姚靜靜 楊宇 顧鑫鑫 鐘琦 楊海峰 吳一萍

摘 ?要： 制備了氧化銦錫（ITO）/二氧化錫（SnO2）/二氧化鈦（TiO2）/金納米粒子（Au NPs）納米復合電極（ITO/SnO2/TiO2/Au NPs），并利用它發(fā)展了可以選擇性檢測唾液酸（SA）的光電化學（PEC）法.采用旋涂法制備了ITO/SnO2電極，并通過靜電紡絲和磁控濺射技術在ITO/SnO2表面原位合成了TiO2納米纖維和Au NPs.與單純SnO2比，ITO/SnO2/TiO2/Au NPs納米復合電極的光電性能顯著提高.這可能與Au NPs的局域表面等離子體共振效應（LSPR）和TiO2/SnO2異質結之間的協同作用密切相關.之后，通過金硫鍵（Au-S）將四巰基苯硼酸（4-MPBA）修飾在ITO/SnO2 /TiO2/Au NPs電極表面，利用4-MPBA和SA之間的非特異性酯化反應，發(fā)展了可以特異性檢測SA的PEC傳感平臺.

關鍵詞： 光電化學（PEC）法; 納米復合材料; 葡萄糖氧化酶; 唾液酸（SA）

中圖分類號： O 657.1 ? ?文獻標志碼： A ? ?文章編號： 1000-5137（2021）06-0663-09

Abstract： In this work， indium tin oxide（ITO）/tin oxide（SnO2）/titanium dioxide（TiO2）/gold nanoparticles（Au NPs） nanocomposite electrode（ITO/SnO2/TiO2/Au NPs） was prepared and used to develop a photoelectrochemical（PEC） method for the selective detection of sialic acid（SA）. Firstly， ITO/SnO2 electrode was prepared by spin coating method， and then TiO2 nanofibers and Au NPs were synthesized on the surface of ITO/SnO2 by electrospinning and magnetron sputtering. Compared with pure SnO2， the photoelectric performance of ITO/SnO2/TiO2/Au NPs nanocomposite electrode is significantly improved. This may be closely related to the local plasmon resonance effect（LSPR） of Au NPs， and the synergistic effect between TiO2/SnO2 heterojunction. After that， 4-mercaptophenylboronic acid （4-MPBA） was modified on the surface of ITO/SnO2/TiO2/Au NPs electrode by Au-S bond， and a PEC sensing platform was developed to specifically detect SA by non-specific esterification reaction between 4-MPBA and SA.

Key words： photoelectrochemical （PEC） method; nanocomposite materials; glucose oxidase; sialic acid（SA）

0 ?引 言

光電化學（PEC）分析是近年來發(fā)展起來的一種以PEC反應作為分析基礎的新型傳感模式.PEC結合了光化學和電化學的優(yōu)勢，以光作為激發(fā)信號，電為檢測信號，結合循環(huán)放大策略，可以實現非常高的靈敏度.對于單一的寬帶隙納米半導體而言，由于能帶間隙較寬，對可見光的利用率較低，加上光生載流子復合，整體光電轉換效率不高.目前，研究者們提出了多種方法和策略來改善寬禁帶納米半導體材料的PEC特性，包括：1） 有機染料敏化[1-3];2） 與窄帶隙納米半導體耦合[4-6];3） 貴金屬敏化[7].貴金屬納米粒子在可見光照射下具有局域表面等離子體共振效應（LSPR）[8-9]，該效應可以促進納米半導體光生載流子的產生，提高光電轉換效率.因此通過制備復合納米材料，利用窄禁帶納米半導體或貴金屬納米粒子的局域表面等離子體共振效應，改善寬禁帶半導體納米材料的光電轉化效率[10]，從而提高PEC檢測方法的靈敏度.

唾液酸（SA），又名N-乙酰基神經氨酸[11]，廣泛存在于生物體內細胞膜糖蛋白和脂蛋白中，并在生命活動過程中發(fā)揮著重要的作用[12-13].SA也是乳腺癌檢測的生物標志物之一.在癌癥惡性轉化期間，微環(huán)境中糖基轉移酶、糖苷酶和單糖轉運蛋白的差異表達會導致組織糖基化水平發(fā)生變化，而SA含量的改變正是惡性組織糖基化水平發(fā)生變化的一個關鍵環(huán)節(jié)[14].因此，監(jiān)測人體SA含量對早期癌癥診斷具有重要輔助作用.目前檢測人血清中SA的方法主要有：高效液相色譜（HPLC）法 [15]、熒光法[16]、高效液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）法[17]和酶聯免疫法[18].現有的HPLC法需要多個預處理步驟，操作復雜，費時費力;LC-MS/MS法對儀器要求高、成本高，且易發(fā)生基質誘導效應，高親水性化合物，如碳水化合物，很難用正電噴霧質譜檢測到;酶聯免疫法靈敏度高，但其成本較高，操作方法較為復雜，線性范圍較窄.本文作者運用PEC法對其進行檢測，該方法具有靈敏度高、成本低、操作方法簡單的優(yōu)點.

通過靜電紡絲和磁控濺射技術制備了穩(wěn)定的氧化銦錫（ITO）/二氧化錫（SnO2）/二氧化鈦（TiO2）/金納米粒子（Au NPs）納米復合電極（ITO/SnO2/TiO2/Au NPs）.與單一納米材料比，該復合納米材料在可見光區(qū)展現出較高的光電轉換效率，這可能與Au NPs的LSPR及SnO2和TiO2之間匹配的能級密切相關.另外，通過金硫鍵（Au-S）將4-巰基硼酸（4-MPBA）自組裝到該復合納米電極表面，然后利用酯化反應將SA特異性捕獲至電極表面;電極表面的光透性和電子轉移效率隨著4-MPBA-SA復合物的產生而下降，光電流隨之有規(guī)律地降低，由此建立SA濃度與光電流強度間的相關性，發(fā)展可以特異性靈敏檢測SA的PEC方法.

1 ?實驗部分

1.1 化學試劑

四異丙醇鈦（TTIP）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡萄糖（Glucose）、氯化鉀（KCl）、氯化鈉（NaCl）、乙酸、無水乙醇、4-MPBA、SA購自麥克林生物科技;3-巰丙基三甲氧基硅烷、三（2，2′-聯吡啶釕）二（六氟磷酸鹽）（Ru（bpy）32+）、抗壞血酸（AA）、尿酸（UA）購自Adamas公司，均為分析純;15%（質量分數）SnO2購自Alfa Aesar公司;ITO導電玻璃購于深圳偉光公司南玻有限公司.實驗過程中用的水溶液均由18.25 MΩ·cm的超純水配制而成，所有的試劑和化學品均直接使用，實驗玻璃儀器均用王水（濃鹽酸和濃硝酸體積比為3∶1混合）浸泡洗滌，再以二次去離子水沖洗.

1.2 實驗儀器

場發(fā)射掃描電子顯微鏡（FE-SEM），日本日立儀器有限公司，S-4800型;透射電子顯微鏡（TEM），日本日立儀器有限公司，JEM-2100 EXII;便攜式拉曼（Raman）光譜儀，Enwave Optronics，Prott-EZ-Raman-A2型;光電化學反應儀，天津艾達恒科技發(fā)展有限公司，PEAC 200A型;臺式勻膠機，中國科學院微電子研究所，KW-4A型;電化學工作站，海辰華儀器有限公司，CHI440D;紫外-可見分光光度計，上海欣茂儀器有限公司，UV-7504PC型;X射線光電子能譜（XPS）儀，日本島津公司，Axis 165型;離子濺射儀，TED PELLA，INC.，CPC 108 auto;陶瓷纖維馬弗爐，上?；厶﹥x器制造有限公司，8-12T/TP;純水儀，上海淼康實業(yè)有限公司，Milli-Q;干燥箱，上?；厶﹥x器制造有限公司，DZF-6000.

1.3 ITO/SnO2電極制備

將ITO導電玻璃切成5 cm×5 cm大小，按照以下順序依次在超聲波清洗儀中進行洗滌：含一定濃度洗滌劑的水溶液（15 min），去離子水（5 min，2次），丙酮（5 min），異丙醇（5 min），去離子水（10 min，2次）.清洗完之后將ITO玻璃放置在鼓風干燥箱中于80 ℃烘干.ITO/SnO2納米電極的制備：將ITO導電玻璃固定在旋涂儀上，取70 μL的10%（質量分數）SnO2納米水溶膠均勻地旋涂在ITO導電玻璃上.待自然風干后，放置于馬弗爐，450 ℃煅燒1.5 h，自然冷至室溫，待用.

1.4 ITO/SnO2/TiO2/Au NPs復合電極的制備

取1 g PVP加入3.2 mL無水乙醇中，磁力攪拌下形成黏稠白色溶液;取1 mL TTIP加入6.4 mL乙酸和無水乙醇（體積比為1∶1）的混合液中，在磁力攪拌下于另一個燒杯中溶解;等該溶液透明后，將其加入至PVP黏稠液中繼續(xù)攪拌，攪拌5 h，制得靜電紡絲前驅液.接著進行電紡，電紡條件為：電壓24 kV，接收裝置與針頭之間距離為15 cm，收集器為上述所制備得到的ITO/SnO2玻璃片，前驅液流速為0.2 mL·h-1，時間為30 min.電紡后將玻璃片自然風干，放置于馬弗爐中，于450 ℃煅燒1.5 h，自然冷卻.將制備好的玻璃片浸沒在5%（質量分數）的3-巰丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液中24 h，沖洗干凈，氮氣（N2）吹干后，將該玻璃片置于離子濺射儀中，設置噴金時間為10 s（經優(yōu)化后的時間），最終成功制備復合納米電極，記為ITO/SnO2/TiO2/Au NPs.

1.5 PEC傳感器構建

將上述制備的ITO/SnO2/TiO2/Au NPs電極切至2.5 cm×0.5 cm大小，將10 μL 4-MPBA溶液滴涂在ITO/SnO2/TiO2/Au NPs電極表面，滴涂面積為電極底部0.5 cm×0.5 cm處，在室溫條件下孵育2 h.隨后，用乙醇、超純水對修飾的電極進行清洗，N2吹干，待用.

1.6 電化學阻抗表征

通過CHI660D電化學工作站對ITO/SnO2/TiO2/Au NPs電極的修飾過程進行電化學阻抗表征.以含有5.0 mmol·L-1[Fe（CN）6]3-/4-（1∶1）的0.1 mol·L-1 KCl溶液作為阻抗液（pH=7.0），頻率范圍為0.1 Hz～100 kHz，振幅為50 mV.三電極體系分別為：ITO修飾電極為工作電極，鉑（Pt）絲電極為對電極，銀/氯化銀（Ag/AgCl）（3 mol·L-1 KCl）為參比電極.

1.7 PEC檢測

光電測試在CHI440C電化學工作站上進行.電解液為10 mmol·L-1磷酸緩沖液（PB）緩沖液（pH=7.2）.三電極體系分別為：ITO修飾電極為工作電極，Pt絲電極為對電極，Ag/AgCl（3 mol·L-1 KCl）為參比電極.檢測偏壓為+0.4 V.激發(fā)光源為波長473 nm的自制發(fā)光二極管.

1.8 實際樣品檢測

1 mL肺癌患者血清中加入4 mL甲醇，6 000 r·min-1轉速下離心10 min去除蛋白質，然后N2吹干，樣品最終體積為1 mL.將1 mL葡萄糖氧化酶溶液（1 mg·mL-1）加入1 mL樣品中，于37 ℃孵育2 h以去除葡萄糖.

2 ?結果與討論

2.1 ITO/SnO2/TiO2/Au NPs電極表征

分別利用FE-SEM和TEM對所制的ITO/SnO2，ITO/SnO2/TiO2和ITO/SnO2/TiO2/Au NPs電極表面形貌進行表征.ITO電極表面經過燒結之后形成致密的SnO2膜，如圖1（a）所示.ITO/SnO2/TiO2的表面形貌如圖1（b）所示，通過靜電紡絲制備的TiO2納米纖維覆蓋在ITO/SnO2表面，交織在一起，形成三維網狀結構，其中TiO2納米纖維平均直徑約為200 nm.圖1（c）是ITO/SnO2/TiO2/Au NPs復合納米材料的TEM圖，右上角是放大圖，可以清晰地看到Au NPs分散負載在TiO2納米纖維表面.圖2為ITO/SnO2/TiO2/Au NPs復合材料的能譜分析結果，表明了該復合材料中含有Sn，Ti，O和Au元素，且各元素的分布與電鏡形貌相匹配，再次證明了電極表面SnO2納米膜、三維TiO2納米纖維網以及Au NPs的成功制備.

2.2 ITO/SnO2/TiO2/Au NPs/4-MPBA的Raman表征

表1是4-MPBA分子的Raman和表面增強拉曼散射（SERS）譜峰歸屬[19]，圖3是電極表面組裝4-MPBA前后的Raman光譜響應.比較后發(fā)現，組裝有4-MPBA的電極表面在2 561 cm-1和907 cm-1處并沒有出現歸屬于氫硫鍵（-SH）拉伸和碳碳巰基（-CSH）面內彎曲模式的Raman響應，表明4-MPBA可能以硫醇鹽形式解離吸附在電極表面.另外，在1 092 cm-1處，歸屬于苯環(huán)與碳硫鍵（-CS）拉伸模式的Raman響應在電極表面向低波數移至1 070 cm-1，并大大增強，表明4-MPBA分子可能垂直組裝在Au NPs表面，形成類似苯硫醇的單分子膜[20].4-MPBA分子在電極表面形成單分子層，加上-SH和二羥基硼（-B（OH）2）的對位取代關系，導致在1 300～1 050 cm-1范圍內與分子平面內運動有關的峰被增強;同時，在850～620 cm-1范圍內，與碳氫（-CH）搖擺振動和環(huán)形平面外振動相關的一些峰也被放大;而在1 310，1 345和1 370 cm-1處，歸屬于硼氧（-BO）拉伸振動的響應卻基本消失，表明硫醇共軛苯的電荷轉移有助于硫醇化合物特征峰之外其他峰的增強[21].

2.3 電化學阻抗表征

電化學阻抗譜（EIS）可以有效表征電極表面的修飾過程.圖4顯示了PEC傳感器構建過程中涉及阻抗的變化.阻抗圖中半圓直徑的大小反映的是層層修飾電極內阻（Ret）的變化，半圓直徑越大內阻越大.ITO/SnO2電極顯示出較小的Ret.隨著TiO2修飾，Ret變小，表明TiO2納米纖維的修飾有助于表面電子的傳遞;當繼續(xù)修飾Au NPs后，Ret反而變大了，這可能與非導電的硅烷化膜有關.硅烷化膜的修飾是為了通過巰基在電極表面更加牢固地固定Au NPs，但它的存在也降低了電極電子傳輸能力.隨后，在ITO/SnO2/TiO2/Au NPs表面逐步引入4-MPBA和SA，可以看到隨著這些小分子的加入，電極Ret不斷增加.同時隨著SA的加入，阻抗增大，也證明了4-MPBA與SA之間識別作用的存在，表明該傳感模式的成功構建.

2. 4 實驗條件優(yōu)化

偏壓、Au NPs的負載量和4-MPBA修飾的物質的量濃度對傳感器性能都具有顯著的影響，因此對這幾個參數進行了優(yōu)化.光電測定在10 mmol·L-1 PB緩沖液（pH=7.2）中進行，激發(fā)光源為波長473 nm的藍光.結果表明：隨著偏壓的增加，ITO/SnO2/TiO2/Au NPs電極的光電流逐漸增大.偏壓為0.4 V時，光電流趨于穩(wěn)定，如圖5（a）所示.Au NPs的負載量，可通過控制噴金時間來優(yōu)化.當噴金時間為10 s時，電極的光電流值達到最大，如圖5（b）所示.因此，在隨后的檢測實驗中偏壓和噴金時間分別設定為0.4 V和10 s.對4-MPBA物質的量濃度進行優(yōu)化時發(fā)現，光電流響應隨著4-MPBA物質的量濃度的增加而下降，最后在800 μmol·L-1時趨于穩(wěn)定，表明此刻電極表面4-MPBA組裝達到飽和，如圖5（c）所示.因此，之后4-MPBA修飾的物質的量濃度固定為800 μmol·L-1.

2.5 線性檢測

在最優(yōu)條件下，對SA進行定量檢測.圖6顯示了不同物質的量濃度SA在ITO/SnO2/TiO2/Au NPs/4-MPBA上的響應.從圖6（a）可以看出，隨著物質的量SA濃度的增加，光電流減小，說明有更多的SA分子被捕獲并參與了PEC過程.此外，光電流響應與SA物質的量濃度在100～700 μmol·L-1范圍內成正比，相關系數R2為0.983 4，如圖6（b）所示.

2.6 傳感器的選擇性和與穩(wěn)定性考察

為了考察該PEC傳感器的選擇性，對樣品中可能存在的干擾進行了考察.考慮到檢測的實際樣品為血液，所以重點對血液中存在的AA、NaCl、KCl、葡萄糖和UA對傳感器選擇性的影響進行了考察，結果如圖7（a）所示.結果表明：這些物質對SA的PEC檢測都不會造成干擾.光電流只有在SA溶液中才表現出明顯的下降，證明該傳感器抗干擾能力強，對SA具有良好的選擇性.值得一提的是，在考察葡萄糖對傳感檢測的干擾時，預先在葡萄糖溶液里加入了葡萄糖氧化酶，通過酶促反應轉化葡萄糖，保證傳感器對血液中SA檢測的特異性.另外，也同時考察了ITO/SnO2/TiO2/Au NPs電極在10 mmol·L-1 PB緩沖液中“開-關”循環(huán)光照下的光電流響應.如圖7（b）所示，連續(xù)測試600 s后，光電流響應沒有明顯變化，證明電極的穩(wěn)定性良好.

2.7 實際樣品分析

根據實驗部分所描述的，首先對獲得血樣進行了前處理.之后，將樣品分為2份，一份（樣品1）采用制備的傳感器對其中的SA進行了測定，另一份（樣品2）用高效液相色譜（HPLC）進行測定，樣品1和樣品2的PEC檢測結果分別為0.138 mmol·L-1和0.208 mmol·L-1，HPLC檢測結果分別為0.146 mmol·L-1和0.220 mmol·L-1.PEC檢測血清SA水平與UPLC標準法[15]檢測結果相似，證實了PEC傳感器對血樣中SA檢測的準確性.與UPLC比，該方法更簡便快速，檢測成本也較低，具有較好的實際應用前景.

3 ?結 論

基于制備的ITO/SnO2/TiO2/Au NPs納米復合材料，發(fā)展了一種非常簡單的可用于血清中SA檢測的PEC生物傳感平臺.這種基于ITO/SnO2/TiO2/Au NPs納米復合電極構建的SA光電傳感器具有優(yōu)于其他SA光電傳感器的傳感特性，主要歸因于：1） Au NPs產生的LSPR增強了對可見光的轉換效率;2） SnO2/TiO2界面形成的異質結構加速了光生電子轉移速率，有效地抑制了電子-空穴對的復合率;3） 電極表面修飾的4-MPBA與SA之間的非特異性酯化反應，在葡萄糖氧化酶存在的情況下，可以有效排除葡萄糖的干擾，實現對SA的選擇性檢測.該納米復合電極具有良好的生物相容性、低毒性，并且可以實現在可見光下激發(fā)，在構建生物傳感領域具有廣闊的應用前景.

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（責任編輯：郁慧，包震宇）