華利忠，黨海斌，馮志新，袁廳，張磊，劉蓓蓓，甘源，韋艷娜，邵國青*

(1. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程重點(diǎn)實驗室/江蘇省生物獸藥篩選服務(wù)平臺，江蘇 南京 210014；2. 南昌勃林格殷格翰動物保健有限公司，江西 南昌 330000)

新城疫(Newcastle disease，ND)、傳染性支氣管炎(infectious bronchitis, IB)和雞滑液囊支原體(Mycoplasmasynoviae，MS)感染是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的3種疫病，均呈世界流行[1-3]。流行病學(xué)調(diào)查顯示上述3種疫病病原經(jīng)常出現(xiàn)混合感染[4-5]，增加了臨床防控的難度。目前，新支二聯(lián)活疫苗被廣泛用于防治新城疫和傳染性支氣管炎。然而因混合感染[6]、聯(lián)合免疫[7]等各種因素的干擾，臨床上新支二聯(lián)活疫苗經(jīng)常出現(xiàn)免疫失敗，從而導(dǎo)致疾病的暴發(fā)。雞滑液囊支原體感染會降低雞群免疫力，造成飼料利用率低、生長發(fā)育緩慢、淘汰率增加等[6]。由于抗生素耐藥性的增加，疫苗免疫對雞滑液囊支原體病防治起著至關(guān)重要的作用。雞滑液囊支原體活疫苗(MS-H株)是目前國內(nèi)唯一一個商品化雞滑液囊支原體活疫苗，可預(yù)防及明顯減少M(fèi)S感染引起的臨床癥狀[8]，免疫效果顯著。由于新城疫、傳染性支氣管炎和雞滑液囊支原體混合感染的普遍存在，多數(shù)雞場不得不面臨需要同時免疫上述2種疫苗的情況。然而同時免疫新支二聯(lián)活疫苗和MS-H活疫苗，是否會造成相互干擾而影響免疫效力還未見報道。本試驗利用1日齡SPF雞，通過對2種疫苗聯(lián)合免疫以及新支二聯(lián)活疫苗單獨(dú)免疫的免疫效果的比較，探討同時免疫M(jìn)S-H活疫苗是否會影響新支二聯(lián)活疫苗的免疫效力。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株和毒株

試驗用疫苗新支二聯(lián)(威支靈)，2 000只/瓶，批號：19VGIB004，由勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司提供。傳染性支氣管炎病毒(IBV)M41強(qiáng)毒株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存提供，-80 ℃保存，雞胚半數(shù)感染量(EID50)的效價為106.4/0.1 mL。試驗用MS-H活疫苗，購自澳大利亞生物資源公司，1 000羽/瓶，批號：MSH190121A。

1.2 SPF雞

100個SPF雞胚購自濟(jì)南斯派福瑞禽業(yè)科技有限公司，孵化后選用70只健康1日齡SPF雞用于本次試驗。

1.3 試驗設(shè)計

將70只1日齡健康SPF試驗雞隨機(jī)分為4組，每組20只，具體分組情況詳見表1。其中新支二聯(lián)苗(威支靈)右眼點(diǎn)眼免疫為1頭份(30 μL/只)，MS-H活疫苗左眼點(diǎn)眼免疫1頭份(30 μL/只)，IBV M41點(diǎn)眼攻毒50 μL/只(含104EID50的IBV M41)。

表1 試驗分組及操作流程

1.4 臨床觀察及記錄

每日觀察各組雞臨床癥狀、發(fā)展變化，詳細(xì)記錄試驗雞精神、采食、呼吸、排便等情況。

1.5 血凝抑制試驗(HI)檢測血清NDV抗體

于試驗第21天翅靜脈采血0.5 mL，分離血清，HI檢測所有試驗雞血清中NDV抗體。HI效價≥3log2判為陽性, <3log2判為陰性。

1.6 剖檢采樣及氣囊病變評分

分別于第26天宰殺全部試驗雞，檢查氣囊，按照1972年Kleven等的方法進(jìn)行試驗雞胸氣囊和腹氣囊的評分。其評分標(biāo)準(zhǔn)為：0分：未發(fā)現(xiàn)肉眼可見的氣囊損傷；1分：可見淋巴濾泡病變或氣囊輕度混濁；2分：氣囊有些增厚，通常有小的干酪樣滲出物聚集；3分：氣囊明顯增厚，透明度下降，有單一氣囊具有大量干酪樣滲出物；4分：氣囊明顯增厚，透明度下降，有2個或2個以上氣囊具有大量干酪樣滲出物。統(tǒng)計具有病變的試驗雞只數(shù)。另外，每組每只雞獨(dú)立工具采集氣管，單獨(dú)包裝，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 氣管IBV再分離試驗

選取所有試驗雞的氣管組織進(jìn)行IBV再分離試驗。方法：以無菌眼科剪刀取一段剪碎放入2 mL離心管中，加1.5 mL滅菌PBS，勻漿制成組織懸液，4 ℃冷凍離心機(jī)12 000 r/min離心10 min，取上清，0.45 μm過濾除菌后用于雞胚接種(如過濾后樣本不足1 mL，滅菌PBS補(bǔ)足1 mL，混勻)。每個氣管樣品接種5個10日齡SPF雞胚，0.2 mL/個，繼續(xù)培養(yǎng)7 d。同時設(shè)置不接種的10個雞胚，作為陰性對照。樣品接種后7 d內(nèi)，每天照蛋1次，剔除接種后24 h內(nèi)死亡雞胚。如果24 h內(nèi)死亡雞胚多于1個，則該樣品結(jié)果無效，須重檢。而有效檢驗的樣品中任一雞胚顯示典型傳支病變，如發(fā)育受阻、蜷曲、腎臟尿酸鹽沉積、結(jié)節(jié)狀絨毛或于接種后2～7 d內(nèi)死亡，則該氣管拭子樣品判為病毒分離陽性。

1.8 RT-PCR檢測

采集死亡雞胚及剖檢雞胚的尿囊液，每個樣品接種5個雞胚尿囊液混樣，提取核酸后根據(jù)劉帆等[9]的方法，利用GenBank中公布的IBV基因序列(GenBank號：KM586818)，針對3′末端的非編碼區(qū)(3′ UTR)的保守區(qū)合成引物，進(jìn)行IBV的RT-PCR檢測。引物為P1：GGAAGATAGGCATGTAGCTT; P2：CTAACTCTATACTAGCCTAT。RT-PCR一步法反應(yīng)條件為：50 ℃ 30 min,；95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

1.9 病理組織觀察

各組試驗雞分別采集一小段氣管，中性福爾馬林固定，制作組織切片，HE染色，觀察病理變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床觀察

整個試驗期間未出現(xiàn)明顯的呼吸困難等臨床癥狀，也沒有出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎、足墊腫脹等臨床變化。但因為腹瀉原因共死亡4只，其中G1組死亡1只，G2組死亡3只。

2.2 HI檢測血清NDV抗體

NDV的抗體檢測結(jié)果見表2。 由表2發(fā)現(xiàn)G1和G2組的陽性率分別為94.74%和100%，其平均效價分別為4.26log2和4.35log2。其余組均未檢測到NDV抗體，陽性率均為0。

表2 血清NDV抗體平均效價和陽性率

2.3 攻毒后剖檢氣囊評分

氣囊評分結(jié)果見表3，由表3發(fā)現(xiàn)除G1組有1只試驗雞出現(xiàn)氣囊氣泡外，其余組均未出現(xiàn)氣囊的病變。

表3 氣囊剖檢評分統(tǒng)計

2.4 氣管組織 IBV再分離及RT-PCR檢測

氣管組織IBV再分離時正常胚和侏儒胚的觀察見圖1，結(jié)果統(tǒng)計見表4。G1和G2組IBV分離陽性樣本均為2個，陽性率分別為10.53%和11.76%，計算保護(hù)率分別為89.47%和88.24%；G3組IBV攻毒對照組陽性數(shù)達(dá)到18個(18/20)，陽性率達(dá)90%；G4組未分離到IBV。說明在本試驗條件下，1日齡SPF試驗雞同時點(diǎn)眼免疫新支二聯(lián)苗(威支靈)和MS-H活疫苗， MS-H活疫苗不影響新支二聯(lián)苗(威支靈)的免疫保護(hù)效率。

圖1 正常胚與侏儒胚體型比較

將每個樣品接種的5枚雞胚的尿囊液收集后進(jìn)行IBV RT-PCR檢測，結(jié)果G3攻毒對照組檢測結(jié)果全為陽性，G4組均為陰性，G1和G2組各有2個樣本為陽性(見表4)，這一結(jié)果與IBV的再分離結(jié)果除G3組外其他一致。本試驗中，RT-PCR檢測方法僅為參考依據(jù)，最終評定新支二聯(lián)苗的免疫效力以氣管組織IBV再分離的結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)。因為RT-PCR只能檢測核酸，不能確定是否為活毒。

表4 氣管組織IBV再分離試驗及RT-PCR檢測結(jié)果

2.5 試驗雞氣管病理組織學(xué)觀察

剖檢時，每組采集氣管，福爾馬林固定，進(jìn)行組織學(xué)觀察。結(jié)果G3 IBV攻毒對照組出現(xiàn)了明顯的IBV特征性病理變化，包括：氣管黏膜絨毛脫落消失，氣管上皮細(xì)胞出現(xiàn)胞內(nèi)包涵體，固有層出現(xiàn)漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤。G1混合免疫組和G2新支二聯(lián)免疫組以及G4空白對照組均未出現(xiàn)明顯的病理變化(見圖2)。

A. G1組；B. G2組；C. G3組；D. G4組圖2 各組試驗雞氣管組織病理學(xué)觀察(200×)

3 討論

多項研究顯示新支二聯(lián)苗的免疫效力會受到各種因素的干擾[10-11]。 為解決此問題，本試驗采用了SPF雞作為試驗動物，排除了其他病原混合感染的干擾。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該疫苗單獨(dú)免疫能夠很好地誘導(dǎo)NDV抗體，抗體陽性率達(dá)到了100%，IBV再分離指標(biāo)顯示保護(hù)率達(dá)到88.24%。和對照組相比，氣管病理學(xué)觀察顯示單獨(dú)免疫組并未出現(xiàn)明顯的IB病理變化，而IBV攻毒組出現(xiàn)了典型的IB病理變化，包括：氣管黏膜絨毛脫落消失，氣管上皮細(xì)胞出現(xiàn)胞內(nèi)包涵體，固有層出現(xiàn)漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤。說明本試驗選用的新支二聯(lián)苗單獨(dú)無干擾免疫，具有較好的免疫保護(hù)效果和較高的安全性。Stephane等[12]對1日齡中國黃羽肉雞進(jìn)行了新城疫與傳染性支氣管炎二聯(lián)弱毒活疫苗(威支靈)免疫保護(hù)試驗，結(jié)果威支靈免疫組表現(xiàn)出了96.7%的高保護(hù)力，與本試驗結(jié)果一致。

Hopkins等[13]在1982年就對IBV和MS的相互干擾做了很多研究，發(fā)現(xiàn)IBV和MS的相互干擾受環(huán)境因素、IBV毒力、暴露時間以及接種途徑的影響，且IBV疫苗免疫較長時間后接觸MS，相互之間沒有干擾。但涉及3種活毒(菌)同時點(diǎn)眼免疫是否有相互干擾還不清楚。本研究通過對比發(fā)現(xiàn)在免疫M(jìn)S-H活疫苗的同時免疫新支二聯(lián)活疫苗，后者誘導(dǎo)的NDV抗體平均效價與單獨(dú)免疫相比差異不顯著。IBV再分離試驗以及再分離時雞胚尿囊液IBV的RT-PCR檢出率也沒有差異，說明MS-H活疫苗免疫并不干擾新支二聯(lián)苗的免疫效力。這一現(xiàn)象可能與MS-H的毒力有關(guān)，MS-H株為親本強(qiáng)毒株86079/7NS化學(xué)誘變而來，其定殖在上呼吸道系統(tǒng)并誘導(dǎo)抗體反應(yīng)，即使在最大劑量下，也未發(fā)現(xiàn)其引起典型的氣囊、關(guān)節(jié)或氣管損傷[14]。Zhu等[15]發(fā)現(xiàn)通過比對親本強(qiáng)毒株以及其他MS毒株發(fā)現(xiàn)MS-H具有獨(dú)特的核苷酸序列，這可能是MS-H株毒力降低的原因。

綜上，在本次試驗條件下，新支二聯(lián)疫苗(威支靈)對IBV M41強(qiáng)毒攻擊具有較好的免疫保護(hù)，保護(hù)率高達(dá)90%左右，且能誘導(dǎo)試驗雞產(chǎn)生較高的NDV抗體；1日齡SPF雞同時免疫新支二聯(lián)活疫苗(威支靈)和MS-H活疫苗，MS-H活疫苗對新支二聯(lián)活疫苗的免疫效力沒有影響。