房 艷，王 貝，高俊海，張雅莉

(1.譜尼測(cè)試集團(tuán)股份有限公司， 北京 100095;2.譜尼測(cè)試集團(tuán)北京科學(xué)技術(shù)研究院有限公司， 北京 100095)

硒是一種人體必需的微量元素，因其具有清除細(xì)胞雜質(zhì)、抗氧化、參與谷胱甘肽過(guò)氧化酶合成等特性而具有抗衰老、抗干細(xì)胞壞死、提高免疫力和抗癌變等功效，被譽(yù)為“抗癌之王”、“生命的火種”和“長(zhǎng)壽元素”[1]。但是，硒元素的生物利用度、有效性、毒性以及代謝規(guī)律不僅與其總量有關(guān)，更是與其存在形態(tài)密切相關(guān)[2-3]。硒形態(tài)一般分為單質(zhì)硒、無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒。其中，單質(zhì)硒幾乎無(wú)法被人體吸收；來(lái)源于金屬礦藏副產(chǎn)品的亞硒酸鹽和硒酸鹽是無(wú)機(jī)硒常見(jiàn)的兩種形式，無(wú)法被生物有效的吸收和利用，因而被嚴(yán)格地限制用量[4]。而有機(jī)硒通常經(jīng)生物轉(zhuǎn)化而來(lái)，有利于人體吸收利用，具有較強(qiáng)的生物活性且安全無(wú)副作用[5]，典型的有機(jī)硒包括硒代氨基酸(硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸)、硒蛋白、甲基硒化物、硒核酸和硒多糖等。因此，單以硒總含量無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量，且存在一定的安全隱患[6]，準(zhǔn)確的定性定量不同形態(tài)的硒元素顯得十分重要。尤其對(duì)供給特殊人群的特膳食品的質(zhì)量監(jiān)管和保障消費(fèi)者健康安全具有重要意義。

目前，對(duì)富硒食品中硒元素的研究大多集中在總量測(cè)定[7-9]，對(duì)其不同形態(tài)的檢測(cè)技術(shù)研究還相對(duì)較少。早期的硒形態(tài)分析，多通過(guò)預(yù)處理過(guò)程實(shí)現(xiàn)硒形態(tài)的初步分離，通過(guò)測(cè)定不同樣液中硒元素的總量并結(jié)合差量法計(jì)算出有機(jī)硒、無(wú)機(jī)硒或部分硒形態(tài)的含量[6，10-13]。近年來(lái)隨著儀器聯(lián)用技術(shù)的快速發(fā)展，食品中硒形態(tài)的分析方法包括毛細(xì)管電泳色譜- 電感耦合等離子體質(zhì)譜法(capillary electrophoresis-inductively coupled plasma mass spectrometry，CE-ICP-MS)[14]、高效液相色譜- 氫化物發(fā)生原子熒光光譜法(high performance liquid chromatography-hydride generation-atomic fluorescence spectrometry，HPLC-HG-AFS)[15]、高效液相色譜- 電感耦合等離子體質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry，HPLC-ICP-MS)[16-17]等成為了研究熱點(diǎn)。其中，HPLC-HG-AFS具有儀器普及率高、分析成本低等特點(diǎn)，且靈敏度與電感耦合等離子體質(zhì)譜相當(dāng)[2]，目前已廣泛應(yīng)用于砷、汞、硒等元素的分析。然而，食品等樣品由于基質(zhì)較為復(fù)雜，干擾因素較多，且干擾物質(zhì)難以去除，因此很難準(zhǔn)確測(cè)定其中多形態(tài)硒含量。

本研究擬通過(guò)優(yōu)化條件參數(shù)，建立一種HPLC-HG-AFS測(cè)定食品中硒酸根、硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的分離檢測(cè)技術(shù)，并以富硒酵母作為樣品基質(zhì)進(jìn)行方法驗(yàn)證。另外，用本方法對(duì)4種市售富硒食品(富硒蛋白粉、富硒大米、富硒香菇和富硒酵母)中的4種硒形態(tài)進(jìn)行了檢測(cè)，為相關(guān)富硒食品的硒形態(tài)評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硒酸根[Se(VI)]、硒代蛋氨酸(SeMet)，分析純，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；硒代胱氨酸(SeCys2)，分析純，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；甲基硒代半胱氨酸(SeMeCys)，分析純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；胰蛋白酶，來(lái)源于牛胰腺，活力值1.0×104U/mg，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；蛋白酶XIV，來(lái)源于灰色鏈霉菌，活力值 3.5 U/mg，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；甲醇，色譜純，美國(guó)Thermofisher公司；磷酸氫二銨，分析純，天津市華東試劑廠；硼氫化鉀，分析純，天津福晨化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉，分析純，北京化工廠；鹽酸，優(yōu)級(jí)純，天津市津科精細(xì)化工研究所；三羥甲基氨基甲烷，分析純，天津市華東試劑廠；三氟乙酸，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲酸，分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；碘化鉀，分析純，西隴科學(xué)股份有限公司。

富硒蛋白粉、富硒大米、富硒香菇和富硒酵母均為市售。

1.2 儀器與設(shè)備

LC- 3000型原子熒光形態(tài)分析儀，北京海光儀器有限公司；Coolinics CTR- 240型恒溫水浴鍋，日本Hitachi公司；Vortex- Genie 2型渦旋混合器，美國(guó)Scientific Industries公司；Millipore- Q型超純水凈化儀，美國(guó)Millipore-Q公司；SB25- 12DTD型超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；Velocity 18R型離心機(jī)，澳大利亞Dynamica公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別準(zhǔn)確稱取適量硒酸根、硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸，用水溶解并定容，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃儲(chǔ)存；使用時(shí)，用水稀釋并定容，配制成系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 樣品預(yù)處理

將樣品粉碎研磨，混勻；準(zhǔn)確稱取1.0 g試樣于250 mL容量瓶中，加入200 mL Tris緩沖液(0.1 mol/L，pH=10)，漩渦混勻，超聲提取30 min；加入0.2 g蛋白酶和0.2 g胰蛋白酶，旋渦混勻，60 ℃水浴下酶解4 h，酶解過(guò)程中將容量瓶取出渦旋混勻數(shù)次；酶解后水定容，取20 mL酶解液于塑料離心管中，4 000 r/min離心10 min；取1.0 mL上清液，過(guò)0.22 μm濾膜，供HPLC-HG-AFS分析，外標(biāo)法定量。

1.5 儀器分析

1.5.1高效液相色譜分析條件

Hamilton PRP-X100 (250 mm×4.1 mm×10 μm)色譜柱；流動(dòng)相為V(20 mmol/L磷酸氫二胺水溶液，pH=6.0)∶V(甲醇)=98∶2，洗脫15 min；進(jìn)樣量為100 μL；柱溫為室溫。

1.5.2氫化物發(fā)生原子熒光光譜分析條件

氫化物發(fā)生器條件。還原劑為20 mmol/L 硼氫化鉀水溶液，含w=0.5%氫氧化鉀和w=0.1%碘化鉀，流速為4.0 mL/min；載液為φ=7%鹽酸水溶液，流速為6.0 mL/min。

原子熒光檢測(cè)器條件。原子化器溫度為200 ℃；負(fù)高壓為320 V；燈電流為100 mA；原子化器高度為8 mm；載氣和屏蔽氣為氬氣；載氣流速為500 mL/min；屏蔽氣流速為700 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法檢出限分析

將4種硒形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液注入高效液相色譜- 氫化物發(fā)生原子熒光光譜，采集譜圖見(jiàn)圖1，相應(yīng)的譜圖信息和各硒形態(tài)的檢出限見(jiàn)表1。由圖1可知，硒酸根、硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸在設(shè)定條件下峰形對(duì)稱且充分分離。由表1可知，4種物質(zhì)均在5～100 ng/mL的濃度范圍內(nèi)線性良好(R2>0.999)，且以3倍信噪比計(jì)，硒酸根與甲基硒代半胱氨酸的方法檢出限為25 μg/kg，硒代胱氨酸與硒代蛋氨酸的方法檢出限為50 μg/kg。

圖1 4種硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)品混合物的色譜Fig.1 Chromatogram of mixed standards of 4 selenium speciations

表1 4種硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)品混合物的方法檢出限

2.2 預(yù)處理方法的優(yōu)化

常見(jiàn)的預(yù)處理方法包括酸解法、緩沖鹽提取法和酶解法等[18-19]。本研究需選擇一種適用于有機(jī)硒和無(wú)機(jī)硒同時(shí)提取的預(yù)處理方式。其中，酸解法和緩沖鹽提取法對(duì)無(wú)機(jī)硒的提取效果較好，但無(wú)法有效提取有機(jī)硒，且強(qiáng)酸的強(qiáng)還原能力易導(dǎo)致硒形態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)變。酶解法的特異性較強(qiáng)，能夠?qū)⑽被釓亩嚯逆溨蟹纸庀聛?lái)，且反應(yīng)條件溫和，不易發(fā)生形態(tài)之間的轉(zhuǎn)化[5，18]。因此，本研究以酶解法進(jìn)行預(yù)處理，并對(duì)酶解溫度進(jìn)行考察。使用富硒大米在40、50、60、70 ℃分別酶解4 h，4種目標(biāo)物的提取效率見(jiàn)圖2，提取效率為各目標(biāo)物的檢測(cè)值(扣除本底)與加標(biāo)量的百分比。結(jié)合4種硒形態(tài)化合物的提取效率，選用60 ℃為酶解溫度。

圖2 溫度對(duì)提取率的影響Fig.2 Effect of different temperature on extraction efficiency

2.3 高效液相色譜條件的優(yōu)化

4種物質(zhì)的充分分離對(duì)于物質(zhì)的定性定量是最為關(guān)鍵的。相關(guān)資料表明，反相C18柱適用于有機(jī)硒的分離，但對(duì)強(qiáng)極性的無(wú)機(jī)硒幾乎無(wú)保留。因此選定兼具反相保留和離子交換能力的陰離子交換色譜柱用于無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒的同時(shí)分離檢測(cè)。

圖3 三氟乙酸- 磷酸氫二銨水溶液為流動(dòng)相的 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液高效液相色譜Fig.3 Mixed standard HPLC spectrum of trifluoroacetic acid-diammonium hydrogen phosphate as mobile phase

以20 mmol/L磷酸氫二銨水溶液為流動(dòng)相時(shí)，硒酸根、硒代胱氨酸與甲基硒代半胱氨酸的譜峰部分重疊且峰型較差。流動(dòng)相條件的不同對(duì)于多物質(zhì)的峰型、分離度等具有顯著影響，包括pH值、有機(jī)相比例等。結(jié)合相關(guān)資料并優(yōu)化pH，流動(dòng)相pH為6.0時(shí)，4種硒化物的峰形明顯改善，峰寬較窄且對(duì)稱性好。以三氟乙酸- 磷酸氫二銨水溶液(pH=6.0)與甲酸- 磷酸氫二銨水溶液(pH=6.0)為流動(dòng)相分別測(cè)試時(shí)，兩種流動(dòng)相的分離效果相似，但硒酸根、硒代胱氨酸和甲基硒代半胱氨酸的峰仍未完全分離，見(jiàn)圖3。在流動(dòng)相中加入一定比例甲醇，以V(20 mmol/L磷酸氫二胺水溶液，pH=6.0)∶V(甲醇)=98∶2的混合溶液為流動(dòng)相時(shí)，4種硒形態(tài)化合物在15 min內(nèi)基本實(shí)現(xiàn)基線分離(圖1)。因此，選擇V(20 mmol/L磷酸氫二胺水溶液，pH=6.0)∶V(甲醇)=98∶2的混合溶液為流動(dòng)相。

2.4 氫化物發(fā)生原子熒光光譜條件的優(yōu)化

在氫化物發(fā)生原子熒光光譜中，硼氫化鉀既可以與硒反應(yīng)生成氣態(tài)的硒化氫，又可以與鹽酸反應(yīng)為原子熒光提供適量的氫氣。本研究考察了10、20、30、40 mmol/L的硼氫化鉀水溶液對(duì)硒元素分析的影響如圖4。綜合4種硒形態(tài)化合物的最優(yōu)峰面積，選用20 mmol/L硼氫化鉀水溶液為還原劑。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

使用優(yōu)化后的方法預(yù)先測(cè)得富硒酵母中硒酸根、硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸的含量分別為1.90、3.08、13.53 mg/kg，甲基硒代半胱氨酸未檢出。以此樣品為基質(zhì)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加入實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)量分別為硒酸根1.63 μg和2.13 μg，硒代胱氨酸2.63 μg和3.50 μg，甲基硒代半胱氨酸0.3 μg和0.5 μg，硒代蛋氨酸11.5 μg和15.5 μg。樣品加標(biāo)回收率和RSD值，見(jiàn)表2。

表2 富硒酵母加標(biāo)回收率Tab.2 Standard recovery rate of selenium-rich yeast

結(jié)果顯示，樣品在兩個(gè)濃度梯度的平均回收率在81.37%～93.80%，RSD為2.80%～7.22%，符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》的要求。說(shuō)明該方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

2.6 4種市售食品樣品的分析檢測(cè)

本研究對(duì)市售的富硒蛋白粉、富硒大米、富硒香菇和富硒酵母樣品進(jìn)行了分析，分析結(jié)果見(jiàn)圖5和表3。其中，甲基硒代半胱氨酸在4種樣品中均未檢出；硒酸根在4種樣品均檢出且富硒大米中僅檢出硒酸根；富硒香菇和富硒酵母相比而言含有的硒元素形態(tài)更多。以上說(shuō)明，此次研究使用的富硒大米不適合人體用來(lái)補(bǔ)充硒元素，而此次研究使用的富硒酵母和富硒香菇則可作為人體補(bǔ)充硒元素的良好來(lái)源。

圖5 4種市售富硒食品的色譜Fig.5 Chromatograms of 4 commercially available Se-enriched foods

3 結(jié) 論

本研究建立了一種食品中多形態(tài)硒的高效液相色譜- 氫化物發(fā)生原子熒光光譜法，適用于富硒蛋白粉、富硒大米、富硒香菇和富硒酵母中硒酸根、硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的檢測(cè)。本方法具有靈敏度高、適應(yīng)性廣、設(shè)備便宜、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，解決了食品基質(zhì)較為復(fù)雜而產(chǎn)生的干擾問(wèn)題，4種硒形態(tài)化合物在5～100 μg/kg線性良好(R2>0.999)，方法檢出限可達(dá)到25～50 μg/kg，且具有較高的準(zhǔn)確性和精密度，為食品中相關(guān)產(chǎn)品的硒形態(tài)評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供了方法和依據(jù)。

表3 實(shí)驗(yàn)樣品硒含量Tab.3 Selenium content of experimental samples mg/kg