李培謙，楊 瑾，馮寶珍

(運(yùn)城學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 運(yùn)城 044000)

琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase,SDH)也被稱為復(fù)合體II(Complex II)或琥珀酸泛醌還原酶(succinate-ubiquinone oxidoreductase,SQR)，是真菌呼吸鏈的重要組分，該復(fù)合體由四個(gè)亞基組成，即黃素蛋白(SdhA)、鐵硫蛋白(SdhB)及兩個(gè)膜錨定蛋白(SdhC和SdhD)[1]。琥珀酸脫氫酶抑制劑(succinate dehydrogenase inhibitor,SDHI)類殺菌劑通過覆蓋線粒體復(fù)合體II輔酶Q位點(diǎn)，阻斷電子由鐵硫中心向輔酶Q傳遞，從而干擾真菌的呼吸作用，阻礙其能量代謝，抑制病原菌的生長，導(dǎo)致其死亡[1,2]。由于SDHI類殺菌劑獨(dú)特的作用模式，與其他殺菌劑甲氧基丙烯酸酯類(Strobilurin)、苯并咪唑類(benzimidazoles)以及苯胺嘧啶類(anilinopyrimidines)不存在交互抗性，曾經(jīng)是抗藥性管理和病害防治的最佳選擇[3,4]。第一代SDHI類殺菌劑于上世紀(jì)60年代末上市如萎銹靈(carboxin)主要用于防治銹病和菌核病，而對其他病原菌的防治報(bào)道很少[5]。新一代SDHI類殺菌劑主要成分諸如啶酰菌胺(boscalid)、氟吡酰菌胺(furametpyr)、吡噻菌胺(penthiopyrad)、thifluzamide、bixafen以及isopyrazam、penflufen等具有廣泛的殺菌譜可用于多種作物[3,6]。但是由于作用位點(diǎn)單一，以及高頻廣泛應(yīng)用促使大田病原菌群體產(chǎn)生選擇抗性。新一代SDHI類殺菌劑，大大改善了病害防控效果，然而上市不久很多大田病原菌對其產(chǎn)生了抗性[7]。本文綜述了植物病原真菌對SDHI類殺菌劑抗性的機(jī)制及進(jìn)化情況，對此類殺菌劑的應(yīng)用和開發(fā)提出建議。

1.SDHI類殺菌劑的作用方式和靶標(biāo)位點(diǎn)

SDHI類殺菌劑的靶標(biāo)是呼吸鏈上的琥珀酸脫氫酶復(fù)合體(即復(fù)合體II，或琥珀酸泛醌還原酶SQR)[2]。有氧呼吸過程中，琥珀酸脫氫酶復(fù)合體將線粒體基質(zhì)中的琥珀酸氧化為延胡索酸，同時(shí)將線粒體膜上疏水電子載體泛醌(UQ)還原為UQH2[8]。除了在呼吸系統(tǒng)中起到脫氫酶作用，SDH在三羧酸循環(huán)中也起到重要作用。線粒體SDH復(fù)合物由膜周邊結(jié)構(gòu)域和膜錨定結(jié)構(gòu)域組成(圖1)。復(fù)合體的外圍區(qū)域有兩個(gè)親水性的亞基組成SDHA和SDHB，形成復(fù)合體的可溶性部分并且具有琥珀酸脫氫酶活性，將琥珀酸氧化為延胡索酸。SDHA是一種黃素蛋白(Fp)，具有共價(jià)的FAD共因子，是催化部位的一部分。SDHB是一種鐵硫蛋白(Ip)，具有三個(gè)不同的鐵硫簇，為FAD與膜醌間電子傳遞服務(wù)(圖1)[9,10]。

圖1 復(fù)合體II亞基結(jié)構(gòu)及酶活性[10]

各物種中Fp和Ip基因序列高度保守，說明是由共同的祖先基因進(jìn)化而來[9]。整個(gè)膜錨定區(qū)域由兩個(gè)疏水蛋白亞基SDHC和SDHD組成。除蛋白外組分外，復(fù)合體II還包含一個(gè)血紅素b基團(tuán)，復(fù)合于SDHC和SDHD之間[9,11]。由于血紅素b含量差異和序列同源性很低，致使疏水膜域存在多樣性。膜錨定區(qū)域包含泛醌還原和抑制劑的結(jié)合位點(diǎn)，并將催化亞單位(Fp和Ip)固定在線粒體內(nèi)膜上，從而促進(jìn)電子向輔酶醌的傳遞[12]。SDHI類殺菌劑通過覆蓋泛醌位點(diǎn)阻斷電子由[3Fe-4S]向輔酶Q傳遞來干擾呼吸[8,13]。

2. SDHI類殺菌劑抗性分子機(jī)制

2.1 萎銹靈抗性

多種病原物已對萎銹靈及其結(jié)構(gòu)類似物產(chǎn)生了抗性，而且抗藥性源于病原菌SDH基因突變。玉米黑粉病Ustilagomaydis對萎銹靈的抗性是由于SDHB基因上保守的257位組氨酸殘基突變?yōu)槔野彼峄蛄涟彼嵋?9H257Y/L)[14]。對大腸桿菌Escherichia coli泛醌結(jié)合位點(diǎn)(Q位點(diǎn))結(jié)構(gòu)分析顯示存在兩個(gè)潛在的結(jié)合位點(diǎn)；其中一個(gè)潛在的Q位點(diǎn)與保守的組氨酸殘基非常接近，表明了組氨酸在泛醌結(jié)合和還原中起作用[8]。該研究中還發(fā)現(xiàn)萎銹靈與泛醌在保守組氨酸(H207)附近以同樣的方式結(jié)合，這些結(jié)果足以說明組氨酸殘基與SDHI類殺菌劑結(jié)合的重要性。禾生球腔菌Mycosphaerellagraminicola中SDHB基因突變H267L/Y導(dǎo)致了對萎銹靈的抗性[15]。在Xanthomonascampestris中SDHB基因第229位組氨酸突變導(dǎo)致抗性產(chǎn)生[16]。有些報(bào)道表明，萎銹靈抗性還與膜錨定蛋白SDHC和SDHD突變有關(guān)[1]。擔(dān)子菌Coprinuscinereus對氟酰胺抗性菌株的SDHC基因發(fā)生點(diǎn)突變，80位天冬酰胺被賴氨酸取代N80K[1]，該突變株對萎銹靈表現(xiàn)出交叉抗性。已經(jīng)從稻瘟病菌分離到萎銹靈抗性菌株，并鑒定了(SDH)B、C和D亞基的三個(gè)基因位點(diǎn)的突變情況，它們均與抗藥性有關(guān)[17]。

2.2 啶酰菌胺抗性

大田和實(shí)驗(yàn)室關(guān)于絲狀真菌對啶酰菌胺的抗性早有報(bào)道(見表1)。很多學(xué)者已對啶酰菌胺抗性機(jī)制進(jìn)行了研究，基因測序結(jié)果表明抗性產(chǎn)生是sdhB、sdhC和sdhD氨基酸殘基突變造成的。

表1 對SDHI類殺菌劑抗性植物病原菌適應(yīng)度變化

有研究表明Alternariaalternata對啶酰菌胺抗性源于sdhB發(fā)生S221P、H267N/Y、H272Y/R突變和sdhDD129E突變，并且對啶酰菌胺表現(xiàn)高抗水平性的菌株對萎銹靈存在交互抗性[18]。馬鈴薯早疫病(A.solali)sdhC及sdhD基因發(fā)生突變引起對啶酰菌胺的抗性的產(chǎn)生[19]。對黃瓜褐斑菌(Corynesporacassiicola)抗性菌株測序發(fā)現(xiàn)sdhB基因發(fā)生H278Y突變[20]，后來的研究還發(fā)現(xiàn)該菌sdhC或sdhD基因突變都能導(dǎo)致對啶酰菌胺抗性[21]。

對大田啶酰菌胺抗性的灰葡萄孢B.cinerea菌株測序發(fā)現(xiàn)，sdhB基因同時(shí)存在兩個(gè)位點(diǎn)突變，即H272Y/R和P225L/T/F。分子建模研究表明所有的突變氨基酸都位于或靠近泛醌結(jié)合位點(diǎn)，突變導(dǎo)致了與SDHI類殺菌劑親和力的下降或喪失[3]。對大田灰霉菌(Botrytiscinerea)啶酰菌胺抗性菌株分析發(fā)現(xiàn)sdhB基因除了H278R突變外，還出現(xiàn)了H267L/R、P225F/L、N230I等多位點(diǎn)突變[22,23]?；颐咕鷖dhD基因272位組氨酸突變?yōu)榱涟彼?H272L)、230位天冬氨酸突變?yōu)榱涟彼?N230I)以及132位組氨酸突變?yōu)榫彼?H132R)也能導(dǎo)致病原菌抗性的產(chǎn)生[24]。林澤松等對果蔬灰霉病抗性菌株分析發(fā)現(xiàn)啶酰菌胺抗性菌株的琥珀酸脫氫酶B亞基發(fā)生了3處突變包括H272R、P225F和N230I，其中H272R型突變?yōu)橹饕愋?；同時(shí)C亞基的發(fā)生了4種突變[25]。劉欣等利用AS-PCR分析了上海地區(qū)草莓灰霉菌抗性菌株發(fā)現(xiàn)sdhB基因發(fā)生了P225F、N230I、H272R和H272Y 4種突變類型[26]。此外，Li et al.也發(fā)現(xiàn)草莓灰葡萄孢啶酰菌胺抗性菌株以B亞基H272R突變?yōu)橹鱗27]。

此外，實(shí)驗(yàn)室紫外誘變Penicilliumexpansum菌株對boscalid高抗，測序分析其B亞基發(fā)生了點(diǎn)突變H272R/Y[28]。

由于sdhB基因在生物體內(nèi)高度保守，各種病原菌中突變的組氨酸殘基也是保守的。比如A.alternata中His277與B.cinerea的His272、U.maydis的His257、M.graminicola中His267以及X.campestris中His229是相對應(yīng)的[29]。盡管各物種錨定蛋白基因sdhC和sdhD同源性很低，但是泛醌結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸卻非常保守，突變的氨基酸可能參與殺菌劑的結(jié)合作用[29]。

2.3 其他

通過紫外線誘導(dǎo)獲得了對多種SDHIs具有抗性的5個(gè)Ramulariacollo-cygni菌株，并對琥珀酸多氫酶亞基測序結(jié)果顯示sdhC發(fā)生H142R突變的菌株對boscalid高抗(RF=1114)，而對另外4種SDHIs(bixafen、isopyrazam、carboxin和fluopyram)表現(xiàn)中抗(16

3. 抗性突變體檢測方法

3.1 生物測定法

殺菌劑抗性監(jiān)測對于評估藥效和揭示病原菌敏感性早期轉(zhuǎn)變是必不可少的，也可為殺菌劑施用提供建議。

抗藥性監(jiān)測的第一步是建立病原菌對某一殺菌劑的敏感基線[33]。利用傳統(tǒng)的生物測定法測定了多種病原物對SDHIs的敏感基線，并檢測到多種重要病原體的抗性菌株。利用微量滴定板液體培養(yǎng)基中菌絲生長測定法，作為建立基線靈敏度和監(jiān)測殺菌劑抗藥性的方法。比如Sclerotiniasclerotiorum[3]、灰葡萄孢[34]核盤菌及Moniliniaspp.[35]等都是利用此法測定的。還可以利用含有藥的平板測定菌絲生長速率和分生孢子萌發(fā)法來檢測敏感性，如Alternariaspp.[36]、B.cinerea[4,37,38]、R.cerealis[31]以及P.expansum[28]等都是利用此類方法測定敏感性。敏感基線的建立不僅促進(jìn)了利用單一鑒別劑量的殺菌劑進(jìn)行快速體外監(jiān)測程序發(fā)展，而且還適用于廣泛的監(jiān)測研究。

3.2 分子檢測法

傳統(tǒng)的殺菌劑抗性測定方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而利用DNA分析可以快速準(zhǔn)確地檢測病原菌群體中抗性等位基因的突變情況以進(jìn)行抗性風(fēng)險(xiǎn)評估。DNA檢測技術(shù)的應(yīng)用可以改善風(fēng)險(xiǎn)評估，優(yōu)化抗性管理，以及新農(nóng)藥產(chǎn)品的推廣普及。利用限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、等位基因特異性(AS-PCR)以及微衛(wèi)星引物分析(MP-PCR)等手段都可以檢測抗性菌株靶標(biāo)基因突變情況。利用RFLP能夠分析鏈格孢對啶酰菌胺抗性的不同基因突變類型H277R、H133R、H134R、D123E[18]。通過AS-PCR可以分子診斷鏈格孢SDHB基因發(fā)生的H277R/Y突變以及SDHC基因的H134R突變[18]。利用AS-PCR分析了抗啶酰菌胺灰葡萄孢sdhB基因序列發(fā)生的抗性突變類型[25,26]。Yin et al.利用MP-PCR區(qū)分了對啶酰菌胺抗性灰葡萄孢H272R/Y突變的菌株[37]。此外，利用同源克隆法分析啶酰菌胺抗抗性菌株sdhA、sdhB、sdhC和sdhD基因序列發(fā)現(xiàn)sdhB基因發(fā)生點(diǎn)突變[27,39]。利用分子診斷方法，對180個(gè)鏈格孢的啶酰菌胺抗性菌株檢測，發(fā)現(xiàn)發(fā)生H277Y或H277R突變的菌株分別達(dá)到45%和35%。只有5個(gè)菌株C基因發(fā)生了H134R突變。并且分子診斷分析與傳統(tǒng)分析的結(jié)果一致，更說明了作為常規(guī)檢測方法，分子檢測準(zhǔn)確性和可靠性[29]。

4.SDHI啶酰菌胺抗性菌株的適應(yīng)度評估

適應(yīng)度是生物個(gè)體在環(huán)境中生存的能力，這種能力能夠遺傳給下一代[40]。適應(yīng)度既可以衡量個(gè)體在環(huán)境中的表現(xiàn)，也可以比較群體中不同個(gè)體的表現(xiàn)差異。植物病原真菌的適應(yīng)度組成項(xiàng)目通常包括孢子的形成萌發(fā)、菌絲生長、致病性、突變類型、呼吸速率、酶活性以及種群結(jié)構(gòu)等方面[22,23,41,42]。在殺菌劑選擇壓力下，病原菌抗藥性的產(chǎn)生伴隨著適應(yīng)度代價(jià)[43]。因此，從適合度角度描述抗藥菌株對于預(yù)測未來整個(gè)種群的行為和實(shí)施病害控制策略是至關(guān)重要的。目前很多學(xué)者都對病原菌適應(yīng)度進(jìn)行了研究，但由于試驗(yàn)條件差異以及評判標(biāo)準(zhǔn)不同致使實(shí)驗(yàn)結(jié)果迥異(見表1)。

鏈格孢實(shí)驗(yàn)室突變體sdhB(S221P、H267N、H267Y)和sdhD(D129E)類型菌絲在正常條件下生長速率無明顯變化，但是在氧化壓力下生長速率降低[18]。田間鏈格孢突變株sdhD-D123E類型產(chǎn)孢量下降，氧化敏感性增強(qiáng)，而其他類型如B-H277Y/R、C-H134R和D-H133R突變菌株無適應(yīng)度變化[44]。sdhD-D123E,sdhB-H277/8 Y/R,sdhC-H134R,及sdhD-H133R突變的菌株中也沒有發(fā)現(xiàn)菌絲生長速率及分生孢子活力變化[36]。實(shí)驗(yàn)室獲得的Z.tritici抗性菌株線粒體呼吸速率明顯降低，但在菌體生長速率及致病性方面無明顯變化[45]。據(jù)報(bào)道，大田Corynesporacassiicola和D.bryoniae抗/感菌株的致病性不存在差異[29]。Ramulariacollo-cygni和P.expansum抗性突變菌株致病力無明顯變化[30,46]。然而，Rhizoctoniasolan突變體菌核產(chǎn)量和致病力均明顯下降[29]。

大田和實(shí)驗(yàn)室條件下對灰霉菌適應(yīng)度研究結(jié)果迥異。有研究發(fā)現(xiàn)H272R/Y/L、P225F和N230I突變型菌株在菌絲生長速率、產(chǎn)孢量、菌核產(chǎn)量以及對滲透壓敏感性方面與敏感性菌株間無明顯差別[38]。而競爭分析試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)H272R/Y/L,N230I,和P225F突變型菌株的適應(yīng)度均低于敏感性菌株[23]。等位基因轉(zhuǎn)化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)H267L/R菌株在一定培養(yǎng)基上高溫下生長較慢，但在基本培養(yǎng)基上的低溫下生長較快；P225L/H272R型轉(zhuǎn)化子菌核產(chǎn)量明顯減少[22]。有些病原菌的sdhB突變株對氟吡菌酰胺沒有交互抗性或者表現(xiàn)負(fù)交互抗性，但是其他的突變類型，特別是sdhC突變菌株對現(xiàn)有的SDHI都表現(xiàn)高抗[45]。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分析往往檢測菌體生長速率或者無性孢子產(chǎn)量方面明顯的變化，然而對于較小的適應(yīng)性差異，需要采用靈敏度更大的競爭分析法。競爭分析法更貼近自然條件，將抗性和敏感性菌株按一定比例混合侵染大田寄主，然后qPCR法測量抗性菌株等位基因含量[49]。競爭分析法更能評估病原菌群體總的適合度，對今后適合度評估具有重要現(xiàn)實(shí)意義[41]。然而，迄今還沒有關(guān)于就抗性風(fēng)險(xiǎn)評估的適應(yīng)度測定方法的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

5. 研究展望

通過了解與抗性起源、發(fā)展和傳播有關(guān)的因素，可以在最大程度上實(shí)現(xiàn)有效的抗性預(yù)防和策略制定。盡管殺菌劑抗藥性是限制藥效和使用壽命的一個(gè)關(guān)鍵因素，但是抗性也有助于我們在分子水平上了解殺菌劑的作用機(jī)制。利用分子遺傳技術(shù)，已經(jīng)在病原菌的靶基因中發(fā)現(xiàn)與SDHI抗性相關(guān)單個(gè)核酸多態(tài)性。新的SDHI殺菌劑已經(jīng)開發(fā)出來，其中一些與現(xiàn)有的SDHI具有不同的交互抗性模式。殺菌劑的內(nèi)在活性是基于對目標(biāo)位點(diǎn)的特異性和親和力和結(jié)合強(qiáng)度。SDHI殺菌劑活性的差異可能是由于它們與抑制劑結(jié)合位點(diǎn)中琥珀酸脫氫酶亞基中氨基酸殘基的結(jié)合親和力或相互作用的差異所致。對真菌病原菌中SDH基因氨基酸突變情況的了解有助于對這類殺菌劑抗性機(jī)制的認(rèn)識。這將促進(jìn)發(fā)展快速可靠的分子診斷技術(shù)，以便在大范圍內(nèi)仔細(xì)監(jiān)測對SDHI殺菌劑的抗性，并進(jìn)一步幫助設(shè)計(jì)抗性管理策略，以及針對特定真菌病原體UQ位點(diǎn)的活性成分替代抑制劑。