張 欣 馬小茹

(佳木斯大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

糖尿病是一種全球流行病，目前影響全球4億多成年人，預(yù)計到2040年將增加到6億多人[1]。這是一種以高血糖為特征的復(fù)雜的慢性代謝系統(tǒng)疾病，由胰島素作用和/或分泌受損引起，易引發(fā)血管并發(fā)癥,可導(dǎo)致多器官功能損傷和衰竭，男性睪丸損傷是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一[2]。隨著糖尿病的發(fā)病率增高，男性睪丸損傷導(dǎo)致的不育癥的患者也日益增多。研究顯示[3]，糖尿病生殖損傷是導(dǎo)致男性不育癥的重要原因之一，對人類的生殖健康具有嚴重的危害。該病的特點是性器官病變，性激素水平紊亂和精子細胞結(jié)構(gòu)缺陷。其病因和發(fā)病機制復(fù)雜，是多因素的，包括肥胖[4]，高血糖[5]，脂代謝紊亂以及年齡，病程等。這都與糖尿病引起的男性生殖障礙有著密切關(guān)系。近年來，隨著對自噬的研究越來越深入，人們認識到糖尿病男性睪丸損傷的發(fā)生發(fā)展過程與自噬的參與密不可分[6]，自噬的調(diào)控極可能會成為糖尿病男性睪丸損傷新的潛在治療靶點。

自噬存在于所有真核生物中，是受自噬相關(guān)蛋白(ATG)調(diào)控的細胞內(nèi)降解系統(tǒng)，細胞物質(zhì)通過該系統(tǒng)被遞送至溶酶體并在溶酶體中降解。然而，自噬的目的不是簡單地消除這些物質(zhì)成分，而是作為一種動態(tài)的循環(huán)系統(tǒng)，為細胞修復(fù)和體內(nèi)平衡產(chǎn)生新的構(gòu)件和能量[7，8]。它可以通過單個或多個信號路徑，通過各種內(nèi)部或外部刺激來觸發(fā)。此外，在不利的情況下，低氧、活性氧(ROS)和未折疊蛋白的積累也可引起自噬作為細胞保護機制。自噬體的生物發(fā)生始于起始的吞噬膜[9]，然后，激活的UNC-51樣激酶1(ULK1)復(fù)合物被募集到起始吞噬細胞膜上，并使膜上的磷脂酰肌醇磷酸化，形成磷脂酰肌醇-3-磷酸酯(PI3P)[10]。PI3P將效應(yīng)蛋白吸收到該膜上，隨后，吞噬細胞膜經(jīng)歷伸長，延伸階段需要ATG5-ATG12偶聯(lián)系統(tǒng)和微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)/ATG8偶聯(lián)系統(tǒng)，然后形成雙膜自噬體[11]。成熟的自噬體與溶酶體融合以形成自溶體。自噬不僅通過降解非必需的細胞質(zhì)成分來提供能量，還能夠維持細胞體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。有趣的是，有研究[12]發(fā)現(xiàn)，暴露于外源性應(yīng)激刺激后，自噬的抑制作用可促進睪丸支持細胞的存活，研究認為過度的自噬反而會加速細胞的凋亡。研究數(shù)據(jù)表明自噬的抑制是解釋支持細胞(SC)應(yīng)對壓力的穩(wěn)健性的可能機制。這更加證明了一點：自噬是把雙刃劍，且其發(fā)揮保護作用的機制也是有兩面性的。有實驗研究發(fā)現(xiàn)，鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠睪丸中自噬相關(guān)蛋白Beclin1，LC3的表達明顯降低，這說明了在糖尿病狀態(tài)下睪丸組織自噬被抑制[13]。根據(jù)各種實驗數(shù)據(jù)和現(xiàn)象證明，自噬參與了糖尿病睪丸損傷的發(fā)生發(fā)展，值得引起更多的關(guān)注。因此，就男性睪丸組織的自噬現(xiàn)象以及糖尿病男性睪丸損傷自噬相關(guān)信號通路的研究進展作一綜述。

1 睪丸細胞的自噬現(xiàn)象

睪丸是男性主要的生殖器官，由曲精細管和間質(zhì)細胞組成，其生精作用和分泌性激素作用共同促進精子的生長發(fā)育，并保證正常的性功能。研究表明，睪丸組織中均有不同水平的自噬，如睪丸支持(sertoli)細胞、睪丸間質(zhì)(leydig)細胞、脂質(zhì)吞噬。尤其脂質(zhì)吞噬[14]的自噬現(xiàn)象研究更為新穎。

1.1 睪丸支持(sertoli)細胞

支持細胞呈不規(guī)則的高錐體形，細胞基部附著在基膜上，頂部伸至曲精小管腔面，是睪丸結(jié)構(gòu)的第二大特征，睪丸不能在沒有支持細胞幫助的情況下產(chǎn)生成熟的生殖細胞。應(yīng)充分認識到它們在睪丸組織中的中心位置[15]，其在男性生殖器官中的生精功能中發(fā)揮著重要的作用。支持細胞受損以鏡下大量生殖細胞脫落等形態(tài)變化為典型特征，幾乎參與了所有睪丸損傷生殖障礙的病理發(fā)展過程。支持細胞或已成為男性不育的治療靶點。

睪丸支持細胞存在著較明顯的自噬現(xiàn)象，并且在睪丸的正常生長發(fā)育和男性不育癥的病理發(fā)展中都有重要參與，這一過程對于維持睪丸組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和功能正常起到關(guān)鍵作用。ATG5是男性生殖細胞發(fā)育中的一種核心自噬蛋白，有實驗研究[16]表明，將雄性小鼠生殖細胞中的ATG5條件性失活，然后檢測自噬指標。實驗結(jié)果顯示睪丸自噬體標記LC3A/B-II的表達顯著降低，自噬受體SQSTM1/p62的表達顯著增加，這表明睪丸自噬活性降低，且雄性小鼠的生育能力急劇下降，約70%的小鼠不能生育，極大地增加了罹患男性不育癥的幾率。這提示自噬可保護睪丸組織，是支持細胞在應(yīng)激狀態(tài)下的有效保護機制。研究表明[17]，在山羊睪丸支持細胞(SC)的細胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了許多自噬體和溶酶體，它們圍繞著生精小管基部隔室中的生精細胞。在較晚的階段，SC表現(xiàn)出自噬體和自溶酶體，在頂體形成不同階段的精子發(fā)生過程中，與多囊泡體(MVB)一起使用。在SC的細胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了許多包埋的細長的精子，被自噬成分和MVB包圍。在透射電鏡下，自噬體的平均直徑為952.35 nm，自溶酶體的平均直徑為504.38 nm?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明，自噬在SC中活躍，并且隨著精子發(fā)生從SC的基底腔向腔腔的發(fā)展，自噬的水平變得更加明顯。在高血糖狀態(tài)下，自噬在睪丸組織中是受抑制的，且精子的存活率和精子活力也受到抑制，而睪丸的支持細胞是在睪丸生精作用中發(fā)揮著重要影響。核因子E相關(guān)因子(2cnuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)是諸多細胞信號道路中最重要的一種，是一種基礎(chǔ)轉(zhuǎn)承調(diào)節(jié)因子。有實驗[18]表明，睪丸支持細胞在受到氧化應(yīng)激刺激時會使Nrf2通路表達下降，鏡下觀察細胞數(shù)量明顯減少，部分細胞形態(tài)不規(guī)則。而已有文獻報道[19]自噬通過破壞Nrf2加劇糖尿病的睪丸氧化損傷。綜合來看，研究睪丸支持細胞自噬對糖尿病引起的生殖障礙機制有新的啟示。

1.2 睪丸間質(zhì)(leydig)細胞

睪丸激素是重要的成年男性激素，是性發(fā)育和維持男性特征所必需的[20，21]。血清睪丸激素水平不足通常與原發(fā)性或遲發(fā)性性腺功能低下(LOH)有關(guān)[22](LOH)，這不僅與男性性功能障礙和生殖能力下降有關(guān)，而且與心血管疾病，糖尿病[23]有關(guān)。睪丸激素主要在Leydig細胞中合成，據(jù)報道該細胞自噬非常活躍[24]。最近的研究[25]表明，老年大鼠Leydig細胞的自噬活性降低，并且在大腦中具有ATG5表達的自噬缺陷型小鼠中性激素水平降低[26]。因為自噬已經(jīng)通過稱為大脂質(zhì)的過程參與脂質(zhì)代謝，從而為細胞提供甘油三酸酯(TGs)和膽固醇的來源，所以推測自噬可能通過促進Leydig細胞中的脂質(zhì)代謝而參與睪丸激素的合成。為了進一步驗證該假設(shè)，有實驗檢測到成年小鼠睪丸中LC3和脂滴(LD)的精確定位，與先前在肝細胞和巨噬細胞泡沫細胞中的發(fā)現(xiàn)一致[27]。根據(jù)這些研究，我們得出結(jié)論，自噬在成年小鼠Leydig細胞中極為活躍，并可能通過脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)類固醇生成。有實驗[28]證明，在鏈脲佐菌素誘發(fā)的糖尿病大鼠模型中形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示Leydig細胞中的細胞凋亡和壞死，其特征在于染色質(zhì)碎裂和凝集，以及光滑的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，沒有脂質(zhì)滴、細胞質(zhì)。由于自噬是一種細胞代謝過程，利用溶酶體降解細胞成分來提供原材料，以幫助細胞在壓力條件下存活，所以在睪丸間質(zhì)細胞中見到的細胞質(zhì)自噬體可能是自噬活性缺陷的跡象，這與這些細胞中睪丸激素的低分泌有關(guān)。總之，這些結(jié)果證明了自噬是糖尿病患者性腺功能減退導(dǎo)致不育癥的重要治療方向。

2 調(diào)控自噬相關(guān)信號通路對糖尿病男性睪丸損傷發(fā)生發(fā)展的影響

糖尿病男性睪丸損傷的發(fā)生與mTOR、AMPK等通路密切相關(guān)，在細胞的營養(yǎng)狀況發(fā)生改變的條件下(如高血糖)，可調(diào)控自噬[29]。眾多證據(jù)表明，在正常和糖尿病睪丸損傷機體中，自噬均發(fā)揮著關(guān)鍵作用，STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中自噬受到抑制。因此，調(diào)控自噬相關(guān)的通路可能是一個新的方向。

2.1 mTOR通路

雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶。mTOR的編碼主調(diào)節(jié)蛋白激酶，其主要調(diào)節(jié)細胞發(fā)育過程，如生長，增殖，代謝，分化，自噬，蛋白質(zhì)合成，和細胞骨架調(diào)節(jié)[30]。各種各樣的細胞內(nèi)和細胞外刺激可以指導(dǎo)這些事件，這些事件以細胞類型特異性的方式差異發(fā)生。mTOR信號的失調(diào)已經(jīng)牽涉到許多人類疾病中，包括糖尿病[31]。其中，人們強調(diào)mTOR信號通路是自噬的最主要調(diào)節(jié)劑,在自噬的誘導(dǎo)，過程和終止中起著復(fù)雜的作用，這給糖尿病及并發(fā)癥的發(fā)病機制和防治都提出了新的觀點。MTOR通過兩種不同的信號傳導(dǎo)蛋白質(zhì)復(fù)合物起作用：mTORC1和mTORC2。在營養(yǎng)素或生長因子剝奪和低細胞能量水平下，已顯示抑制mTORC1活性，誘導(dǎo)了自噬的發(fā)生。這表明自噬誘導(dǎo)和mTORC1激活緊密反向耦合，對mTORC2活性誘導(dǎo)自噬尚未完全了解[32]。激活mTOR會使雄性小鼠的睪丸發(fā)育缺陷，加重不育癥。研究[33]表明，mTORC1激活促進小鼠精原細胞分化，但是過度激活會導(dǎo)致低生育力。在實驗中，有條件地在小鼠體內(nèi)敲除掉mTORC1抑制劑TSC1，小鼠表現(xiàn)出睪丸發(fā)育缺陷、部分生精停滯、生殖細胞過度損失、精子數(shù)量減少和生育力低下。也就是說，mTORC1的過度激活損害精子發(fā)生，使小鼠的生殖系統(tǒng)受到嚴重的損傷。據(jù)報道，中度自噬對高血糖[34]引起的睪丸損傷具有保護作用。而自噬異常則會導(dǎo)致男性不育。在各種應(yīng)激和高糖條件下，信號傳導(dǎo)途徑是哺乳動物生殖細胞自噬的典型負調(diào)控途徑。在糖尿病男性不育癥的發(fā)病機理中，活性氧(ROS)起著至關(guān)重要的作用[35]。研究報告稱，長期高血糖生物體中過度產(chǎn)生的ROS會顯著抑制mTOR信號傳導(dǎo)途徑，從而影響細胞自噬功能，從而導(dǎo)致精子的變性和畸形，并影響精子的數(shù)量、運動性和附睪的功能[36，37]。近年的研究[38]表明，鏈脲菌素(STZ)誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠睪丸組織中自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3表達降低，p62表達上調(diào)，這提示糖尿病大鼠睪丸組織的自噬被抑制。在雷帕霉素治療之后，睪丸Beclin1、LC3表達水平顯著升高，均p62表達水平顯著降低，睪丸組織病理改變顯著減輕。這提示雷帕霉素改善了大鼠睪丸的損傷，雷帕霉素是mTOR的抑制劑，抑制mTORC1后對糖尿病大鼠睪丸產(chǎn)生保護作用，提示自噬激活對睪丸具有保護作用。

自噬可能是通過mTOR通路對改善糖尿病男性生殖障礙起作用，這為臨床治療提供更多的機會。

2.2 AMPK通路

真核細胞中，AMP激活的蛋白激酶(AMPK)在調(diào)節(jié)細胞能量平衡中起主要作用。AMPK響應(yīng)于細胞內(nèi)腺嘌呤核苷酸水平的變化，這相對于ATP被AMP / ADP的增加所激活。AMPK的激活增加了分解代謝(ATP生成)的速率，并降低了合成代謝(ATP利用)的速率。除維持細胞內(nèi)能量平衡外，AMPK還調(diào)節(jié)全身能量代謝。鑒于其在控制能量穩(wěn)態(tài)中的關(guān)鍵作用，AMPK作為代謝疾病(包括2型糖尿病和癌癥)的潛在治療靶標引起了廣泛的關(guān)注[39]。近些年的研究結(jié)果顯示，在內(nèi)分泌受到干擾的情況下，如黃曲霉素B1(AFB1)體內(nèi)實驗顯示血清睪丸激素(T)，促黃體生成激素(LH)和促卵泡激素(FSH)的水平，減少了Leydig細胞數(shù)量并下調(diào)了水平睪丸激素生物合成相關(guān)基因的表達。體外研究表明，AFB1(10 μM)通過抑制某些T生物合成基因的表達，顯著提高ROS水平，并降低Leydig細胞的T產(chǎn)生。此外，AFB1通過降低pAMPK/AMPK比和增加pmTOR/mTOR比，然后進一步上調(diào)自噬和凋亡蛋白LC3，Beclin 1和BAX，誘導(dǎo)Leydig細胞凋亡，以及下調(diào)自噬通量蛋白P62和抗凋亡蛋白BCL-2。AFB1誘導(dǎo)的Leydig細胞毒性是通過抑制T-生物合成基因表達，減少Leydig細胞數(shù)量，促進ROS產(chǎn)生以及通過抑制AMPK/mTOR介導(dǎo)的自噬通量途徑誘導(dǎo)細胞凋亡來表征的[40]。慢性高血糖癥和活性氧(ROS)的過量產(chǎn)生是糖尿病生殖并發(fā)癥發(fā)展的有力預(yù)測指標，實驗[41]研究結(jié)果說明糖尿病大鼠睪丸中的ROS增多，睪丸結(jié)構(gòu)損傷，精子數(shù)量和活力均降低。綜上所述，提示研究藥物可以通過上調(diào)pAMPK/AMPK比例這一角度，來進一步下調(diào)自噬，從而對大鼠睪丸起到保護作用。

3 結(jié)語

近年來，為尋找防治糖尿病不育癥的方法，越來越多的研究涉及到糖尿病不育發(fā)生發(fā)展的分子機制。自噬作為一種機體的自我保護機制，在糖尿病睪丸損傷的發(fā)生發(fā)展過程中所發(fā)揮的重要作用被越來越多的研究所證實。但是自噬究竟通過怎樣的方式，起著怎樣的作用，目前尚未取得一致的意見，想要找到治療疾病的新靶點依舊需要更多的理論和實驗支持。