變異引起的免疫失敗。