馮 彩， 胡 菊， 李俊茹， 崔長海， 王良炎

（河南師范大學水產(chǎn)學院， 河南新鄉(xiāng)453007）

體色是魚類的重要表型性狀之一，由魚類皮膚及鱗片中色素細胞的種類、數(shù)量和分布情況決定[1-2]。色素細胞由外胚層神經(jīng)嵴細胞分化形成，在胚胎發(fā)育過程中，神經(jīng)嵴細胞沿背腹軸分化成包括色素細胞在內(nèi)的不同類型細胞[3]。色素細胞種類不同，所含有的色素顆粒存在較大差異。黑色素細胞具有含有黑色素的色素小體，紅色素/黃色素細胞具有包含類胡蘿卜素、喋啶成分的紅/黃色素小體。虹彩細胞合成含有嘧啶成分的色素小體[4-6]。喋啶代謝通路調(diào)控喋啶色素合成，Gch2是喋啶合成通路的重要限速酶。在斑馬魚（Danio rerio）和花鳉（Poecilia reticulata）等魚類中，喋啶代謝通路是調(diào)控體色變化的一條重要代謝通路，其終產(chǎn)物為黃色和微紅的喋啶色素。這些色素是以GTP為底物經(jīng)過該通路轉(zhuǎn)化而來。該通路由3個步驟組成：（1）三磷酸鳥苷（GTP）在GTP環(huán)化水解酶及其他酶的催化下合成四氫生物蝶呤；（2）四氫生物蝶呤作為輔助因子參與喋啶通路反應(yīng)后的再生[7]；（3）黃色素、墨蝶呤及其衍生物和蝶呤的合成。Gch2是喋啶代謝通路的限速酶，對黃色素、喋啶、果蠅蝶呤等色素的合成起重要的調(diào)控作用[8]。

草金魚（Carassius auratus）屬于鯉科（Cyprinidae）、鯽屬（Carassius），是鯽（Carassius auratus）的一個變種，因體色豐富且組合形式多樣深受人們喜愛，具有十分重要的觀賞價值[9]。草金魚的體色有紅色、黑色、白色、紅白和五花等，是研究魚類乃至脊椎動物體色變化的重要實驗材料[9]。目前為止，所有的草金魚品系表型性狀差異主要集中在尾鰭及體表色澤上，遠不及其他觀賞魚如金魚、錦鯉的種類豐富，且具有較高觀賞價值的草金魚個體較少[10]。因此，研究其體色發(fā)生和形成機理，是草金魚遺傳育種中亟待解決的問題。本文旨在通過半定量PCR分析Gch2 mRNA在純紅、純白和黑黃體色草金魚皮膚中的表達情況，為更深入理解Gch2基因在草金魚體色形成中的作用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 實驗魚

實驗材料取自河南師范大學水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，均為2齡草金魚，選擇純色的紅色、白色草金魚的皮膚，黑黃色草金魚的黃色皮膚和黑色皮膚進行RNA提取實驗。

1.2 Total RNA提取及完整性檢測

按照RNAiso Plus試劑（TaKaRa公司，大連）說明書步驟分別提取不同體色草金魚皮膚的RNA。取3 μL樣品進行非變性瓊脂糖凝膠電泳，通過紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察提取的RNA的完整性。

1.3 cDNA第一鏈合成

根據(jù)前述檢測結(jié)果，取調(diào)整后達到等量的不同體色草金魚RNA，參照PrimeScript RT 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，大連）合成cDNA第一鏈。

1.4 Gch2及常用內(nèi)參基因β-actin的PCR擴增

根據(jù)定量PCR引物的設(shè)計原則，利用Primer Premier3.0 軟件，設(shè)計草金魚Gch2的引物及β-actin的引物，引物序列見表1，由上海生工合成。PCR反應(yīng)體系如表2所示。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequence

表2 半定量PCR反應(yīng)體系Tab.2 The reaction system of Semi-QRT-PCR

采用的擴增程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進行30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)完成后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色，紫外燈觀察照相。β-actin的PCR擴增體系同表2。所有實驗結(jié)果平行重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

提取的不同體色草金魚皮膚的RNA經(jīng)凝膠電泳檢測（圖1），可觀測到清晰的28s和18s條帶，28s rRNA條帶基本為18s rRNA條帶亮度的2倍，表明提取的RNA完整性良好，無降解，可以用于本實驗后續(xù)研究。

用ND-2000核酸蛋白儀檢測RNA濃度和OD值，一般以1.8＜A260/A280(Ratio，R)＜2.0為標準，表明所提RNA質(zhì)量符合要求，將合格RNA暫存于-80 ℃用于后續(xù)實驗。反轉(zhuǎn)錄體系中RNA量均為1 μg，從而保證反轉(zhuǎn)錄合成不同的cDNA樣品之間可以達到良好的平行性，以此確保半定量PCR實驗的一致性，提高半定量結(jié)果的可靠性。

反轉(zhuǎn)錄體系中RNA量均為3 ug，通過調(diào)整起始RNA的量，以等量的Total RNA反轉(zhuǎn)錄合成不同的cDNA樣品之間可以達到良好的平行性，以此確保半定量PCR實驗的一致性，提高半定量結(jié)果的可靠性。

2.2 Gch2基因在不同體色草金魚皮膚的表達

不同體色草金魚皮膚中Gch2的表達情況如圖2。Gch2在紅色、白色、黑黃色草金魚的皮膚中均有表達。其中黑黃色草金魚的黃色皮膚中Gch2的表達量最高，在紅色草金魚的皮膚中Gch2的表達略高于白色草金魚，在黑黃色草金魚黑色皮膚中Gch2表達量最低。重復(fù)試驗結(jié)果一致，β-actin擴增條帶在各樣本表達比較均一，表明該PCR體系符合表達分析的要求。用軟件Imagej Software對電泳條帶進行分析也得到了相同的結(jié)果，見圖3。

3 討論

魚類色素細胞起源于神經(jīng)嵴的色素母細胞，由色素母細胞再分化成6種色素細胞，分別為黑、紅、黃、白、藍色素細胞和虹彩細胞[8]。當前階段對黑色素細胞的分化、形成和黑色素合成等分子調(diào)控通路的研究較為清晰而對其他色素細胞的色素顆粒代謝調(diào)控研究較少[9-10]。黃色素細胞可以合成紅/黃碟啶色素小體，在魚類體色形成中具有重要作用，是僅次于黑色素細胞的重要研究對象。因此，黃色素細胞代謝通路的研究對認識魚類體色的形成具有重要的理論意義。

喋啶代謝通路的最終產(chǎn)物為四氫生物蝶呤（BH4），BH4是多個代謝酶的輔助因子，在組織和細胞中均有表達[11-14]。因為Gch2是BH4從頭合成路徑和反向補救合成路徑的關(guān)鍵催化酶，所以在斑馬魚和比目魚中可以作為黃色素細胞的標記基因[15]。目前，Gch2在經(jīng)濟價值、觀賞價值高的草金魚中還沒有相關(guān)研究。

鑒于草金魚有多種體色模式，本研究選擇常見的純紅、純白、黑黃體色草金魚作為研究對象。其中紅色和黑黃色草金魚所具有的色素細胞主要包含紅色素細胞、黃色素細胞和虹彩細胞。而紅色素細胞、黃色素細胞和虹彩細胞的色素顆粒主要為含有不同顏色的蝶啶體和類胡蘿卜素小胞，從而使魚體看起來呈橙色、黃色和紅色[16]。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Gch2在純紅和黑黃色草金魚黃色皮膚中的表達量相對較高。Gch2作為喋啶代謝通路的限速酶，其高表達將促使喋啶代謝通路活躍，喋啶色素合成量增加。純白體色草金魚皮膚中Gch2的表達量與純紅體色草金魚的表達量相比偏低，這一結(jié)果同斑馬魚的研究結(jié)果近乎一致[17]。這可能是因為白色草金魚的色素細胞主要包含白色素細胞和虹彩細胞[18]，相較于紅/黃色素細胞，白色組織的虹彩細胞可合成一部分無色的喋啶顆粒，但主要以嘌呤成分為主[19]。Gch2在黑黃色草金魚的黑色皮膚中表達量最低，推測主要因為黑色草金魚的色素細胞為黑色素細胞，黑色素細胞中的細胞器是由黑色素小體合成的，喋啶成分含量較少[20]。本研究初步揭示了Gch2基因在不同體色草金魚皮膚中mRNA水平表達情況，旨在為深入探究Gch2在魚類體色形成中的作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。