申嘉澍，李麟宛，董天雨

(1.北京大學公共衛(wèi)生學院，北京 100000；2.北京大學城市與環(huán)境學院，北京 100000； 3.北京大學生命科學學院，北京 100000)

0 引言

隨著遺傳學研究的不斷深入，科學家們發(fā)現(xiàn)了越來越多的腫瘤標志物，并嘗試通過表觀遺傳學來研究癌癥早期診斷[1,2]。5-羥基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5hmC)是哺乳動物DNA胞嘧啶堿基修飾，大部分位于DNA的轉(zhuǎn)座子上，轉(zhuǎn)座子的重復序列可損害基因組的功能和穩(wěn)定性，當轉(zhuǎn)座子的5hmC修飾減少時，轉(zhuǎn)座子活性在細胞中被激活，易進而損傷DNA，誘發(fā)癌癥[3,4]。近年來，隨著高精確的質(zhì)譜分析技術(shù)不斷發(fā)展，對5hmC的檢測技術(shù)不斷進步，5hmC作為DNA修飾越來越受到重視。本文系統(tǒng)回顧了癌癥早期診斷時5hmC作為腫瘤標志物的理論依據(jù)，總結(jié)了現(xiàn)有5hmC檢測技術(shù)的特點及其局限性，并討論了5hmC未來在癌癥早期診斷方面的發(fā)展趨勢。

1 新興腫瘤標志物——5hmC

1.1 5hmC的生物學合成

早在1972年，5hmC就已經(jīng)在成年大鼠、小鼠以及青蛙腦組織中發(fā)現(xiàn)，但當時并沒有引起足夠的重視，被認為是樣品中氧化反應引起的DNA異常，因而未引起重視。直到2009年，先后兩個研究發(fā)現(xiàn)5hmC在小鼠浦肯野細胞及小腦顆粒細胞中存在，從而引起學者的廣泛關注DNA羥甲基化，即胞嘧啶向5hmC的轉(zhuǎn)化。由5-胞嘧啶合成5-羥甲基胞嘧啶的關鍵分子是TET家族蛋白。哺乳動物DNA胞嘧啶復制后通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMT) 的作用，利用腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)作為甲基供體，在胞嘧啶堿基5位上添加甲基，從而形成5甲基胞嘧啶。而活性DNA脫甲基化途徑可通過TET酶(TET1、2和3)的活性來介導。TET酶是依賴Fe(II)和α-酮戊二酸(α-KG)的雙加氧酶家族[5]。研究證明，TET酶能在培養(yǎng)細胞和體外通過鐵和α-酮戊二酸依賴性方式的氧化催化5甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)換成5-羥甲基胞嘧啶[6,7]。此外，其他通路也與TET酶一起參與了羥基化至5hmC的過程。

1.2 5hmC在人體各細胞和腫瘤細胞中分布

早在1970年代，科學家就發(fā)現(xiàn)了人體中的5hmC，此后在各種組織和細胞類型中都發(fā)現(xiàn)了5hmC[8,9]。人體不同組織之間的5hmC含量有顯著差異，這表明5hmC可以用作細胞或組織類型的標識符[10]。最近應用新研制的5hmC免疫學技術(shù)，確定了5hmC在人體組織中豐度，發(fā)現(xiàn)不同組織之間的5hmC含量有顯著差異。腦組織中5hmC的含量最高(0.67%)，而直腸(0.57%)、肝臟(0.46%)、結(jié)腸(0.45%)和腎臟(0.38%)的含量次之。肺中的5hmC含量相對較低(0.14%)，胎盤中的5hmC含量更低(0.06%)，乳腺中的含量僅為0.05%[11]。研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤細胞中5hmC修飾大量降低，除腦腫瘤外，與腫瘤周圍的正常組織相比，在包括癌性結(jié)直腸組織、肝、腎、肺、骨骼肌、前列腺癌、乳腺癌和黑素瘤等實體瘤中，5hmC水平都降低了很多，甚至在結(jié)腸癌細胞中降低到無法檢測的水平。其他研究人員通過顯示不同類型實體瘤中5hmC的損失證實了這一觀察結(jié)果[12,13]。5hmC分布的這種組織特異性，暗示了其潛在的用來診斷不同器官腫瘤的可能。

1.3 5hmc作為癌癥早期診斷的生物標志物

來自患者血液的表觀修飾5hmC可以作為人類疾病的早期診斷很有價值的生物標志物，因為其概括了相關細胞的基因表達變化。近年來，5hmC逐漸成為了癌癥早期診斷的腫瘤標志物。研究表明，循環(huán)DNA中的5hmC標記可作為不同類型人類腫瘤的表觀遺傳標記[14-16]。針對前列腺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究顯示，5hmC標記水平的降低與不良預后結(jié)局相關[17,18]。低水平的5hmC也是總體生存率和癌癥復發(fā)時間的獨立預后指標[19]。而臨床試驗顯示，5hmC在非小細胞肺癌中聯(lián)合表觀遺傳學診斷的效果優(yōu)異[20]。這些實驗研究結(jié)果是支持5hmC作為癌癥篩查生物標志物的理論依據(jù)。

2 癌癥生物標志物的特異性檢測

2.1 傳統(tǒng)組織活檢與液體活檢

腫瘤組織是鑒定癌癥特異性生物標志物的金標準來源，也是現(xiàn)有癌癥檢測與診斷的最主要手段[21]。然而，由于組織活檢具有侵入性和臨床風險，所以組織活檢具有一些局限。組織活檢通常需要手術(shù)切除獲得腫瘤組織，手術(shù)會帶來出血和感染等風險[22]。除此之外，從單一區(qū)域組織活檢獲得的腫瘤信息具有空間局限性，且可能無法反映腫瘤內(nèi)異質(zhì)性[23]。相比之下，液體活檢作為一種微創(chuàng)工具，在癌癥治療方面具有更大的優(yōu)勢。它采用循環(huán)物質(zhì)如循環(huán)DNA、循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTC)和外泌體來檢測指示癌癥進展的分子變化，在臨床上的應用潛力極大。

2.2 循環(huán)DNA在癌癥診斷中的作用

循環(huán)DNA(circulating free DNA，cfDNA)是癌細胞在轉(zhuǎn)移、死亡時，釋放到患者血液中的DNA。通過檢測循環(huán)DNA與癌癥相關的遺傳改變，如點突變，拷貝數(shù)變異，染色體重排和表觀遺傳畸變[24,25]，可以進行癌癥的早期診斷。cfDNA的發(fā)現(xiàn)為臨床帶來了革命性的潛力[26]，cfDNA中的非侵入性生物標志物比組織活檢具有實質(zhì)性優(yōu)勢，因為它們可觀測到腫瘤組織的完整遺傳標記與表觀遺傳改變，特別是有助于檢測腫瘤發(fā)生和發(fā)展的異常DNA甲基化過程[27,28]。而且，與現(xiàn)有的診斷和預后方法相比，cfDNA分析屬于微創(chuàng)，沒有腫瘤活檢和潛在并發(fā)癥風險，從而為困難或不安全的腫瘤活檢提供了一種分子譜分析替代方法。

2.3 5hmC的檢測

影響人類疾病中5hmC途徑的機制作用仍待探究中，但是它們作為診斷標志物或治療靶標的潛力已經(jīng)得到了領域認可與理論支持。5hmC的傳統(tǒng)檢測方法為DNA甲基化檢測方法?；趤喠蛩釟潲}的全基因組測序和簡并代表性硫酸氫鹽測序(reduced representation bisulfite sequencing，RRBS)是甲基化分析的傳統(tǒng)方法，并已應用于cfDNA的生物標志物發(fā)現(xiàn)[29]。然而，傳統(tǒng)的檢測方法并未將5mC與5hmC區(qū)別開。現(xiàn)階段，高分辨率下繪制5hmC基因組分布圖的創(chuàng)新技術(shù)不斷發(fā)展，可用于5hmC的高效檢測，例如單分子實時測序[30]，TET輔助亞硫酸氫鹽測序[31]，氧化亞硫酸氫鹽測序[32]和AbaSI偶聯(lián)測序[33]?，F(xiàn)有研究已經(jīng)在單核苷酸分辨率下確定了5hmC在胚胎干細胞和大腦中的基因組分布[34]。作為一種重要的表觀遺傳標記，5hmC的超靈敏液體檢測在生物醫(yī)學領域具有極其重要的意義。但是，由于5hmC的含量較低，新發(fā)展的方法必須能夠克服處理過程中樣品損壞和損失的難題，此外，為了提高檢測靈敏度，新發(fā)展的方法必須能夠選擇性富集和擴增5hmC DNA。從富集所得計數(shù)推斷堿基分辨率級別5hmC修飾水平的統(tǒng)計方法可有助于增加對5hmC動態(tài)的了解。

3 5hmC在癌癥診斷中的臨床意義

3.1 5hmC與癌癥表觀遺傳

隨著生物學研究的深入，將5hmC與葡萄糖代謝和癌癥表觀遺傳學聯(lián)系起來，已有報道顯示，cfDNA的全基因組5hmC動態(tài)變化對改善癌癥管理具有臨床意義。目前對5hmC生物標志物發(fā)現(xiàn)的研究主要集中在基因區(qū)域，這些cfDNA來源的5hmC生物標志物比傳統(tǒng)的生物標志物具有更高的檢測靈敏度[35]。已有科學家在組織特異性、癌癥特異性的甲基化區(qū)域觀察到了5hmC的顯著富集[36]，因此，5hmC動力學的全基因組分析進一步完善我們對癌癥和甲基化之間關系的理解。

3.2 5hmC在癌癥診斷中的潛在應用

近年來隨著生活環(huán)境變化，癌癥發(fā)病率一直呈現(xiàn)上升趨勢，發(fā)病年齡也趨于年輕化，因此，癌癥早篩的意義越來越大。5hmC作為潛在的癌癥生物標志物，在癌癥患者的基因組中具有一定的分布與特征，這是5hmC作為癌癥早篩標記的重要依據(jù)。已有研究表明，5hm C生物標志物在乳腺癌的診斷、分子亞型預測中的得到了初步應用[37,38]。5hmC表達水平的下降可以成為胃癌的特異性標志物，這在胃癌早期診斷與預后治療中可發(fā)揮巨大潛力[39]。此外，在一組結(jié)腸癌患者組織研究中，結(jié)腸癌組織5hmC表達明顯低于癌旁組織，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)[40]。由此可見，新型生物標志物5hmC在臨床癌癥診斷中可以發(fā)揮極大的潛力，是未來臨床早癌篩查與癌癥預后的潛在技術(shù)手段。

4 展望

表觀遺傳學的發(fā)展可為癌癥早期診斷提供新思路，具有廣闊的前景。當前的表觀遺傳學療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中已顯示出良好的反應，在實體瘤中的診斷研究也在不斷探索中。毋庸置疑，基于cfDNA的5hmC標記診斷法在癌癥早期診斷中具有重要意義，但由于5hmC檢測過程中存在著各種生物酶的序列依賴性，未來需要開發(fā)針對5hmC的酶促或化學轉(zhuǎn)化方法，能夠以單堿基分辨率針對特定位置的5hmC進行高分辨率檢測。所以，特定于5hmC的替代化學轉(zhuǎn)化方法進行腫瘤早期診斷預計會成為未來研究的重點。

此外，活細胞中5hmC的成像也是未來研究的發(fā)展方向。5hmC的成像對于實時監(jiān)測5hmC在細胞生理和病理過程中的作用具有重要意義。但至今為止，細胞中5hmC的成像研究還很少。發(fā)展基于新型納米材料(例如，金納米粒子和半導體量子點)的生物傳感器，有望突破活細胞中5hmC成像研究的瓶頸，完成5hmC的實時監(jiān)測。