李雪，伍艷平，周鐵軍，龔莉

1西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000；2宜賓市第二人民醫(yī)院

宮頸癌發(fā)病率居婦女惡性腫瘤第二位，且呈逐年上升趨勢[1]，晚期患者生存和預后情況不容樂觀。因此，尋找宮頸癌轉移、復發(fā)的關鍵機制和調控靶點，并對其進行預防和治療十分重要。微小RNA-451(miRNA-451)屬于非編碼RNA，是轉錄后調節(jié)的重要調控子，在多種腫瘤中存在異常表達，其表達與腫瘤發(fā)生和轉移有一定關系[2-5]。c-myc是myc家族中的主要成員，是較早發(fā)現(xiàn)的癌基因之一[6]。c-myc被認為是細胞增殖、生長、分化和凋亡的重要調節(jié)因子，在許多腫瘤中被激活，蛋白產物表達升高，其表達和活性受miRNA的調控[7]。上皮間質轉化(EMT)是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要過程，腫瘤細胞通過上皮表型[如E-鈣黏蛋白(E-cadherin)]的丟失和間質表型[如波形蛋白(Vimentin)]的獲得增加遷移、侵襲能力。本研究觀察了宮頸鱗癌組織中miRNA-451、c-myc、E-cadherin、Vimentin的表達變化，并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2015年1月—2016年1月西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院病理科存檔的宮頸鱗癌組織蠟塊61例份，患者年齡31～62(45.88±6.56)歲，其中≥50歲20例、<50歲41例；依據國際婦產科聯(lián)盟(FIGO)的宮頸癌分期：Ⅰ期47例，Ⅱ期14例；病理分型：角化型鱗癌21例，非角化型鱗癌40例；淋巴結轉移17例，無淋巴結轉移44例。所有病例均經病理確診，且術前均未接受放化療等抗腫瘤治療。另選癌旁宮頸上皮內瘤變(CIN)組織蠟塊30例份和正常宮頸組織蠟塊20例份作對照。本研究征得患者及家屬知情同意并簽署知情同意書，并獲得西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 組織miRNA-451、c-myc、E-cadherin、Vimentin檢測方法 ①miRNA-451：采用原位雜交法，按照原位雜交試劑盒說明書進行操作，主要步驟為石蠟組織標本連續(xù)切片(6～8 μm)，后脫蠟，3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶活性，蛋白酶處理后1%多聚甲醛室溫固定10 min；滴加20 μL預雜交液38～42 ℃孵育2～4 h，滴加20 μL雜交液38～42 ℃過夜；SSC嚴格浸洗(2×SSC 5 min、2×SSC 5 min、0.5×SSC 15 min、0.2×SSC 15 min，37 ℃)，封閉液37 ℃孵育30 min，滴加生物素化地高辛及SABC分別在37 ℃條件下孵育60 min及30 min后，DAB顯色(顯微鏡下控制顯色時間)，蘇木素復染，酒精脫水、二甲苯透明后、中性樹脂封片。結果判定標準：以5個高倍視野下miRNA-451陽性細胞的計數來判斷：<10%為陰性(-)，10～50%為陽性(+)，>50%為強陽性(++)；+、++記為陽性表達[8]。②c-myc、E-cadherin、Vimentin：采用免疫組化法檢測，用Envision兩步法，按照檢測試劑盒說明書進行操作，主要步驟：石蠟組織標本連續(xù)切片(4～6 μm)后脫蠟，通過檸檬酸液在高壓蒸汽條件下修復抗原，3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶活性；滴加一抗(稀釋濃度：c-myc 1∶100，E-cadherin 1∶100，Vimentin 1∶100)并在37 ℃濕盒中孵育2～3 h，滴加Envision試劑并在室溫下孵育2 h；DAB顯色(顯微鏡下控制顯色時間)，蘇木素復染，酒精脫水、二甲苯透明后、中性樹脂封片。按陽性細胞所占比例及染色強度計分：a.陽性細胞百分數：無陽性細胞為0分，>0～≤10%為1分，>10%～≤50%為2分，>50%～≤75%為3分，>75%為4分；b.細胞染色強度：無染色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分；最終評分為兩項得分相加,<3分為陰性表達，≥3分為陽性表達[9]。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 宮頸鱗癌、CIN、正常宮頸組織中miRNA-451、c-myc、E-cadherin、Vimentin陽性率比較 宮頸鱗癌、CIN、正常宮頸組織中miRNA-451陽性率分別為16.4%(10/61)、36.7%(11/30)、80.0%(16/20)，c-myc陽性率分別為88.5%(54/61)、60.0%(18/30)、10.0%(2/20)，E-cadherin陽性率分別為55.7%(34/61)、70.0%(21/30)、95.0%(19/20)，Vimentin陽性率分別為67.2%(41/61)、46.7%(14/30)、20.0%(4/20)，兩兩比較，P均<0.05。

2.2 miRNA-451、c-myc、E-cadherin、Vimentin表達與宮頸鱗癌臨床病理參數的關系 miRNA-451陽性表達與宮頸鱗癌病理分型、淋巴結轉移有關，c-myc陽性表達與宮頸鱗癌臨床分期、年齡有關，E-cadherin、Vimentin陽性表達均與宮頸鱗癌臨床分期、淋巴結轉移有關(P均<0.05)。

表1 miRNA-451、c-myc、E-cadherin、Vimentin表達與宮頸鱗癌臨床病理參數的關系

2.3 宮頸鱗癌組織中miRNA-451、c-myc與E-cadherin、Vimentin表達的相關性 宮頸鱗癌組織中，miRNA-451與E-cadherin表達呈正相關(r=0.305，P<0.05)，與Vimentin表達呈負相關(r=-0.351，P<0.05)；c-myc與E-cadherin表達呈負相關(r=-0.321，P<0.05)，與Vimentin表達呈正相關(r=0.406，P<0.05)；miRNA-451與c-myc表達呈負相關(r=-0.257，P<0.05)。

3 討論

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，根據組織起源不同，可以分為鱗狀細胞癌、腺癌等病理類型，宮頸鱗癌是最主要、最常見的病理亞型。多種因素參與宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展，其中最重要的是人乳頭瘤病毒(HPV)感染。雖然目前針對女性宮頸癌的篩查逐漸普及，宮頸癌疫苗接種范圍逐漸擴大，針對宮頸癌患者的治療方式也多種多樣，但是宮頸癌的發(fā)病率仍然逐年上升，且晚期宮頸癌患者生存和預后仍不容樂觀，多數患者死于轉移和復發(fā)[1]。因此，探究宮頸癌發(fā)生、發(fā)展、轉移的機制及調控靶點，對了解宮頸癌疾病進展、預防宮頸癌發(fā)生、針對性的改善宮頸癌患者預后都十分重要。

miRNA屬于非編碼RNA，是轉錄后調節(jié)的重要調控子。原癌基因或抑癌基因的3′-UTR端與miRNA能夠通過堿基互補配對的方式相互結合，促進mRNA降解、抑制蛋白質的翻譯，發(fā)揮類似腫瘤促進或抑制因子的作用[10]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-451在多種腫瘤中存在異常表達，如胃癌[2]、肝細胞癌[3]、肺癌[4]、乳腺癌[5]，并與腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉移有一定關系。miRNA-451定位于17q11.2[11]，可以作為腫瘤診斷和治療的新的生物標記物。c-myc[6]是myc家族中的成員之一，定位于8q22，是myc家族中被研究得比較多的一個標記物，它在多種腫瘤中存在異常表達，c-myc蛋白表達升高通常提示患者預后不良[12]。WU等[13]發(fā)現(xiàn)，c-myc在宮頸鱗癌中呈高表達，且可能促進宮頸鱗癌的侵襲和轉移。EMT是腫瘤發(fā)生侵襲轉移的重要機制，腫瘤細胞上皮表型(如E-cadherin、β-catenin、caludins、occludins)的丟失和間質表型(如Vimentin、N-cadherin、fibronectin)的獲得使腫瘤細胞通過細胞外基質遷移遷移到血管、淋巴管中并啟動轉移級聯(lián)反應[14-15]。E-cadherin和Vimentin是目前公認的EMT分子標記物。有研究表明，miRNA-451能通過對某些信號通路的調控來影響腫瘤EMT進程，從而影響腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。在肝細胞癌中，miRNA-451通過調節(jié)snail y影響EMT表型的獲得，具有體外抑癌作用[3]。ZENG等[11]認為，在膀胱癌細胞系中，上調miRNA-451后，N-cadherin和Vimentin顯著降低，且細胞增殖、遷移和侵襲能力明顯受到抑制，下調miRNA-451表達則得到相反結果，表明miRNA-451可以使膀胱癌細胞保持上皮表型，從而減少腫瘤細胞的侵襲和轉移。c-myc是EMT-TFs(Snail、ZEB1、ZEB2)常見的轉錄因子，能夠與這些基因的啟動子結合進而調控這些基因的活性[16]。目前研究表明，在結腸癌[17]、惡性黑色素瘤[18]等腫瘤中，c-myc的異常表達都能對EMT產生影響，從而影響腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移。miRNA-451和c-myc均與EMT過程有關，而二者在影響EMT的過程中可能存在著某些相關關系。在乳腺癌中，miRNA-451通過YWHAZ顯著抑制c-myc的表達[19]。而在耐多西他賽治療的肺腺癌中，miRNA-451降低腫瘤細胞增殖、侵襲能力及體內成瘤能力的作用是通過靶向作用于c-myc從而逆轉EMT過程來實現(xiàn)的[12]。WANG等[20]的研究進一步表明，膀胱癌細胞中miRNA-451抑制c-myc表達，而敲低c-myc則模仿了miRNA-451的過表達作用，miRNA-451通過直接靶向c-myc抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲。

本文結果顯示，miRNA-451在宮頸鱗癌組織中的表達低于CIN和正常宮頸組織，在CIN組織中的表達低于正常宮頸組織，且miRNA-451表達與宮頸鱗癌病理分型及淋巴結轉移有關，提示miRNA-451在宮頸鱗癌中低表達，且miRNA-451的表達缺失可能參與宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展；c-myc在宮頸鱗癌組織中的表達高于CIN和正常宮頸組織，在CIN組織中的表達高于正常宮頸組織，且c-myc表達與宮頸鱗癌臨床分期及患者年齡有關，進一步證實宮頸鱗癌中c-myc表達升高，且參與宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展；宮頸鱗癌組織中miRNA-451與E-cadherin表達呈正相關，miRNA-451與Vimentin表達呈負相關，c-myc與E-cadherin表達呈負相關，c-myc與Vimentin表達呈正相關，說明宮頸鱗癌中miRNA-451和c-myc的表達可能均與EMT進程有關；宮頸鱗癌組織中miRNA-451和c-myc表達呈負相關，提示宮頸鱗癌中miRNA-451的丟失可能導致c-myc過表達。

總之，宮頸鱗癌組織中miRNA-451表達降低，c-myc表達升高，均與EMT進程有關，miRNA-451的丟失可能導致c-myc過表達，兩者可能參與宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展。