孟國慶，張順響，黃一鳴，王宜磊

(菏澤學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院, 山東 菏澤 274015)

引言

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndrews)，芍藥科植物，有3 000年的種植歷史.牡丹不僅作為一種觀賞性花卉，同時(shí)也是珍貴的中草藥材，深受人們喜愛.而山東菏澤是牡丹的主要產(chǎn)出地之一，2019年牡丹種植總規(guī)模達(dá)到49萬畝，被譽(yù)為世界上最大的牡丹生產(chǎn)基地[1].另外，由于牡丹籽的高含油量，油用牡丹在菏澤地區(qū)被作為木本油料植物[2]種植，種植規(guī)模達(dá)到了15萬余畝.

牡丹作為多年生落葉灌木植物， 根部病害會(huì)因?yàn)橥寥乐胁≡⑸锏姆e累而越來越嚴(yán)重.其中，由茄病鐮孢菌(Fusariumsolani)引起的根腐病就是牡丹根部病害的一種，根腐病會(huì)造成牡丹植株矮小，葉片發(fā)黃，地下根系發(fā)黑腐爛，引起牡丹植株的枯萎死亡.每年因根腐病害給牡丹種植業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，種植年限的增加是引起牡丹根腐病發(fā)病率增高的重要原因之一[3].

目前，對(duì)牡丹根腐病防治的主要方法為農(nóng)藥噴抹，但防治效果不佳，而且殘留的農(nóng)藥會(huì)對(duì)自然界的生態(tài)平衡造成嚴(yán)重的破壞.在環(huán)保和安全成為時(shí)代主題的今天，綠色無污染的生物防治方法成為防治各種植物病蟲害的首要選擇.

據(jù)報(bào)道，對(duì)煙草疫霉[4]、大豆炭腐病[5]等植株病害的生物防治，是從植株病害附近進(jìn)行病原菌的拮抗菌和根際促生菌[6]的篩選分離后，研發(fā)專用菌劑或菌肥，且取得了較好的實(shí)用效果.目前應(yīng)用于植物根腐病的生物防治菌株主要包括三大類：細(xì)菌、真菌和放線菌.在關(guān)于解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)[7]的報(bào)道中，研究者發(fā)現(xiàn)了解淀粉芽孢桿菌對(duì)苦瓜枯萎病(Cucurbitwilt)和稻瘟病(Magnaportheoryzae)等一些植物的真菌病害有不錯(cuò)的防治效果.解淀粉芽孢桿菌可以通過分泌幾丁質(zhì)酶和伊枯草菌素等物質(zhì)拮抗病原真菌類.此外，有研究報(bào)道木霉(Trichodermasp.)[8]對(duì)多種植物真菌病害具有較好的生物防治效果，主要是通過競爭與抗生作用、誘導(dǎo)植物增強(qiáng)抗性作用等生防機(jī)制，對(duì)鐮刀菌 (Fusarium-spp.) 、腐霉菌 (Pythiumspp.)等植物病害真菌產(chǎn)生抑制效果.這證明從植株病原菌所處自然環(huán)境中篩選拮抗菌的方法有效可行.

本實(shí)驗(yàn)通過平板對(duì)歭法篩選牡丹根際土壤中穩(wěn)定、高效拮抗牡丹根腐病原菌的微生物，為生物防治牡丹土傳病害菌肥的開發(fā)與應(yīng)用拓展微生物資源.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土壤

菏澤學(xué)院植物園、曹州牡丹園多年生牡丹發(fā)病植株根際土壤.

1.1.2 供試根腐病原菌

茄腐鐮孢菌(Fusariumsolani)為菏澤學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏并提供的.

1.1.3 實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂20.0 g，補(bǔ)至1 000 mL，pH自然，于112 ℃濕熱滅菌20 min.

LB培養(yǎng)基：NaCl 5.0 g，酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，瓊脂20.0 g，補(bǔ)至1 000 mL ，20% 氫氧化鈉調(diào)pH 至7.2，于121 ℃濕熱滅菌20 min.

淀粉培養(yǎng)基[9]：淀粉水解生化實(shí)驗(yàn).

葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液和糖發(fā)酵培養(yǎng)基[9]：生化實(shí)驗(yàn).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 采集土壤

在菏澤學(xué)院植物園、曹州牡丹園多年生發(fā)病牡丹植株根際附近采集土樣.撥開土層約6 cm采集發(fā)病植株根際土樣，每個(gè)采樣點(diǎn)取樣后，標(biāo)記備用.

1.2.2 土壤稀釋及涂布培養(yǎng)

將取回的土樣烘干過篩，稱取10 g，混勻在已滅菌且裝有90 mL蒸餾水的錐形瓶中，充分搖勻30 min，然后在進(jìn)行梯度稀釋.涂布LB培養(yǎng)基平板，于30 ℃恒溫箱培養(yǎng)，采用三區(qū)劃線法對(duì)菌落分離純化.

1.2.3 拮抗菌篩選

對(duì)分離出的菌落，采用平板對(duì)歭[10]法篩選牡丹根腐病茄病鐮孢菌的拮抗菌.

初篩：以茄病鐮孢菌作為靶標(biāo)菌，點(diǎn)種于PDA平板中心，將分離純化的菌落用牙簽分三點(diǎn)接種于距靶標(biāo)菌周圍25 mm位置，28 ℃恒溫箱培養(yǎng)2～4 d后觀察.點(diǎn)種菌落與靶標(biāo)菌菌落之間存在抑制帶現(xiàn)象或抑制圈，即判定該分離的菌株與牡丹根腐病菌存在生長發(fā)育或繁殖等方面的拮抗效應(yīng).記錄拮抗初篩結(jié)果，開展復(fù)篩工作.

復(fù)篩：重復(fù)平板對(duì)峙試驗(yàn)，將有拮抗效應(yīng)的菌落再次點(diǎn)種于PDA培養(yǎng)基中央靶標(biāo)菌菌落25 mm處，對(duì)稱兩點(diǎn)接種初篩得到的菌株.恒溫箱中28 ℃培養(yǎng)，2～4 d，驗(yàn)證和測量其拮抗效果，并進(jìn)一步做好優(yōu)良拮抗菌株的篩選和優(yōu)化.

1.3 形態(tài)學(xué)和生理生化特征的觀察

在完成對(duì)拮抗菌的初篩和復(fù)篩工作，在超凈工作臺(tái)的環(huán)境中完成在LB培養(yǎng)基上劃線.30 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)72 h，對(duì)菌落的大小與形態(tài)，透明度與顏色等特征記錄.分別參閱《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[11]和《真菌鑒定手冊(cè)》[12]對(duì)分離到的細(xì)菌和真菌進(jìn)行初步鑒定.

1.4 生理生化實(shí)驗(yàn)

參考《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》[9]，對(duì)所篩選的拮抗細(xì)菌菌株R9和菌株R15進(jìn)行革蘭氏染色，芽孢染色及生理生化實(shí)驗(yàn).所有理化實(shí)驗(yàn)均設(shè)置對(duì)照組.

1.5 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.5.1 拮抗細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增和測序

PCR擴(kuò)增過程： 95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s, 72 ℃ 延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min.實(shí)驗(yàn)所用的引物為：P1(5′-AACTGAAGTTTGATCATTCA-3′)和 P2(5′-TACGGTTACCTTGTTACATGCC-3′)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由南京擎科生物科技有限公司完成測序.

1.5.2 序列測定結(jié)果分析

將獲得的16S rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析，并通過軟件MEGA 5.1中的Neighbor-Joining法[13]完成系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建.

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌篩選

根據(jù)菏澤學(xué)院植物園、曹州牡丹園多年生牡丹發(fā)病植株根際采集的土樣.分離純化后得32株不同菌落特征的微生物.以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有牡丹根腐病菌茄病鐮孢菌為靶標(biāo)菌，采用平板對(duì)歭法，初篩共得到3株對(duì)茄病鐮孢菌具有拮抗作用的微生物 (見圖1)，分別為命名為菌株R1、R9、R15.

圖1 菌株的對(duì)歭初篩

進(jìn)一步對(duì)初篩獲得的3株具有良好拮抗性能的菌株進(jìn)行復(fù)篩，并測量抑菌圈直徑，復(fù)篩結(jié)果見表1.

表1 抑菌圈直徑大小測量

2.2 拮抗菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將分離到的3株菌株分別點(diǎn)接或三區(qū)劃線接種到固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并觀察其菌落形態(tài).菌株R1、R9與R15菌落形態(tài)及電鏡照片見圖2，形態(tài)描述見表2.

圖2 3株菌的菌落形態(tài)觀察

表2 3株菌的菌落形態(tài)特征

2.2.2 生理生化鑒定

根據(jù)菌落特征和《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[11]，菌株R9和R15鑒定為細(xì)菌，并對(duì)菌株R9和R15進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3.

表3 生理生化鑒定

生理生化分析結(jié)果顯示，菌株R9和R15均為革蘭氏陽性菌，有芽孢，葡萄糖產(chǎn)酸試驗(yàn)均為陽性.菌株R15具有解淀粉能力，VP實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性，吲哚實(shí)驗(yàn)陰性，而菌株R9不能水解淀粉，VP實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性，吲哚實(shí)驗(yàn)陽性.

2.2.3 菌株R9和R15的分子生物學(xué)鑒定

PCR擴(kuò)增菌株R9和R15 的16S rDNA和測序，并與NCBI數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析.運(yùn)用MEGA 5.1的Neighbor-Joining算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.菌株R9系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖3，菌株R15系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖4.

圖3 菌株R9系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 菌株R15系統(tǒng)進(jìn)化樹

菌株R9的16S rDNA同Bacillussp. BAB 4854和Bacillussp. 6119的相似度分別為99.64%和99.73%，結(jié)合菌株R9的菌落特征將其鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillussp.).

R15菌種經(jīng)16S rDNA序列比對(duì)后，同解淀粉芽孢桿菌(BacillusamyloliquefaciensNBRC 15535)和(BacillusamyloliquefaciensMPA 1034)的序列比對(duì)度100%.但因?yàn)槲刺幱谕环种?，所以表明在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化過程中不同步.和莫海威芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)的16S rDNA序列相似度同樣為100%，但菌株R15和貝萊斯芽孢桿菌(BacillusvelezensisstrainFZB42)、(Bacillusvelezensis-strainCBMB205)同屬一系統(tǒng)進(jìn)化分支，據(jù)此系統(tǒng)進(jìn)化分析，初步鑒定菌株R15為芽孢桿菌屬貝萊斯芽孢桿菌.

根據(jù)菌株R1菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)，參照《真菌鑒定手冊(cè)》初步將其鑒定為木霉屬真菌，后續(xù)借助18S rDNA序列對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，明確其具體種類.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)從菏澤學(xué)院植物園和曹州牡丹園多年生牡丹根際取樣，以茄病鐮孢菌為靶標(biāo)菌，采用平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行拮抗菌株篩選.得到對(duì)牡丹根腐病菌具有拮抗性能的真菌1株、細(xì)菌2株，命名分別為菌株R1、R9和R15.根據(jù)形態(tài)學(xué)特征、生理生化反應(yīng)和系統(tǒng)樹構(gòu)建，分別將菌株R9和R15鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillussp.).根據(jù)菌株R1菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)，初步將其鑒定為木霉屬真菌.

實(shí)驗(yàn)篩選的菌株R15為芽孢桿菌屬的貝萊斯芽孢桿菌，據(jù)報(bào)道能夠定殖于根際成熟區(qū)，產(chǎn)生的非揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)植株根部生長有促進(jìn)作用，是植物根際促生菌[14].木霉屬真菌的生防機(jī)制是通過與植物建立類似菌根真菌的關(guān)系，刺激植物生長，并誘導(dǎo)植物產(chǎn)生拮抗活性物質(zhì)[15].

利用合理的技術(shù)將生物防治菌有效地運(yùn)用到防治植株的病害, 同時(shí)對(duì)環(huán)境不造成污染，是生物菌肥在植株病害防治方面的優(yōu)點(diǎn)，而且生物菌肥對(duì)人畜無害.目前生物菌肥在蔬菜和部分花卉種植業(yè)中得到應(yīng)用，但在牡丹植株病害防治方面卻少有研究資料.這表明我們不僅應(yīng)該研究牡丹植株病害生防菌，而且要開發(fā)生物菌肥的生產(chǎn)工藝，讓具有生防功能的生物菌肥早日運(yùn)用到牡丹的栽培種植中.

實(shí)驗(yàn)研究篩選到的3株拮抗菌為牡丹根腐病的生物防治提供了新的微生物資源.下一步擬研發(fā)成生物菌肥，應(yīng)用到牡丹根腐病害的防治，不僅解決牡丹植株病害方面的問題，也要解決牡丹種植區(qū)土壤經(jīng)過連續(xù)多年種植造成的土壤板結(jié)問題，土壤有害微生物菌落富集和土壤有益菌數(shù)量減少的問題.相信隨著生物菌肥技術(shù)的發(fā)展，牡丹根部病害的問題會(huì)得到有效解決.