柴利萍

(河南護(hù)理職業(yè)學(xué)院，河南 安陽(yáng) 455000)

近些年來(lái)，分光光度法憑借其靈敏度較高、準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)便、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)已成為食品、藥品等領(lǐng)域分析的重要常規(guī)手段之一。隨著各種新型顯色劑的出現(xiàn)和發(fā)展，特別是各種聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用，使得分光光度分析技術(shù)又有了新的進(jìn)展。

1 雙波長(zhǎng)分光光度法

以單波長(zhǎng)分光光度法為基礎(chǔ)，隨著新試劑、新技術(shù)的發(fā)現(xiàn)和使用，逐步發(fā)展出各種新的分光光度法技術(shù)，能更好的解決測(cè)定中遇到的如試樣渾濁、多組分測(cè)定困難等各種問(wèn)題。雙波長(zhǎng)分光光度法是在單位時(shí)間內(nèi)用兩條不同波長(zhǎng)的單色光以一定頻率交替照射同一吸收池的溶液，然后經(jīng)過(guò)檢測(cè)器和電子控制系統(tǒng)，計(jì)算出這兩個(gè)波長(zhǎng)下吸光度的差值ΔA與被測(cè)物質(zhì)的濃度的正比關(guān)系。與單波長(zhǎng)分光光度法要求試樣透明、無(wú)渾濁相比，雙波長(zhǎng)分光光度法具有靈敏度高、準(zhǔn)確度和精密度好、多組分同時(shí)測(cè)定、能進(jìn)行高濃度溶液和渾濁溶液樣品的分析等優(yōu)點(diǎn)。

如王芳等[1]發(fā)現(xiàn)，在pH=3.0～6.5的Tris-HCl緩沖溶液中，呋塞米與維多利亞藍(lán)B(VB)反應(yīng)生成具有明顯正、負(fù)吸收峰的離子締合物，其最大正吸收波長(zhǎng)位于625 nm，最大負(fù)吸收波長(zhǎng)位于655 nm，采用雙波長(zhǎng)疊加法測(cè)定，表觀系數(shù)ε為2.46×104 L /(mol·cm)，檢出限為0.045 mg/L，呋塞米在0.27～5.0 mg/L的濃度范圍內(nèi)符合比爾定律，其回歸方程為A=0.007 97+0.072 05c (c∶mg/L)。方法用于市售呋塞米藥物、人體血液及尿液中呋塞米含量的測(cè)定，回收率為97.9%～104%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～2.5%。方法簡(jiǎn)便易行，有較高的準(zhǔn)確度和精密度，線性范圍較寬，選擇性較好。

辜忠春等[2]提出以超聲波為輔助手段、乙醇為溶劑提取楊梅葉試樣中的總黃酮，采用雙波長(zhǎng)分光光度法測(cè)定提取液的黃酮濃度。結(jié)果表明，應(yīng)用AlCl3-NaAc溶液作顯色體系，在測(cè)定波長(zhǎng)415 nm，參比波長(zhǎng)475 nm條件下，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在3.7～37.1 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與ΔA呈良好的線性關(guān)系，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線為ΔA=0.025 9c+0.002 5，檢出限為0.1 mg/g，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.46%，回收率在95.27%～101.35%之間。該方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、精密度高、能消除復(fù)雜背景的干擾，適用于楊梅葉中黃酮總含量的測(cè)定。

王志強(qiáng)等[3]建立了一種測(cè)定拐棗提取油脂中齊墩果酸含量的三波長(zhǎng)紫外分光光度法，可有效消除干擾物質(zhì)的影響。結(jié)果顯示，以齊墩果酸為對(duì)照品、香草醛乙酸溶液為顯色劑，分別在500 nm、543 nm、580 nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定，ΔA與標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度符合朗伯-比爾定律，回歸方程為ΔA=69.44c-0.528 2，方法回收率在95.5%～97.9%之間，RSD=1.1%。該方法簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好、精密度高，適用于大批量樣品測(cè)定及拐棗的品質(zhì)鑒定。

2 導(dǎo)數(shù)分光光度法

繼雙波長(zhǎng)分光光度法發(fā)展起來(lái)之后導(dǎo)數(shù)分光光度法是又一較精尖的分析技術(shù)，它是利用吸光度對(duì)波長(zhǎng)的導(dǎo)數(shù)曲線來(lái)進(jìn)行試樣分析的。自引入導(dǎo)數(shù)技術(shù)，大大擴(kuò)展了分光光度法的應(yīng)用范圍。和傳統(tǒng)的分光光度法相比，導(dǎo)數(shù)分光光度法靈敏度高、分辨率高、抗干擾能力強(qiáng)，可使波長(zhǎng)接近的重疊吸收譜帶分開(kāi)。在無(wú)機(jī)分析中，導(dǎo)數(shù)分光光度法特別適合于同時(shí)測(cè)定化學(xué)性質(zhì)相似的元素；在有機(jī)分析中，能有效的檢測(cè)某些具有微小光譜差異的同系物或異構(gòu)體。

例如，蘇江濤等[4]建立了用紫外導(dǎo)數(shù)分光光度法測(cè)定復(fù)方替米沙坦氨氯地平片含量的新方法。方法采用紫外導(dǎo)數(shù)分光光度法，替米沙坦測(cè)定波長(zhǎng)為236 nm，氨氯地平測(cè)定波長(zhǎng)為390 nm。替米沙坦?jié)舛仍?4～20)×10-2mg/mL范圍內(nèi)與一階導(dǎo)數(shù)值有良好的線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.004 3X-0.000 5，平均回收率為100.29%，RSD為0.51%(n=9)；氨氯地平濃度在(10～90)×10-3mg/mL范圍內(nèi)與一階導(dǎo)數(shù)值有良好的線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.000 3X+0.000 2，平均回收率為99.84%，RSD為0.62%(n=9)。該方法簡(jiǎn)便易行、測(cè)定快速、有較好的準(zhǔn)確度和精密度，樣品檢測(cè)結(jié)果與HPLC法基本一致，是一種較好的測(cè)定復(fù)方替米沙坦氨氯地平片含量的分析方法。

馮玉[5]研究了鐠-依諾沙星體系的普通吸收光譜和二階導(dǎo)數(shù)光譜。結(jié)果表明，在pH=9.61～10.4范圍內(nèi)，兩者能形成穩(wěn)定的配合物，該配合物的光吸收強(qiáng)度比PrCl3的光吸收強(qiáng)度增大了64倍，其二階導(dǎo)數(shù)光譜比普通吸收光譜強(qiáng)度增大了5.07倍。在1.2×10-5～2.4×10-4mol/L的濃度范圍內(nèi)Pr與體系的導(dǎo)數(shù)吸光度呈良好線性關(guān)系，其回歸方程是Y=840.12X-0.000 439，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.32%(n=7)，結(jié)果滿意。

杜紅霞等[6]建立了應(yīng)用紫外二階導(dǎo)數(shù)分光光度法測(cè)定香油含量的新方法。該法根據(jù)香油和其他植物油在299.3 nm處吸收不同，采用紫外二階導(dǎo)數(shù)分光光度法測(cè)定，結(jié)果顯示在濃度范圍為2～25 μg/mL時(shí)，符合朗伯-比爾定律，其線性方程為Y=250X-0.062 5，加標(biāo)回收率為95.3%～99.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.77%。因此紫外二階導(dǎo)數(shù)分光光度法可用來(lái)直接測(cè)定香油的含量，簡(jiǎn)單、快捷、精密度好、準(zhǔn)確度高，可進(jìn)行批量檢測(cè)。

3 動(dòng)力學(xué)分光光度法

以顯色反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)特性為基礎(chǔ)建立起來(lái)的動(dòng)力學(xué)分光光度法，是一種新型光度分析法，主要包括催化動(dòng)力學(xué)、酶促動(dòng)力學(xué)、膠束介質(zhì)動(dòng)力學(xué)、速差動(dòng)力學(xué)等光度法。

例如，Ibrahim A.Darwish等[7]利用諾氟沙星能和乙醛發(fā)生取代反應(yīng)，生成物可以和2,3,4,5-四氯-1,4-對(duì)苯醌發(fā)生反應(yīng)生成有色物質(zhì)，在625 nm波長(zhǎng)處有最大吸收的特點(diǎn)，建立了測(cè)定藥物制劑中諾氟沙星的動(dòng)力學(xué)分光光度法，且排除了共存物質(zhì)的干擾。

邵鑫等[8]利用Co(II)對(duì)過(guò)氧化氫氧化偶氮胂Ⅰ和結(jié)晶紫起褪色作用，在硝酸介質(zhì)中研究測(cè)定鈷離子的最佳實(shí)驗(yàn)條件，建立了雙波長(zhǎng)雙指示劑的動(dòng)力學(xué)分光光度法測(cè)量痕量鈷的新方法。在最大吸收峰波長(zhǎng)530 nm和590 nm處，鈷離子在(0.25～4.0)×10-7g/25 mL濃度范圍內(nèi)與ΔA符合朗伯-比爾定律，回歸方程為ΔA=0.093 73+0.412 6c，檢出限為1.0×10-8g/25 mL。本方法靈敏度高，體系穩(wěn)定，具有較好的選擇性。

李艷霞等[9]發(fā)現(xiàn)在H2SO4介質(zhì)中，痕量維生素C的存在對(duì)Fe(Ⅲ)阻抑KBrO3氧化甲基橙褪色反應(yīng)有很強(qiáng)的抑制作用，并據(jù)此建立了阻抑動(dòng)力學(xué)分光光度法測(cè)定痕量維生素C的新方法。此方法在濃度范圍0.06～0.65 μg/mL內(nèi)，痕量維生素C對(duì)Fe(Ⅲ)-KBrO3-甲基橙體系反應(yīng)的抑制率與維生素C的濃度符合朗伯-比爾定律，其線性方程為I=1.26+151.28c，檢出限為0.008 6 μg /mL，對(duì)西紅柿和橘子兩種蔬果進(jìn)行測(cè)定，回收率在96.7%～102.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.5%～3.2%，且與測(cè)定維生素C的標(biāo)準(zhǔn)方法碘量法的測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異。因此該法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度好、精密度高，可以用于實(shí)際樣品中維生素C的測(cè)定。

4 薄層色譜分光光度法

薄層色譜分光光度法是以薄層色譜作為輔助分離純化手段的分光光度法，已經(jīng)在藥物，食品，及化妝品中得到應(yīng)用。

例如，張寅等[10]實(shí)驗(yàn)了以氯仿∶甲醇=9∶1的混合溶液為展開(kāi)劑，用薄層色譜-分光光度法測(cè)定樟芝菌粉中總?cè)坪康姆椒?。該方法?0～120 μg范圍內(nèi)吸光度與齊墩果酸的微克數(shù)呈良好線性關(guān)系，回歸方程為Y=0.003 6X-0.024 2，回收率為99.70%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.78%。該方法可以去除脂肪、色素等對(duì)測(cè)定的干擾，且操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，可用于樟芝原料及相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量分析。

劉海霞等[11]對(duì)蘋(píng)果籽油中的甾醇用薄層色譜法分離純化，再用磷硫鐵分光光度分析法對(duì)純化后的甾醇進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，在最大吸收波長(zhǎng)680 nm處，吸光度與豆甾醇質(zhì)量濃度的線性回歸方程為Y=0.276X+0.006 8，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.409%。該方法測(cè)定蘋(píng)果籽油中的甾醇類化合物總量操作簡(jiǎn)便、精密度高、穩(wěn)定性好。

5 流動(dòng)注射分光光度法

流動(dòng)注射分光光度法是為分析某些成分復(fù)雜、干擾大的樣品而把流動(dòng)注射技術(shù)和分光光度法聯(lián)合應(yīng)用，逐步形成的高效分析方法，具有分析速度快、效率高、檢測(cè)限低、準(zhǔn)確度和精密度較高、操作簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)。現(xiàn)已在環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品分析、醫(yī)藥、臨床、農(nóng)業(yè)、地質(zhì)等多個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用中占有舉足輕重的地位。

例如，Muberra Andac等[12]依據(jù)對(duì)硝基苯并惡唑基磺酸鈉可以和Hg(Ⅱ)發(fā)生反應(yīng)生成絡(luò)合物，其在430 nm處相較于NBS吸光度顯著降低的原理，建立了快速分析藥物中Hg(Ⅱ)含量的流動(dòng)注射分光光度法。

郭楠[13]提出利用在酸性樣品中，六價(jià)鉻與二苯卡巴肼形成紫紅色絡(luò)合物，在550 nm處產(chǎn)生最大吸收峰，用流動(dòng)注射分光光度法監(jiān)測(cè)遼寧大凌河水中的六價(jià)鉻含量。結(jié)果表明，該方法在0.02～0.50 mg/L范圍內(nèi)呈較好的線性關(guān)系，回收率為98.8%～100.9%之間，檢出限為0.002 2 mg/L，在0.05 mg/L和0.50 mg/L的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%和0.5%，測(cè)定速度30樣/h。因此，該方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、干擾因素少、分析效率高。

龍澤榮等[14]利用醛類物質(zhì)和間苯三酚在酸催化作用下生成紅色單甲川類衍生物的原理，建立了一種流動(dòng)注射分光光度法檢測(cè)植物油中醛類化合物的方法。結(jié)果表明，醛類化合物在濃度范圍在0.000 6～0.03 mol/L內(nèi)呈良好線性關(guān)系，回歸方程為Y=3.19×108X+1.12×105，回收率在90%以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.41%～2.1%。該方法測(cè)定快速、結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單，可用于試劑食用油樣品中醛類化合物的檢測(cè)，具有推廣意義。

綜上，新試劑、新方法的發(fā)現(xiàn)和使用使得分光光度法在食品、藥品分析中的可靠性可媲美色譜法，但其簡(jiǎn)單的操作步驟、低廉的設(shè)備價(jià)格和易普及的特點(diǎn)卻是色譜法無(wú)法比擬的，從而使得分光光度法的應(yīng)用更加廣泛。