孫佳晨，高月榮，李曉偉，曹慶芹，邢 宇，房克鳳，張 卿，秦 嶺*

(北京農(nóng)學(xué)院a.植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，b.園林學(xué)院，北京 102206)

板栗(CastaneamollissimaBlume)為殼斗科(Fagaceae)栗屬(Castanea)植物。中國板栗栽培廣泛[1]，其果實(shí)營養(yǎng)豐富，熟食味道香糯可口，老少皆宜，深受人們喜愛。板栗栽培品種大多存在產(chǎn)量低、抗病蟲害性差、不耐鹽堿等問題，因此需要培育出一批產(chǎn)量高、抗性好的新品種[2]。目前，通過板栗體細(xì)胞胚遺傳轉(zhuǎn)化體系已能獲得板栗轉(zhuǎn)基因植株。而抗生素篩選是轉(zhuǎn)基因過程中獲得陽性植株的重要步驟。該課題組前期進(jìn)行板栗胚性愈傷組織對卡那霉素的敏感性研究，確定卡那霉素對板栗胚性愈傷組織篩選的質(zhì)量濃度為180 mg/L，并應(yīng)用于后續(xù)轉(zhuǎn)基因材料的篩選[3]。由于板栗愈傷組織本身具有較強(qiáng)的卡那霉素抗性，在篩選過程中存在周期長、效果不明顯等問題，因此該研究試圖用更為適宜的遺傳霉素(G418)代替卡那霉素進(jìn)行篩選，探究板栗胚性愈傷組織對遺傳霉素的敏感性。

遺傳霉素是一類氨基糖苷類抗生素，其結(jié)構(gòu)類似于新霉素和卡那霉素，可干擾真核細(xì)胞80S核糖體功能，使蛋白合成受阻，進(jìn)而導(dǎo)致真核細(xì)胞死亡。轉(zhuǎn)基因載體上通常具有篩選標(biāo)記基因nptⅡ(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)，其編碼的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶可使新霉素、卡那霉素和遺傳霉素等被磷酸化而失活，從而使轉(zhuǎn)基因細(xì)胞表現(xiàn)出對新霉素、卡那霉素和遺傳霉素的抗性[4]。遺傳霉素在水稻、甘蔗、矮牽牛、木瓜等抗性篩選中的應(yīng)用已有一些報道[5-11]。如王紫萱等[5]研究表明，遺傳霉素對秈稻胚性愈傷組織的篩選質(zhì)量濃度為150 mg/L；寧露云等[8]證明誘導(dǎo)矮牽牛不定芽的遺傳霉素臨界質(zhì)量濃度為4 mg/L?？梢姴煌锓N細(xì)胞對遺傳霉素的敏感性可能不同，所使用的遺傳霉素篩選質(zhì)量濃度差異較大。

該研究以板栗體細(xì)胞胚穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系為基礎(chǔ)，探究兩種板栗胚性愈傷組織在添加不同質(zhì)量濃度遺傳霉素的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d時，導(dǎo)致其全部褐化死亡的最低質(zhì)量濃度。為了進(jìn)一步加快篩選進(jìn)程，探究兩種板栗胚性愈傷組織在添加不同質(zhì)量濃度遺傳霉素的液體培養(yǎng)基上懸浮培養(yǎng)15 d時，導(dǎo)致其全部褐化死亡的最低質(zhì)量濃度。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 ‘燕山紅栗’(CastaneamollissimaBlume ‘Yanshanhongli’)種植于北京市懷柔區(qū)板栗試驗(yàn)站。兩種狀態(tài)的胚性愈傷組織均誘導(dǎo)自‘燕山紅栗’第1次盛花期后45～55 d的一個幼胚，分別為細(xì)小、泥狀的難形成球形胚的胚性愈傷組織(embryogenic callus-difficult to form globular embryo，EC-D)和粒大、質(zhì)硬、分散的易形成球形胚的胚性愈傷組織(embryogenic callus-easy to form globular embryo，EC-E)。

1.1.2 培養(yǎng)基 擴(kuò)繁培養(yǎng)基(WPM 2.3 g/L，Nitsch & Nitsch Vitamins 109 mg/L，2,4-D 1.8 μmol/L，6-BA 1.1 μmol/L，蔗糖30 g/L，Casein 1 g/L，植物凝膠3 g/L，pH=5.55±0.05)。參考Lu等[12]愈傷組織擴(kuò)繁方法。

1.1.3 試劑和設(shè)備 生長素(2,4-D)、細(xì)胞分裂素(6-BA)購自Sigma公司，WPM(McCown‘s Woody Plant Medium)、Nitsch & Nitsch Vitamins、植物凝膠、蔗糖等購自Phyto Technology Laboratories公司，遺傳霉素購自Invitrogen。6 cm培養(yǎng)皿、尖鑷、37 μm的濾網(wǎng)等均購自北京華佰泰生物科技有限公司。

遺傳霉素儲存液(50 mg/mL)：0.5 g遺傳霉素溶于10 mL無菌ddH2O中，-20 ℃保存。

Sanyo MLS-3780型高壓濕熱滅菌鍋、體視顯微鏡(ZEISS SteREO Discovery.V20)、超凈工作臺(ZHJH-C1115C)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 板栗愈傷組織的固體培養(yǎng) 參考Lu等[12]愈傷組織擴(kuò)繁方法，將擴(kuò)繁培養(yǎng)基上保存的EC-D和EC-E，分別轉(zhuǎn)接到含有不同質(zhì)量濃度遺傳霉素的固體擴(kuò)繁培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)，培養(yǎng)皿直徑為6 cm，每個培養(yǎng)皿均含有20團(tuán)愈傷組織，每個質(zhì)量濃度重復(fù)3次，培養(yǎng)溫度為23～25 ℃，每14 d更換1次培養(yǎng)基。每10 d觀察1次愈傷組織狀態(tài)并拍照，連續(xù)培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計愈傷組織死亡情況。

1.2.2 板栗愈傷組織的液體懸浮培養(yǎng) 稱取在擴(kuò)繁培養(yǎng)基上保存的EC-E 0.3 g和EC-D 0.1 g，分別轉(zhuǎn)接到50 mL含有不同質(zhì)量濃度遺傳霉素的液體擴(kuò)繁培養(yǎng)基上，每個質(zhì)量濃度重復(fù)3次，100 r/min，懸浮暗培養(yǎng)15 d后，用孔徑為37 μm的濾網(wǎng)將愈傷組織濾出并用濾紙吸干水分，拍照觀察愈傷組織狀態(tài)，并稱質(zhì)量統(tǒng)計愈傷組織的鮮質(zhì)量變化量。

1.2.3 遺傳霉素質(zhì)量濃度的設(shè)置 固體培養(yǎng)中遺傳霉素質(zhì)量濃度為0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、120、130、140 mg/L。懸浮培養(yǎng)中遺傳霉素質(zhì)量濃度為0、10、20、30、40、50、60、70、80 mg/L。每個質(zhì)量濃度重復(fù)3次。

1.2.4 計算方法 死亡率=愈傷組織死亡團(tuán)數(shù)/愈傷組織總團(tuán)數(shù)

鮮質(zhì)量變化量=培養(yǎng)后胚性愈傷組織鮮質(zhì)量-培養(yǎng)前胚性愈傷組織鮮質(zhì)量

2 結(jié)果與分析

2.1 固體培養(yǎng)條件下板栗胚性愈傷組織對遺傳霉素的耐受力

通過觀察EC-E和EC-D在含有不同質(zhì)量濃度遺傳霉素的固體培養(yǎng)基上的死亡情況，統(tǒng)計EC-E和EC-D培養(yǎng)30 d時的死亡率。

當(dāng)遺傳霉素質(zhì)量濃度<60 mg/L時，EC-E未出現(xiàn)死亡情況；≥60 mg/L，EC-E逐漸開始出現(xiàn)死亡；80～90 mg/L，EC-E的死亡率急劇升高；之后隨著遺傳霉素質(zhì)量濃度的升高，EC-E的死亡率緩慢上升(圖1)。當(dāng)遺傳霉素質(zhì)量濃度為0～120 mg/L，且培養(yǎng)時間相同時，EC-E的褐化程度隨著遺傳霉素質(zhì)量濃度的增加而不斷加深，且培養(yǎng)30 d時，均可見新生EC-E；當(dāng)遺傳霉素質(zhì)量濃度≥130 mg/L時，培養(yǎng)30 d，未見新生EC-E(圖2)，EC-E的死亡率達(dá)到100%(圖1)。

當(dāng)遺傳霉素質(zhì)量濃度<50 mg/L，EC-D未出現(xiàn)死亡情況；≥50 mg/L，EC-D開始逐漸出現(xiàn)死亡；60～80 mg/L，EC-D的死亡率急劇升高(圖1)。當(dāng)遺傳霉素質(zhì)量濃度為0～70 mg/L，且培養(yǎng)時間相同時，EC-D的褐化程度隨遺傳霉素質(zhì)量濃度的升高而加深，且培養(yǎng)30 d時，均可見新生EC-D；當(dāng)遺傳霉素質(zhì)量濃度≥80 mg/L，培養(yǎng)時間為20～30 d時，均未見新生EC-D(圖3)，EC-D的死亡率達(dá)到100%(圖1)。

綜上所述，說明固體培養(yǎng)30 d時，遺傳霉素對EC-E的最低致死質(zhì)量濃度為130 mg/L，對EC-D的最低致死質(zhì)量濃度為80 mg/L。

2.2 懸浮培養(yǎng)條件下板栗胚性愈傷組織對遺傳霉素的耐受力

將兩種胚性愈傷組織分別接入50 mL含不同質(zhì)量濃度遺傳霉素的液體擴(kuò)繁培養(yǎng)基中，懸浮暗培養(yǎng)15 d，統(tǒng)計其鮮質(zhì)量變化量并拍照記錄其褐化情況。

當(dāng)遺傳霉素質(zhì)量濃度為0～20 mg/L時，EC-E生長量迅速下降，且在20 mg/L時，EC-E開始失重；>20 mg/L時，生長量變化不明顯(圖4)；20～60 mg/L時，隨著遺傳霉素質(zhì)量濃度的升高，EC-E褐化程度逐漸加深，并且其生長明顯受到抑制(圖5)；≥60 mg/L，EC-E完全褐化死亡(圖5)。

當(dāng)遺傳霉素質(zhì)量濃度為0～10 mg/L時，EC-D生長量急劇下降，且在10 mg/L時，EC-D開始失重；>10 mg/L時，EC-D生長量變化不明顯(圖4)；10～30 mg/L時，隨著遺傳霉素質(zhì)量濃度的升高，EC-D褐化程度逐漸加深，并且其生長明顯受到抑制(圖5)；≥30 mg/L，EC-D完全褐化死亡(圖5)。

綜上所述，說明液體懸浮培養(yǎng)15 d時，遺傳霉素對EC-E的最低致死質(zhì)量濃度為60 mg/L，對EC-D的最低致死質(zhì)量濃度為30 mg/L。

3 討 論

同種植物材料對不同抗生素的耐受力是不同的。如王亞君等[13]研究表明埃式小球藻對11種抗生素的敏感性均不同；杜春梅等[14]研究表明毛木耳對4種抗生素的敏感性不同；葡萄體細(xì)胞胚對頭孢和潮霉素的敏感性不同[15]；板栗胚性愈傷組織對頭孢、特美汀、卡那霉素的敏感性不同[3]，因此為了優(yōu)化板栗轉(zhuǎn)基因的篩選進(jìn)程，探究板栗胚性愈傷組織對遺傳霉素的敏感性是很有必要的。

在植物組織培養(yǎng)過程中，與固體培養(yǎng)方式相比，液體培養(yǎng)方式會使愈傷組織培養(yǎng)材料更均一化，并且可以加快愈傷組織擴(kuò)繁速度[16]。該試驗(yàn)中同一種狀態(tài)的板栗胚性愈傷組織在不同培養(yǎng)條件下，表現(xiàn)出對遺傳霉素不同的耐受力。在固體培養(yǎng)時板栗胚性愈傷組織對遺傳霉素的耐受力高于懸浮培養(yǎng)，出現(xiàn)這種差異的原因可能是固體培養(yǎng)條件下，愈傷組織對培養(yǎng)基的接觸不充分，只能靠愈傷組織的生理壓吸收遺傳霉素，而在懸浮培養(yǎng)條件下，愈傷組織對遺傳霉素全方位進(jìn)行吸收，從而導(dǎo)致同一種狀態(tài)的板栗胚性愈傷組織在固體培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)時對遺傳霉素的耐受力有很大差異。

相關(guān)研究證明不同植物材料或同一植物不同生長階段對相同抗生素的抗性不同。例如劉家儀等[17]在甘蔗品種ROC22的組織培養(yǎng)中探索遺傳霉素的使用質(zhì)量濃度，確定甘蔗愈傷組織生長階段的最佳遺傳霉素篩選質(zhì)量濃度為20 mg/L，分化階段的最佳遺傳霉素篩選質(zhì)量濃度為40 mg/L，小苗生根階段的最佳遺傳霉素篩選質(zhì)量濃度為30 mg/L；苦蕎的愈傷組織在后期分化時對卡那霉素很敏感[18]；齊仙惠等[19]證明不同品系的大白菜對卡那霉素的耐受力不同；張靜等[20]確定2種蘿卜的種子自交系的最佳卡那霉素篩選質(zhì)量濃度分別為150 mg/L和300 mg/L；押輝遠(yuǎn)等[21]研究表明小麥品種豫賣18的轉(zhuǎn)基因遺傳霉素篩選質(zhì)量濃度為25 mg/L。該研究所用的板栗兩種狀態(tài)的胚性愈傷組織在相同培養(yǎng)條件下，表現(xiàn)出對遺傳霉素不同的耐受力，出現(xiàn)這種差異的原因可能是胚性愈傷組織本身的差異所致，EC-D呈細(xì)小，泥狀，形態(tài)不規(guī)則，EC-E粒大，質(zhì)硬，形態(tài)規(guī)則，這可能會導(dǎo)致EC-D較EC-E接觸培養(yǎng)基更充分，更易吸收遺傳霉素，從而導(dǎo)致EC-D對遺傳霉素耐受力更低。另外，該研究僅僅探討遺傳霉素在板栗轉(zhuǎn)基因抗性愈傷組織篩選過程中的耐受力，而遺傳霉素在抗性愈傷組織誘導(dǎo)分化成轉(zhuǎn)基因植株過程中的使用還有待探討。該研究結(jié)果為板栗主栽品種‘燕山紅栗’胚性愈傷組織轉(zhuǎn)基因過程中遺傳霉素的使用提供參考。