李 琪，郭嬌嬌，阮文科

(北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

偽狂犬病(Pseudorabies，PR又名Aujeszky's disease，AD)是由偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的一種急性傳染病，可引起包括豬、綿羊、牛、犬在內(nèi)的35種動(dòng)物發(fā)病，且豬是其唯一自然宿主[1-2]。在中國(guó)，偽狂犬病是規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)的常見病[3]。

偽狂犬病毒主要侵害豬的神經(jīng)系統(tǒng)，出現(xiàn)肢體抽搐等癥狀；妊娠母豬出現(xiàn)繁殖障礙，并且可垂直傳播給仔豬，造成仔豬死亡；種公豬失去配種能力等[4]。該病沒有特效藥，只能通過(guò)對(duì)病豬注射高免血清，健康豬進(jìn)行緊急接種，治療效果不佳，給養(yǎng)殖場(chǎng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5]。做好防疫是預(yù)防本病的關(guān)鍵措施[6]。在加強(qiáng)免疫接種的同時(shí)，合理的診斷測(cè)定方法也十分重要[7]。

該研究旨在針對(duì)TK-/gG-雙基因缺失疫苗建立偽狂犬病毒酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法，通過(guò)檢測(cè)偽狂犬病毒gG蛋白的抗體，從而區(qū)分出疫苗接種豬和野毒感染豬，為養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行大范圍檢測(cè)免疫效果和感染情況提供科學(xué)有效的測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

偽狂犬病毒Beijing14-1株由北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院獸藥與疫病防控實(shí)驗(yàn)室保存；BL21感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司；pET-32a質(zhì)粒購(gòu)自鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；待檢豬血清來(lái)自規(guī)?；i場(chǎng)。

1.2 主要試劑

Taq DNA聚合酶、dNTPs、Buffer、T4 DNA連接酶、ProteinIso?Ni-NTA Resin、DNA膠回收試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；EcoRⅠ和HindⅢ購(gòu)自takara公司；96孔板購(gòu)自corning公司；HRP標(biāo)記羊抗豬二抗購(gòu)自北京冠星宇公司；BSA購(gòu)自Biotopped公司；DNA和蛋白Marker、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自索萊寶公司、His標(biāo)簽一抗購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI中公布的偽狂犬病毒全基因組序列(登錄號(hào)：NC-006151)，運(yùn)用DNAstar protean軟件分析gG基因主要抗原區(qū)域并設(shè)計(jì)特異性引物，預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為414 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，上游引物：5′-CGGAATTCTACGCCGACTACTACGACG-3′(EcoRⅠ)，下游引物：5′-CCAAGCTTGGGTCGGCTCCGG-3′(HindⅢ)。

1.4 重組質(zhì)粒pET-32a-gG的構(gòu)建

以偽狂犬病毒DNA為模板，用1.3中設(shè)計(jì)的引物，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增偽狂犬病毒gG部分核酸序列。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：Buffer 2 μL，dNTPs 1 μL，模板1 μL，上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 14.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收純化，并將回收產(chǎn)物和pET-32a質(zhì)粒分別用EcoRⅠ，HindⅢ進(jìn)行雙酶切，再將兩者用T4連接酶連接；連接體系為pET-32a酶切產(chǎn)物2 μL，PCR產(chǎn)物13 μL，5×T4 DNA Ligase Buffer 4 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，連接溫度為25 ℃，連接15 min。將獲得的重組質(zhì)粒按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中，挑取陽(yáng)性菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒測(cè)序鑒定，由上海生工公司進(jìn)行測(cè)序。pET-32a載體含有可與插入基因融合表達(dá)的His標(biāo)簽，測(cè)序鑒定后獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-gG。

1.5 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將重組質(zhì)粒pET-32a-gG轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌BL21中，于菌液OD600=0.6左右，加入IPTG(終濃度為1 mmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)設(shè)未經(jīng)誘導(dǎo)的對(duì)照組。誘導(dǎo)表達(dá)4 h后，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)情況。為探究gG蛋白以何形式表達(dá)，將菌液超聲破碎后上清和沉淀分開處理，并通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)。再對(duì)最佳誘導(dǎo)條件進(jìn)行探究，并在此條件下對(duì)誘導(dǎo)上清進(jìn)行Western Blot鑒定，分別使用His單抗作為一抗檢測(cè)gG蛋白，偽狂犬病毒陽(yáng)性豬血清作為一抗檢測(cè)蛋白反應(yīng)原性。最后用全式金ProteinIso?Ni-NTA Resin進(jìn)行蛋白純化，并獲得His標(biāo)簽融合表達(dá)的重組gG蛋白片段。

1.6 偽狂犬病毒重組gG蛋白片段抗體間接ELISA方法的建立及血清樣品檢測(cè)

1.6.1 偽狂犬病毒重組gG蛋白片段抗體間接ELISA方法的建立 經(jīng)過(guò)抗原包被濃度、抗體稀釋度以及封閉液和反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終建立檢測(cè)步驟。

包被：向96孔板中加入小片段gG抗原1.092 μg和抗原包被液100 μL，37 ℃ 2 h或4 ℃過(guò)夜。洗液200 μL洗滌，3次，每次靜置3 min。

封閉：向每孔中加入封閉液200 μL，37 ℃ 1 h或4 ℃過(guò)夜。洗液200 μL洗滌，3次，每次3 min。

加樣：分別在陰性對(duì)照孔、陽(yáng)性對(duì)照孔加入陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各100 μL(50倍稀釋)，待檢孔第1孔加待檢血清100 μL(50倍稀釋)，后孔對(duì)待檢血清做倍比稀釋，不要觸及孔底和孔壁，輕晃混勻。

溫育：用封板膜封板后置37 ℃，30 min。洗液200 μL洗滌，3次，每次3 min。

加酶標(biāo)二抗：每孔加酶標(biāo)抗體100 μL(用二抗稀釋液20000倍稀釋)。

顯色：顯色劑A液與顯色劑B液等量混勻，每孔100 μL，37 ℃避光顯色10 min。

終止：每孔加終止液50 μL。

測(cè)定：15 min內(nèi)，以450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)每孔OD值。結(jié)果判定：S/N≥2.1可判為陽(yáng)性。S是待檢孔的OD450平均值；N是陰性孔的OD450平均值。

1.6.2 血清樣品檢測(cè) 在1.6.1所述的最佳條件下，運(yùn)用本試驗(yàn)建立的偽狂犬病毒 gG重組蛋白間接ELISA方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)樣品來(lái)自不同規(guī)?；i場(chǎng)的血清樣本共93個(gè)，其中包括gG缺失苗免疫的試驗(yàn)豬血清30個(gè)、未注射疫苗但具有非gG缺失苗母源抗體的試驗(yàn)豬血清48個(gè)以及非gG缺失疫苗免疫過(guò)的豬血清15個(gè)。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)后菌液、上清及沉淀的SDS-PAGE鑒定

將重組質(zhì)粒pET-32a-gG轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌BL21中，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。pET-32a-gG質(zhì)粒在經(jīng)1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)后，在40～50 kD之間出現(xiàn)目的條帶，未經(jīng)誘導(dǎo)的菌液未出現(xiàn)目的條帶，見圖1A。

為確定目的蛋白的存在形式，將菌液超聲破碎后離心，分別對(duì)上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。上清中有大量表達(dá)帶，沉淀中未見表達(dá)帶，表明目的蛋白以可溶的形式存在于上清中，見圖1B。

2.2 重組偽狂犬病毒 gG抗原片段Western Blot鑒定

在1 mmol/L IPTG，30 ℃，250 r/min的最佳誘導(dǎo)條件下，對(duì)誘導(dǎo)的上清進(jìn)行Western Blot鑒定，分別使用His標(biāo)簽單抗和偽狂犬病毒陽(yáng)性豬血清作為一抗，HRP標(biāo)記羊抗豬二抗，結(jié)果見圖2。兩種方法均能檢測(cè)到目的條帶。

2.3 樣品檢測(cè)

用1.6.1所述的gG-ELISA測(cè)定方法檢測(cè)來(lái)自不同規(guī)?；i場(chǎng)的血清樣品共93個(gè)，判定標(biāo)準(zhǔn)：S/N≥2.1可判為陽(yáng)性。S是待檢孔的OD450平均值；N是陰性孔的OD450平均值。陽(yáng)性對(duì)照為感染偽狂犬病毒野毒的豬的陽(yáng)性血清，陰性對(duì)照為未感染偽狂犬病毒野毒并且也未接種偽狂犬病毒疫苗的豬血清。

檢測(cè)豬場(chǎng)樣品93份。陰性樣品30個(gè)，為gG缺失苗免疫的試驗(yàn)豬血清，來(lái)自陰性豬場(chǎng)，該試驗(yàn)豬沒有自然感染偽狂犬病毒野毒，也沒有進(jìn)行非gG缺失苗免疫；弱陽(yáng)性樣品48個(gè)，為未免疫偽狂犬病毒疫苗，但具有非gG缺失苗母源抗體的試驗(yàn)豬血清，來(lái)自陽(yáng)性豬場(chǎng)；陽(yáng)性樣品15個(gè)，為非gG缺失疫苗免疫過(guò)的豬血清，來(lái)自陽(yáng)性豬場(chǎng)。93份樣品檢測(cè)后進(jìn)行符合率計(jì)算。根據(jù)試驗(yàn)豬血清的不同來(lái)源及豬場(chǎng)的情況，檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期的結(jié)果一致，符合率100%。檢測(cè)結(jié)果及符合率見表1。

表1 血清樣品檢測(cè)結(jié)果Tab.1 The test result of serum samples

3 討 論

偽狂犬病自1947年在中國(guó)發(fā)現(xiàn)首例以來(lái)，已在中國(guó)流行70年[8]。偽狂犬病依舊是威脅中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的重要豬病之一，加強(qiáng)科學(xué)飼養(yǎng)指導(dǎo)，制定合理的免疫程序，加強(qiáng)偽狂犬病毒抗體檢測(cè)，是防控偽狂犬病，凈化豬場(chǎng)的重要防控措施[5]。目前，針對(duì)偽狂犬病毒的疫苗有滅活疫苗、自然弱毒疫苗、基因缺失疫苗等[9]。由于滅活疫苗存在免疫效果不佳，接種劑量大的缺點(diǎn)，天然弱毒疫苗存在TK基因，毒力返強(qiáng)的可能性大，可能造成接種豬免疫抑制等，逐漸被基因缺失疫苗所取代[10-11]?；蛉笔б呙缫匀笔K基因作為基礎(chǔ)，有單基因缺失、雙基因缺失及多基因缺失疫苗，中國(guó)較為常用的基因缺失疫苗有TK-/gG-、TK-/gE-及TK-/gC-等雙基因缺失疫苗[9]。TK-/gG-疫苗株是利用一株碘脫氧尿感抗性突變株HR(TK-)作為親本構(gòu)建的一種雙基因缺失疫苗株[12]，其缺失gG基因，不會(huì)表達(dá)gG蛋白，因此通過(guò)檢測(cè)血清中g(shù)G蛋白抗體即可鑒別野毒感染豬和疫苗免疫接種豬。

目前，研究者以檢測(cè)gE蛋白抗體的ELISA試劑盒作為研究關(guān)注的重點(diǎn)[3,13-14]。對(duì)于接種TK-/gG-雙基因缺失疫苗的養(yǎng)殖場(chǎng)缺乏便捷的檢測(cè)方法，不利于偽狂犬病的防控。該研究通過(guò)構(gòu)建偽狂犬病毒gG部分基因原核表達(dá)載體pET-32a-gG，通過(guò)加入1 mmol/L的IPTG，在30 ℃時(shí)，成功誘導(dǎo)表達(dá)出偽狂犬病毒gG蛋白片段，利用該蛋白作為包被蛋白，研發(fā)出檢測(cè)gG抗體的gG-ELISA檢測(cè)方法，檢測(cè)已知豬場(chǎng)血清93份，其中陽(yáng)性血清63份，陰性血清30份，符合率為100%。該gG-ELISA檢測(cè)方法為偽狂犬病的檢測(cè)帶來(lái)便利，填補(bǔ)市場(chǎng)上沒有針對(duì)TK-/gG-疫苗的檢測(cè)方法的空缺，有利于偽狂犬病的防控。為徹底凈化豬偽狂犬病提供技術(shù)上的支撐。