時菲菲，陳毓，周晨，于生蘭

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動物藥學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

黨參(CodonopsispilosulaNannf.)為桔?？浦参?，主產(chǎn)于山西、陜西、甘肅等地，以根入藥，是我國藥食兩用傳統(tǒng)中藥材，可用于脾肺氣虛、內(nèi)熱消渴、氣短心悸等癥[1]。黨參的活性成分主要有：多糖、皂苷、生物堿類、甾醇類等[2]，其中以多糖含量最高，包括戊糖、己糖及糖醇、糖酸等，黨參多糖不僅具有抗氧化和抗衰老作用，經(jīng)研究還具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和血液系統(tǒng)的作用[3-5]，對黨參多糖的研究已成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)。常見的多糖提取方法主要有熱水浸提法、超聲波輔助提取法[6-7]、微波輔助提取法[8-9]、酶輔助提取法[10-11]及亞臨界提取法[12]等，以上幾種提取方法各有優(yōu)劣。超聲波提取法、微波提取法和亞臨界提取法均需要使用特殊的設(shè)備且物料受熱不均勻，易影響多糖生物活性[13]；酶輔助提取法中的酶活性易受提取條件影響，提取工藝條件較復(fù)雜[14]；熱水浸提法具有提取工藝簡單、成本低、提取條件易控制、不易破壞多糖結(jié)構(gòu)、無需特殊設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。基于熱水浸提法的上述優(yōu)點(diǎn)，同時由于鮮見響應(yīng)面法優(yōu)化熱水浸提法提取黨參多糖的研究報道，本文利用響應(yīng)面法中的Box-Benhnken 試驗(yàn)設(shè)計對黨參多糖熱水浸提提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，同時研究其體外抗氧化活性，為黨參多糖的有效提取提供理論依據(jù)，同時促進(jìn)黨參多糖的開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 黨參和主要試劑

黨參，購自于甘肅省定西市漳縣；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，購自美國Sigma公司；鐵氰化鉀、苯酚、濃硫酸、乙酸鈉等均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 黨參多糖含量測定

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

無水葡萄糖于105 ℃下烘干至恒重，精密稱定10 mg于100 mL容量瓶中，蒸餾水溶解并定容，備用。精密量取上述葡萄糖溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL于20 mL容量瓶中補(bǔ)充蒸餾水至體積為4.0 mL，各容量瓶中分別加入6%的苯酚溶液2.0 mL，搖勻后加入10.0 mL濃硫酸，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液。同法以蒸餾水代替葡萄糖溶液平行配制1份空白溶液，各溶液于室溫下靜置25 min。以空白溶液作為對照，標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液于490 nm波長處測定吸光度。

1.2.2 黨參多糖含量測定

精密稱定10 mg黨參粗多糖樣品于100 mL容量瓶中，以蒸餾水溶解并定容。精密量取黨參多糖溶液0.1 mL于25 mL的容量瓶中，蒸餾水稀釋100倍，加入6%的苯酚溶液2.0 mL，搖勻后加入10.0 mL濃硫酸，搖勻，以空白溶液作為對照，于490 nm波長處測定吸光度，根據(jù)下列公式計算黨參多糖含量。

式中，W：黨參多糖含量；c：葡萄糖質(zhì)量濃度(μg/mL)；n：溶液稀釋倍數(shù)；f：轉(zhuǎn)化系數(shù)0.9；m：黨參多糖樣品質(zhì)量(μg)。

1.3 黨參多糖提取

干燥的黨參根粉碎后蒸餾水浸泡12 h，在適當(dāng)?shù)奶崛囟取⑻崛r間、料液比及提取次數(shù)條件下進(jìn)行提取，于3 000 r/min離心10 min收集上清液，冷凍干燥得黨參多糖。黨參多糖得率=黨參多糖質(zhì)量(g)/黨參根粉末質(zhì)量(g)×100%。

1.4 黨參多糖提取條件單因素試驗(yàn)

在提取溫度為80 ℃、料液比為30、提取1次的條件下考察不同提取時間(1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 h)對黨參多糖得率的影響；在提取時間1.5 h、料液比為30、提取1次的條件下考察不同提取溫度(60、70、80、90、100 ℃)對黨參多糖得率的影響；在提取時間1.5 h、提取溫度80 ℃、提取1次的條件下考察不同料液比(10、20、30、40、50 mL/g)對黨參多糖得率的影響；在提取時間1.5 h、提取溫度為80 ℃、料液比為30 mL/g的條件下考察不同提取次數(shù)(1、2、3、4、5)對黨參多糖得率的影響。

1.5 響應(yīng)面法優(yōu)化黨參多糖提取工藝

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)之上，同時根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計原理，選取提取時間(A)、提取溫度(B)和料液比(C)為試驗(yàn)自變量因素，以提取率(Y)為響應(yīng)值，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)方案，見表1。按照1.3項(xiàng)下提取方法，根據(jù)表1試驗(yàn)方案的提取溫度、提取時間和料液比條件下對黨參進(jìn)行提取。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案

1.6 黨參多糖體外抗氧化活性

1.6.1 清除DPPH自由基能力

參考Shimada 等[15]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。分別配制濃度為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL的黨參多糖水溶液，與等體積的0.15 mmol/L 的DPPH無水乙醇溶液混合，搖勻后避光條件下37 ℃ 水浴30 min，以無水乙醇作對照，在517 nm波長處測定吸光度值。

1.6.2 黨參多糖清除羥基自由基能力

參照Adid等[16]的方法并適當(dāng)改進(jìn)。分別配制濃度為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL的黨參多糖溶液2 mL于試管中，分別等體積加入6 mmol/L 的FeSO4溶液，6 mmol/L的H2O2溶液，搖勻并靜置10 min后加入6 mmol/L的水楊酸溶液2 mL，混合均勻后靜置30 min。同樣方法分別用蒸餾水代替水楊酸和黨參多糖溶液配制對照溶液和空白對照溶液。以蒸餾水為空白于510 nm波長處測定樣品溶液、對照溶液和空白對照溶液吸光度，并根據(jù)下式計算黨參多糖羥基清除率。

式中，A樣品：樣品溶液吸光度；A對照：對照溶液吸光度；A空白對照：空白對照溶液吸光度。

1.6.3 黨參多糖還原力

參照Oyaizu等[17]的方法，采用鐵氰化鉀法測定黨參多糖還原力。分別配制濃度為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL的黨參多糖溶液，分別取各濃度黨參多糖溶液2.5 mL于10 mL離心管中，加入濃度為0.2 mol/L、pH值6.6磷酸緩沖液2.5 mL 和1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，搖勻，置于50 ℃水浴條件下反應(yīng)20 min后，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，于5 000 r/min條件下離心10 min，吸取上清液5 mL于10 mL離心管中，加入0.1%FeCl32.5 mL，搖勻后靜置10 min。以蒸餾水代替FeCl3同樣條件下配制空白溶液，于700 nm波長處測定吸光度。根據(jù)下式計算黨參多糖還原力：

還原力=A0-A1，

式中，A0:樣品吸光度；A1：空白溶液吸光度。

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用Design-Expert.V.8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面分析，利用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行線性回歸，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=683.2X-0.0725，R2=0.997，在0.2～1.2 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可用于多糖含量測定。

2.2 黨參多糖提取條件單因素試驗(yàn)

提取時間：由圖1A可見，在1.5～2.5 h時，隨著提取時間的延長，黨參多糖得率增加，2.5 h后曲線趨于平緩，多糖得率無顯著增加。因此選擇1.5、2.5和3.5 h這3個水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

提取溫度：由圖1B可見，提取溫度60～90 ℃時，多糖得率持續(xù)增加，溫度超過90 ℃后多糖得率幾乎沒有變化。因此選擇80、90和100 ℃這3個水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

料液比：由圖1C可知，料液比為10～20 mL/g時，黨參多糖得率快速增加，繼續(xù)增大料液比，黨參多糖得率基本保持不變。因此選擇料液比為10、20和30 mL/g這3個水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

提取次數(shù)：由圖1D可知，提取次數(shù)對黨參多糖得率無明顯影響，為提高提取效率，將提取次數(shù)固定為1次。

圖1 提取時間(A)、提取溫度(B)、料液比(C)和提取次數(shù)(D)對黨參多糖得率的影響

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化黨參多糖提取工藝

2.3.1 模型的建立與檢驗(yàn)

以提取時間(A)、提取溫度(B)、料液比(C)為變量，黨參多糖提取率(Y)為考察指標(biāo)，利用Design-Expert.V. 8.0.6.1軟件中Box-Behnken組合設(shè)計法進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.3.2 黨參多糖提取率響應(yīng)面回歸模型的建立及顯著性分析

利用Design-Expert.V. 8.0.6.1軟件對表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合，得到擬合模型公式為：Y=15.4-0.87A-0.49B+1.69C-0.2AB-0.84AC+0.83BC-2.81A2-0.84B2-2.41C2，對建立的黨參多糖提取率響應(yīng)面回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。模型的F值和P值分別為20.21和0.000 3，P<0.05達(dá)到顯著水平，方差分析模型失擬項(xiàng)P=0.201 7>0.1，表明模型失擬不顯著，建立的二次模型可用以分析和預(yù)測黨參多糖提取率，可信度較高。相關(guān)系數(shù)R2=0.962 9，擬合模型的調(diào)整R2(AdjR2)=0.915 3，兩者較接近，說明該模型預(yù)測情況與實(shí)際情況接近，擬合度良好。表3中對回歸模型系數(shù)的顯著性結(jié)果分析顯示，一次項(xiàng)A、C以及二次項(xiàng)A2、B2系數(shù)的顯著性均小于0.05，對提取率影響顯著，表明A、C是黨參多糖提取過程中的重要影響因素，A2、B2對最終結(jié)果影響顯著，而交互作用系數(shù)均大于0.05，表明交互作用關(guān)系相對較弱，對最終結(jié)果無顯著影響。3個影響因子對黨參多糖提取的影響大小順序?yàn)镃(料液比)>A(提取時間)>B(提取溫度)。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析

2.3.3 黨參多糖提取等高線圖和三維響應(yīng)面圖分析

各因素交互作用等高線及響應(yīng)面如圖2。各因素交互作用越顯著則等高線形狀越接近于橢圓形，而交互作用越不顯著則等高線形狀越接近于圓形[18]。由圖2以看出AB、AC、BC的交互作用等高線均呈橢圓形，但AC和BC交互作用形成的橢圓形趨勢更明顯，說明AC和BC交互作用更顯著，這與方差分析結(jié)果一致，AC和BC交互作用的P值分別為0.061 9和0.063 7，接近顯著水平。響應(yīng)面坡度越陡，說明條件改變對響應(yīng)值影響越大,由圖2可見，黨參多糖的提取率隨著料液比和提取時間的降低先緩慢增加，到達(dá)最高點(diǎn)后急劇下降，形成較陡的坡度，說明提取率對料液比和提取時間的改變較為敏感，這與方差分析結(jié)果相一致。

圖2 交互作用對黨參多糖提取率的影響

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面法建立的模型預(yù)測黨參多糖最佳提取工藝條件為：提取時間2.29 h、提取溫度89.14 ℃、提取料液比23.72 mL/g，在此條件下黨參多糖的提取率預(yù)測值為15.83%。為驗(yàn)證所建立模型的可靠性，根據(jù)操作的可行性對預(yù)測工藝條件稍作調(diào)整：提取時間2.3 h、提取溫度89 ℃、提取料液比24 mL/g。在調(diào)整后的工藝條件下進(jìn)行提取試驗(yàn)，平行提取3次，測得黨參多糖的提取率為(15.66±0.04)%，與模型預(yù)測值較為接近，說明優(yōu)化方法及建立的模型可靠，預(yù)測性良好。

2.4 黨參多糖抗氧化性

2.4.1 清除DPPH自由基能力

由圖3可知，VC對DPPH的清除作用強(qiáng)于黨參多糖。黨參多糖對DPPH的清除作用呈濃度依賴型，在0.25～4.0 mg/mL范圍內(nèi)隨著濃度的升高清除作用增強(qiáng)顯著，質(zhì)量濃度大于4.0 mg/mL后，清除作用增強(qiáng)緩慢，濃度在8.0 mg/mL清除率在90%以上，接近于VC對DPPH的清除作用。對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行線性擬合得出回歸方程為：Y=20.539lnX+51.393，R2=0.990 8，根據(jù)回歸方程計算出黨參多糖對DPPH半清除率IC50為0.93 mg/mL。

圖3 黨參多糖對DPPH自由基清除率

2.4.2 黨參多糖清除羥基自由基能力

由圖4可知，在0.25～8.0 mg/mL范圍黨參多糖對羥基自由基清除能力隨著濃度的增大而增大，當(dāng)質(zhì)量濃度為8.0 mg/mL時，清除率達(dá)到86.88%，對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行線性擬合得出方程為：Y=5.7324X+46.276，R2=0.969 1，根據(jù)方程計算出黨參多糖對羥基自由基的半清除率IC50為 0.65 mg/mL。

圖4 黨參多糖對羥基自由基清除率

2.4.3 黨參多糖還原力

還原力測定可以作為評價氧化還原活性的重要指標(biāo)，還原劑可以通過自身的還原能力清除自由基，將Fe3+還原為Fe2+，再進(jìn)一步與FeCl3發(fā)生反應(yīng)，生成在700 nm波長處有吸收的產(chǎn)物，還原力越強(qiáng)則吸光度越大。由圖5可知，黨參多糖還原力遠(yuǎn)弱于VC，但其還原力與自身濃度呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.97，當(dāng)濃度為8.0 mg/mL時，還原力達(dá)到0.85。

圖5 黨參多糖還原能力

3 討論

植物多糖是一類極性較強(qiáng)的大分子化合物，種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，主要存在于細(xì)胞壁中，且易溶解于水中，不溶解于有機(jī)溶劑，故在植物多糖的提取中多以水作為溶劑，通過加熱的方法加速多糖的釋放，但提取溫度、提取時間、料液比等因素對多糖提取率影響較大，合理的熱水浸提提取條件可以有效提高多糖的提取率。利用酸、堿、酶、超聲、微波等手段可有效破解細(xì)胞壁從而有效提取植物多糖，但這些方法同時會引起多糖的降解、分子結(jié)構(gòu)改變等。本研究利用熱水浸提法，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上確定了響應(yīng)面法關(guān)鍵因子及水平，并根據(jù)Box-Behnken 原理設(shè)計3因素3水平試驗(yàn)方案，通過響應(yīng)面分析法對黨參多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，在提取時間2.3 h、提取溫度89 ℃、提取料液比24 mL/g的條件下，黨參多糖的提取率為(15.66±0.04)%，與模型預(yù)測值較為接近，說明優(yōu)化方法及建立的模型可靠，預(yù)測性良好。郜普源等[19]采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化貴州木霉 NJAU4742 產(chǎn)木聚糖酶，優(yōu)化后胞外蛋白產(chǎn)量提高了1.5倍，而木聚糖酶產(chǎn)量提高了1.25 倍，說明該方法對于優(yōu)化菌株產(chǎn)酶也是有效的。

不同提取方法獲得的多糖抗氧化活性存在一定差異，多種檢測方法可系統(tǒng)反映抗氧化情況，自由基的清除能力和還原力測定是體外抗氧化能力評價中廣泛采用的評價指標(biāo)。本試驗(yàn)組合了不同體外檢測方法，獲得了黨參多糖清除DPPH自由基能力、清除羥基自由基能力和還原力。黨參多糖對DPPH自由基和羥基自由基有較強(qiáng)的清除能力，對2種自由基的半清除率IC50分別為0.93 mg/mL和0.65 mg/mL。當(dāng)黨參多糖濃度達(dá)到8.0 mg/mL時清除率達(dá)到90%以上和86%以上；而還原力與自身濃度呈正相關(guān)，當(dāng)濃度為8.0 mg/mL時，還原力達(dá)到0.85。綜上，黨參多糖具有良好的抗氧化活性，后續(xù)試驗(yàn)將進(jìn)一步對黨參多糖進(jìn)行純化分離，深入研究其結(jié)構(gòu)及藥用價值。