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        棗瘋植原體免疫優(yōu)勢膜蛋白基因imp-DZ的克隆與原核表達

        2021-01-08 05:37:12董雅容寧鈞暉王進忠田國忠任爭光
        北京農(nóng)學院學報 2021年1期
        關鍵詞:原體膜蛋白克隆

        董雅容,楊 靜,寧鈞暉,王進忠,王 合,田國忠,任爭光*

        (1. 北京農(nóng)學院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室,北京 102206;2. 北京市林業(yè)保護站,北京 100029;3. 中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所,北京 100091)

        植原體(Phytoplasma)原稱類菌原體(Mycoplasma-like organism,MLO),是一種重要的原核生物植物病原菌[1]。植原體隸屬軟壁菌門(Tenericutes),柔膜菌綱(Mollicutes),候選植原體屬(CandidatusPhytoplasma),其主要特征是缺乏細胞壁,只有細胞膜包被[2-3]。植原體主要存在于植物韌皮部中的篩管細胞和介體昆蟲的淋巴、腸道、唾液腺等組織內(nèi),能夠引起多種農(nóng)作物、園藝作物和園林植物病害,導致植物產(chǎn)生叢枝、黃化、花變?nèi)~、帶化等癥狀,嚴重者造成植物死亡[4]。中國報道的植原體相關病害有100余種,危害嚴重的主要有棗瘋病(Jujube witches’ broom,JWB)、泡桐叢枝病(Paulownia witches’ broom,PaWB)和桑萎縮病(Mulberry drawf,MD)等[5-6]。棗瘋病是棗樹生產(chǎn)上最嚴重的自然災害,棗樹一旦得病將終生帶病,并具有強傳染性、難以治愈,高致死性的特點,被稱為棗樹的“癌癥”[7]。植原體與寄主的互作關系是植原體病理學研究的核心問題,由于沒有細胞壁,植原體分泌的蛋白和膜蛋白直接接觸寄主植物和昆蟲細胞。Clark等[8-9]研究發(fā)現(xiàn)植原體表面參與膜組成的幾種蛋白具有免疫優(yōu)勢活性,稱之為免疫膜蛋白。目前的研究表明,植原體膜上發(fā)揮互作功能的免疫膜蛋白主要有3種,即免疫優(yōu)勢膜蛋白(immunodominant membrane protein,Imp),免疫優(yōu)勢膜蛋白A(immunodominant membrane protein A,IdpA)和抗原膜蛋白(antigenic membrane protein,Amp),其中Imp蛋白可以識別寄主植物的肌動蛋白并與之結(jié)合,幫助植原體固定在寄主植物篩管分子表面,Amp蛋白則能與傳播昆蟲的肌動蛋白和肌球蛋白互作,從而利于植原體的傳播[10-11]。雖然這3種蛋白在植原體中普遍存在,但是它們之間在氨基酸序列上沒有相似性,不同組別的植原體之間的同一免疫膜蛋白氨基酸序列差異也很大[12]。

        研究前期對棗瘋病植物樣本進行了高通量測序,獲得大量棗瘋植原體序列,通過篩選得到編碼免疫優(yōu)勢膜蛋白的基因imp-DZ。該研究對imp-DZ基因進行了克隆,并探索Imp-DZ蛋白的異源表達情況,為下一步深入研究棗瘋植原體致病機制提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 供試材料

        棗瘋病樣品采集自北京市昌平區(qū)發(fā)病冬棗樹上。植物基因組DNA提取試劑盒,pBM30快速克隆試劑盒購自北京博邁德生物技術有限公司。菌株EscherichiacoliBL21(DE3)和E.coliDH5α,DNA瓊脂糖凝膠純化試劑盒,His標簽蛋白純化試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司。

        1.2 方 法

        1.2.1 棗瘋植原體imp-DZ基因序列分析 根據(jù)北京農(nóng)學院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室前期對棗瘋病植物樣品總DNA高通量測序結(jié)果(數(shù)據(jù)未發(fā)表),篩選出棗瘋植原體JWB-Dongzao編碼免疫優(yōu)勢膜蛋白基因imp-DZ的完整序列。將該序列在NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中用Blastn軟件進行比對分析,并下載其他植原體imp基因相關序列,利用DNAMAN5.0軟件進行基因完全比對,用MEGA 5.2軟件構建系統(tǒng)進化樹。

        1.2.2 免疫優(yōu)勢膜蛋白Imp-DZ特征分析 用DNAMAN5.0軟件對imp-DZ基因編碼的氨基酸序列進行翻譯,用SignalIP4.1在線預測軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalIP/)對Imp-DZ蛋白的信號肽進行分析,用TMHMM v2.0軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對Imp-DZ蛋白的跨膜區(qū)進行預測。

        1.2.3 植物總DNA的提取 取0.1 g患棗瘋病棗樹(冬棗)幼嫩葉片,用液氮研磨成粉末,采用植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA,溶解在無菌水中,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.4imp-DZ基因引物設計與PCR擴增 根據(jù)1.2.2中Imp-DZ蛋白跨膜區(qū)預測結(jié)果,設計用于PCR擴增完整imp-DZ基因序列(不包含終止密碼子)引物Imp-F(5′-CACCATGAGAGGAAAGAA GAAAATGC-3′)和Imp-R (5′-TTTGTTAATAACTGCAATTGCTG-3′);同時設計引物Imp-F2(5′-CACCAAAGAAGTTTGGCCATTCG-3′)與Imp-R配對用于擴增去掉跨膜區(qū)核苷酸的imp-DZ基因部分序列。PCR反應體系和PCR反應條件參見文獻[5]。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并用DNA瓊脂糖凝膠純化試劑盒純化回收。

        1.2.5imp-DZ基因克隆與異源表達 將1.2.4中回收的2個DNA片段連接到蛋白表達載體pBM30上,轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α中,將陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。挑選測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中,獲得重組菌。將重組菌接入含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃,150 r/min振蕩培養(yǎng)3~5 h,菌液OD600值達到0.6~0.8時,加入IPTG(50 μg/mL)誘導表達6~8 h。將誘導好的菌液在12 000 r/min離心1 min,收集菌體,加入蛋白上樣緩沖液,沸水中煮5 min,置于冰上備用,即為樣品總蛋白,同時用His標簽蛋白純化試劑盒對總蛋白進行純化。樣品總蛋白用15% SDS-PAGE電泳檢測。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 棗瘋植原體imp-DZ基因序列分析結(jié)果

        前期利用二代測序技術,對棗瘋病樣品(冬棗)總DNA進行測序,去除棗樹DNA序列后,獲得大量棗瘋植原體JWB-Dongzao的序列,通過篩選基因注釋結(jié)果,找到編碼產(chǎn)物為免疫優(yōu)勢膜蛋白的基因imp-DZ,基因大小459 bp。將該基因序列放入NCBI數(shù)據(jù)庫中進行核酸比對分析,imp-DZ與棗瘋植原體Jwb-nky全基因組(GenBank登錄號:CP025121)中一個編碼假定蛋白(hypothetical protein)的基因核苷酸一致性(identity)為96%。下載其他植原體的imp基因序列,進行全基因和編碼氨基酸序列比對分析(表1)。imp-DZ基因序列僅與同組(16SrV)的葡萄黃化植原體FD-C Piemonte和FD-D,榆樹黃化植原體ULW的imp基因核苷酸一致性在56%左右,氨基酸一致性在30%以上,與其他植原體imp基因一致性均低于50%,說明不同植原體imp基因間的差異非常大。利用MEGA 5.2軟件構建imp基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1),JWB-Dongzao的植原體與16SrV組植原體聚在一個大的分枝上,說明imp基因仍具有一定的保守性。

        表1 imp-DZ基因與其他植原體imp及相關基因一致性比較結(jié)果Tab.1 The consistency comparison of imp-DZ gene with other phytoplasma imp genes

        注:棗瘋植原體Jwb-nky為編碼假定蛋白(hypothetical protein)基因。

        Note: The gene of Jwb-nky phytoplasma was hypothetical protein gene.

        2.2 Imp-DZ蛋白特征分析結(jié)果

        用DNAMAN5.0軟件對植原體JWB-Dongzao的imp-DZ基因進行翻譯,獲得152個氨基酸序列,分子量大小約為16.8 kD,等電點10.35。將Imp-DZ的氨基酸序列用SignalIP4.1軟件進行分析,Imp-DZ不具有信號肽(數(shù)據(jù)未顯示)。用TMHMM v2.0軟件對Imp-DZ的跨膜區(qū)進行預測(圖2),Imp-DZ蛋白具有一個明顯的跨膜區(qū),跨膜區(qū)起始位置為第21個到第42個氨基酸(aa);1-20 aa為疏水區(qū)域在細胞內(nèi)部,43-152 aa為親水區(qū)域在細胞外部。

        2.3 imp-DZ基因的PCR擴增與克隆

        利用引物對Imp-F/Imp-R和Imp-F2/Imp-R分別對imp-DZ的完整基因(去除終止密碼子,大小456 bp)和去除編碼跨膜區(qū)的核酸序列(去除前126個核苷酸和終止密碼子,大小330 bp)進行PCR擴增,電泳檢測結(jié)果見圖3。擴增產(chǎn)物均在200~500 bp之間,和預計值大小相當。將兩個PCR擴增片段(分別命名為I4和I3)克隆到蛋白表達載體pBM30上,陽性克隆送公司測序,測序結(jié)果經(jīng)比對分析發(fā)現(xiàn)與高通量測序結(jié)果一致,分別得到重組質(zhì)粒pBMI4和pBMI3。

        2.4 Imp-DZ蛋白的異源表達結(jié)果

        將重組質(zhì)粒pBMI4和pBMI3分別轉(zhuǎn)入菌株E.coliBL21(DE3)中,在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h,分別加入IPTG后立即取菌體和誘導6 h后取菌體。菌體裂解后SDS-PAGE檢測表達蛋白,結(jié)果見圖4。與IPTG誘導0 h的蛋白相比,含有pBMI4的重組菌體誘導6 h后并沒有出現(xiàn)過量表達的蛋白,而包含pBMI3的重組菌體在誘導6 h后在15~25 kD之間靠近15 kD處出現(xiàn)表達量明顯增多的條帶,大小和預計的融合蛋白一致(去除跨膜區(qū)后加上載體融合序列蛋白的大小為19 kD);將包含pBMI3的重組菌體蛋白用His標簽蛋白純化試劑盒純化回收,在同一位置有單一蛋白條帶出現(xiàn)。說明克隆完整imp-DZ基因的重組質(zhì)粒(pBMI4)在大腸桿菌中并沒有表達,而去掉跨膜區(qū)后(pBMI3),Imp-DZ蛋白得到大量表達。

        3 討 論

        該研究從棗瘋植原體JWB-Dongzao(16SrV組B亞組)的高通量測序結(jié)果中篩選到免疫優(yōu)勢膜蛋白編碼基因imp-DZ,與imp-DZ基因序列一致率最高的是16SrV組A亞組的榆樹黃化植原體ULW,C亞組的葡萄黃化植原體FD-C Piemonte和FD-D,但氨基酸一致率僅有30%左右,由此可見Imp蛋白在不同亞組成員之間仍存在著較大差異。利用imp基因核苷酸序列構建系統(tǒng)樹,棗瘋植原體同16SrV組其他植原體聚在一起,說明16SrV組植原體的imp基因仍具有共同的起源。

        植原體的3種免疫膜蛋白(Imp、IdpA、Amp)雖然在氨基酸水平上無相似性,但有一些共同的特點,即都是鑲嵌在細胞膜上的蛋白,靠近兩端(N端和C段)有疏水區(qū)域構成的跨膜區(qū)。不同的是Imp蛋白一般具有一個跨膜區(qū),靠近N端,C端是親水區(qū)域裸露在細胞外部,而IdpA和Amp兩端具有2個跨膜區(qū),中間部分為親水區(qū)域在細胞外部[13]。然而,正是由于這些跨膜區(qū)的存在影響免疫膜蛋白的異源表達。例如岳紅妮等[14]在用原核表達系統(tǒng)對泡桐叢枝植原體PaWB-Shaanxi的Amp蛋白進行表達過程中發(fā)現(xiàn),表達免疫膜蛋白全長基因和切除C端的跨膜區(qū)均未檢測到相應表達蛋白。牟海青等[15]只克隆泡桐叢枝植原體抗原膜蛋白amp基因中間編碼親水區(qū)域的核苷酸片段進行異源表達,結(jié)果成功表達相應的蛋白。同樣的,在E.coli中表達Imp的完整蛋白時,大腸桿菌的生長受阻,表達出的蛋白較少或無法表達出蛋白,而去掉跨膜區(qū)后能成功高表達Imp蛋白[10,12]。該試驗結(jié)果也證實這一現(xiàn)象,棗瘋植原體JWB-Dongzao的Imp-DZ具有一個跨膜區(qū),無外泌信號肽,只有去掉跨膜區(qū)后才能成功表達出Imp-DZ蛋白。這種現(xiàn)象可能與植原體跨膜蛋白對大腸桿菌具有毒性有關,過量表達疏水膜蛋白可能導致大腸桿菌膜蛋白合成途徑飽和,導致大腸桿菌因ATP合成不足而死亡[16]。也有研究顯示表達攜帶跨膜區(qū)的Imp蛋白主要以包涵體形式存在,另外溫度,加入IPTG時大腸桿菌的濃度,IPTG的終濃度和誘導時間都會影響Imp蛋白的表達量[17]。

        該研究對棗瘋植原體的免疫膜蛋白imp-DZ基因進行克隆,對基因和蛋白編碼序列進行分析,并在大腸桿菌中成功表達Imp-DZ蛋白,為后續(xù)特異性抗體制備和開發(fā)植原體免疫檢測方法奠定基礎,也為進一步了解植原體與寄主植物互作機理提供依據(jù)。

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