吳萬(wàn)豐，聶慧芳，胡立娟，孫藝航，羅 寧，蔣成婷，成紹武，葛金文

補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)缺血性腦卒中氣虛血瘀證大鼠腸道菌群及其血漿代謝產(chǎn)物的影響

吳萬(wàn)豐1, 2，聶慧芳1，胡立娟1，孫藝航1，羅 寧1，蔣成婷1，成紹武1*，葛金文1*

1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208 2. 湖南中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校附屬第一醫(yī)院，湖南 株洲 412000

探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)缺血性腦卒中氣虛血瘀證模型大鼠腸道菌群及其相關(guān)血漿代謝產(chǎn)物的影響。采用中醫(yī)證型與大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral arteryocclusion，MCAO）聯(lián)合造模的方法，建立缺血性腦卒中氣虛血瘀證大鼠模型，隨機(jī)分為對(duì)照組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯（24 g/kg）組、雙歧桿菌（0.81 g/kg）組。除對(duì)照組大鼠ig生理鹽水外，其余各組大鼠ig相應(yīng)藥物，72 h后處死大鼠，取全腦采用TTC染色檢測(cè)腦梗死體積，取盲腸內(nèi)容物采用16S rRNA基因測(cè)序檢測(cè)腸道菌群，分離血漿用代謝組學(xué)法檢測(cè)血漿代謝產(chǎn)物，并建模分析腸道菌群與代謝產(chǎn)物之間的聯(lián)系。與對(duì)照組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯顯著改善缺血性腦卒中氣虛血瘀證大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分（＜0.05），減小腦梗死體積（＜0.001），調(diào)節(jié)腸道菌群（＜0.01），影響缺血性腦卒中氣虛血瘀證大鼠血漿代謝輪廓；雙歧桿菌四聯(lián)活菌片對(duì)缺血性腦卒中氣虛血瘀證大鼠腸道菌群及代謝產(chǎn)物影響較小，對(duì)大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、腦梗死體積無(wú)顯著影響。補(bǔ)陽(yáng)還五湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)缺血性腦卒中氣虛血瘀證大鼠的腸道菌群，繼而影響其血漿代謝輪廓，從而發(fā)揮治療缺血性腦卒中血瘀證的作用。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯；缺血性腦卒中；氣虛血瘀證；腸道菌群；代謝產(chǎn)物

腸道菌群與缺血性腦卒中關(guān)系密切，缺血性腦卒中可改變腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)，腸道菌群又能影響缺血性腦卒中的發(fā)生與發(fā)展[1]。Wang等[2]研究發(fā)現(xiàn)腦梗死患者腸道微生態(tài)多樣性和相對(duì)豐度與健康受試者存在顯著差異，在綱水平上，腦梗死患者糞便中變形桿菌增多、擬桿菌減少。腸道菌群可以通過(guò)T細(xì)胞免疫[3-4]及其相關(guān)代謝產(chǎn)物如氧化三甲胺[5-6]、短鏈脂肪酸[7]等影響缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展。目前除糞菌移植之外，缺少其他通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群治療缺血性腦卒中的方法，且與腸道菌群相關(guān)的缺血性腦卒中代謝物靶標(biāo)較少，其臨床應(yīng)用仍有待深入研究。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中大鼠的腸道菌群及其相關(guān)代謝產(chǎn)物均發(fā)生明顯改變，共發(fā)現(xiàn)308個(gè)失調(diào)的代謝產(chǎn)物，通過(guò)關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)許多代謝產(chǎn)物的失調(diào)與腸道菌群緊密相關(guān)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中氣虛血瘀證與氣滯血瘀證模型大鼠腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)之間存在顯著差異，表明腸道菌群及其相關(guān)代謝產(chǎn)物可能參與缺血性腦卒中的發(fā)展和中醫(yī)證候的形成。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯出自《醫(yī)林改錯(cuò)》，作為治療缺血性腦卒中氣虛血瘀證的代表方劑，具有較好的療效。補(bǔ)陽(yáng)還五湯及其組方成分與腸道菌群存在著復(fù)雜的聯(lián)系，孫明良等[8]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯與瑞代合用能有效增加缺血性腦卒中模型大鼠腸道乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量，顯著降低大腸桿菌數(shù)量。組方中黃芪的主要有效成分黃芪多糖能增加肥胖小鼠腸道擬桿菌門(mén)與厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度，降低變形菌門(mén)細(xì)菌的相對(duì)豐度[9]。結(jié)合課題組前期研究，推測(cè)補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以通過(guò)調(diào)節(jié)缺血性腦卒中氣虛血瘀證大鼠的腸道菌群，從而影響其內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，最終影響缺血性腦卒中的神經(jīng)損傷和修復(fù)。本研究旨在明確補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)缺血性腦卒中氣虛血瘀證大鼠腸道菌群的影響，篩選出與腸道菌群相關(guān)的代謝產(chǎn)物，為治療缺血性腦卒中提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性大鼠，7～9周齡，體質(zhì)量240～270 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)SCXK（湘）2016-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，濕度45%～65%、室溫25 ℃、自由飲水，攝食。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循湖南中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

1.2 藥物

補(bǔ)陽(yáng)還五湯由黃芪120 g、歸尾6 g、赤芍4.5 g、地龍3 g、川芎3 g、桃仁3 g、紅花3 g組成，購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)劉林副教授鑒定分別為豆科植物蒙古黃芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao的干燥根、傘形科植物當(dāng)歸(Oliv.) Diels. 的根尾、毛茛科植物川赤芍Lynch. 的根、鉅蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓(E. Perrier) 的去內(nèi)臟全體、傘形科植物川芎Hort. 的根莖、薔薇科植物桃Linn. 的干燥成熟種子、菊科植物紅花L. 的花，均符合《中國(guó)藥典》2015年版規(guī)定。雙歧桿菌四聯(lián)活菌片（規(guī)格0.5 g/片，批號(hào)201711056）購(gòu)自杭州遠(yuǎn)大生物制藥有限公司。

1.3 試劑

2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC，上海如吉生物科技有限公司）；大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral arteryocclusion，MCAO）栓線-2634A4（北京西濃科技有限公司）；E.Z.N.A糞便DNA提取試劑盒（Omega Bio-tek公司）。

1.4 儀器

QuantiFluorTM熒光計(jì)（Promega公司）；Hiseq2500 PE250測(cè)序系統(tǒng)（Illumina公司）；1290超高效液相色譜儀（Agilent公司）；AB 5600 Triple TOF質(zhì)譜儀（AB Sciex公司）；Heraeus Fresco17離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific公司）；明澈D24UV純水儀（Merck Millipore公司）；PS-60AL超聲儀（深圳市雷德邦電子有限公司）。

2 方法

2.1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯的制備

將補(bǔ)陽(yáng)還五湯7種藥材混合，加入5倍體積的蒸餾水浸泡2 h，武火煮沸0.5 h，文火慢煎1 h，濾過(guò)，收集濾液；用3倍體積的蒸餾水按上述步驟再次提取濾液，合并2次濾液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至最終藥物質(zhì)量濃度為2 g/mL（以生藥量計(jì)）。

2.2 缺血性腦卒中氣虛血瘀證大鼠模型的制備

參照張錦等[10]方法，將大鼠按（4.0±0.5）%體質(zhì)量負(fù)重后放進(jìn)內(nèi)徑150 cm、水深40 cm的圓形游泳池，水溫控制在（20±1）℃，強(qiáng)迫大鼠不停游泳直至力竭后撈出，力竭表現(xiàn)為游泳動(dòng)作失調(diào)、水淹沒(méi)鼻尖、身體下沉超過(guò)10 s不能浮出水面。對(duì)大鼠進(jìn)行適應(yīng)性游泳訓(xùn)練3 d，然后每天力竭性游泳1次，持續(xù)21 d。于第22天采用改良Longa線栓法阻塞大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈制備MCAO模型[11]。大鼠手術(shù)麻醉清醒后出現(xiàn)左側(cè)肢體癱瘓、站立不穩(wěn)、提尾時(shí)向一側(cè)轉(zhuǎn)圈，即模型制備成功。

2.3 分組和給藥

按體表面積計(jì)算，給藥劑量相當(dāng)于人臨床劑量的2倍。缺血性腦卒中氣虛血瘀證模型大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯（24 g/kg）組、雙歧桿菌（0.81 g/kg，雙歧桿菌四聯(lián)活菌片溶于生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為50 mg/mL的溶液）組，每組12只。大鼠經(jīng)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分確定模型成功后于1、24、48 h ig相應(yīng)藥物，對(duì)照組ig 4 mL生理鹽水。

2.4 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

大鼠ig藥物后72 h，采用Longa等[12]制定的5級(jí)4分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0分，無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。分值越高，說(shuō)明動(dòng)物行為障礙越嚴(yán)重。

2.5 樣本采集和處理

大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分后，ip 10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉，腹主動(dòng)脈采血至肝素鈉抗凝管中，直到血液采盡，大鼠死亡但軀體尚未僵硬時(shí)，斷頭取全腦行TTC染色，并取盲腸內(nèi)容物檢測(cè)腸道菌群；將采集的全血立即分離血漿，與盲腸內(nèi)容物于?80 ℃保存，干冰填埋轉(zhuǎn)運(yùn)至廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行檢測(cè)。

2.6 TTC染色

大鼠斷頭取全腦后，以生理鹽水洗滌后于?20 ℃速凍15 min，沿大腦冠狀面切成6片，厚2 mm；放入1% TTC溶液中，于37 ℃避光染色15 min，每5分鐘輕微振蕩混勻，染色后用4%多聚甲醛固定并拍照。正常區(qū)為紅色，缺血梗死區(qū)為白色，用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算腦梗死體積比。

腦梗死體積比＝(對(duì)側(cè)半球體積－梗死側(cè)正常體積)/對(duì)側(cè)半球體積

2.7 16S rRNA基因測(cè)序和生物信息學(xué)分析

按照E.Z.N.A糞便DNA試劑盒說(shuō)明書(shū)從大鼠盲腸內(nèi)容物中提取總DNA，用帶有條形碼的特異引物（341F：5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’；806R：5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’）和Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase試劑盒擴(kuò)增DNA樣本中16S rDNA的V3＋V4區(qū)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收后從2%瓊脂糖凝膠中提取并純化，用QuantiFluorTM熒光計(jì)進(jìn)行定量。將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行等量混合，連接測(cè)序接頭，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，上機(jī)測(cè)序，對(duì)低質(zhì)量數(shù)據(jù)過(guò)濾，然后進(jìn)行組裝和過(guò)濾，按照一致性＞97%將測(cè)序序列聚類(lèi)為操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTUs），依次進(jìn)行物種注釋、α多樣性分析、β多樣性分析，并進(jìn)行組間差異比較和檢驗(yàn)。

2.8 非靶向代謝組學(xué)檢測(cè)血漿代謝產(chǎn)物

2.8.1 樣本處理 取100 μL血漿樣本，加入400 μL含內(nèi)標(biāo)（-2-氯苯丙氨酸，質(zhì)量濃度為1 mg/mL）的甲醇-乙腈溶液（1∶1）；渦旋混勻30 s，超聲5 min，于?20 ℃靜置1 h；4 ℃、15 338×離心15 min，取425 μL上清于真空濃縮器中干燥，加入100 μL 50%乙腈溶液復(fù)溶，渦旋30 s，超聲10 min。4 ℃、15 338×離心15 min，取60 μL上清于2 mL進(jìn)樣瓶，每個(gè)樣本各取10 μL混合成質(zhì)控（QC）樣本，再取60 μL上機(jī)進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）分析。

2.8.2 色譜條件 Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A為含25 mmol/L醋酸銨、25 mmol/L氨水的水，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫：0～7 min，95% B；7～8 min，95%～65% B；8～9 min，65%～40% B；9～12 min，40%～95% B；體積流量0.5 mL/min；進(jìn)樣量3 μL。

2.8.3 質(zhì)譜條件 AB 5600 Triple TOF質(zhì)譜儀能夠在控制軟件（Analyst TF 1.7，AB Sciex）控制下基于IDA功能進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。在每個(gè)數(shù)據(jù)采集循環(huán)中，篩選出強(qiáng)度最強(qiáng)且/＞100的分子離子，采集對(duì)應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。碰撞能量30 eV，每50毫秒采集15張二級(jí)譜圖。電噴霧離子源（ESI）參數(shù)設(shè)置如下：霧化氣壓為413.7kPa（60 psi），輔助氣壓為413.7kPa（60 psi），氣簾氣壓為241.325kPa（35 psi），溫度為650 ℃，噴霧電壓為5000 V（正離子模式）、?4000 V（負(fù)離子模式）。

2.8.4 數(shù)據(jù)分析 使用ProteoWizard軟件將質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)成mzXML格式，使用XCMS進(jìn)行保留時(shí)間矯正、峰識(shí)別、峰提取、峰積分、峰對(duì)齊等。根據(jù)公共數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件自建二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)代謝物進(jìn)行定性；利用歸一化后的數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，包括主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法-判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）、正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）；利用多元統(tǒng)計(jì)分析OPLS-DA和單變量統(tǒng)計(jì)分析相結(jié)合的方法篩選差異代謝物。

2.9 16S rRNA基因測(cè)序與代謝組學(xué)關(guān)聯(lián)分析

為了整合腸道微生物群和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，進(jìn)行兩組學(xué)正交偏最小二乘法（two-way orthogonal partial least squares，O2PLS）分析。利用R語(yǔ)言中Omics PLS計(jì)算代謝物豐度數(shù)據(jù)集和微生物區(qū)系各分類(lèi)水平的數(shù)據(jù)集，建立O2PLS模型；進(jìn)一步利用R語(yǔ)言計(jì)算微生物群在門(mén)和科水平與代謝組學(xué)數(shù)據(jù)集間的Pearson相關(guān)系數(shù)。在R語(yǔ)言中生成相關(guān)熱圖并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)缺血性腦卒中氣虛血瘀證大鼠神經(jīng)行為學(xué)和腦梗死的影響

MCAO術(shù)后72 h內(nèi)對(duì)照組有3只大鼠死亡，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組有4只大鼠死亡，雙歧桿菌組有2只大鼠死亡。對(duì)照組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、雙歧桿菌組有效取材數(shù)量分別為9、8、10只，組間死亡率無(wú)明顯差異，死亡原因可能與MCAO術(shù)后大鼠大面積腦梗死相關(guān)。如表1所示，對(duì)照組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分為2.22±0.67，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組評(píng)分為1.50±0.53，雙歧桿菌組評(píng)分為1.70±0.47。與對(duì)照組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分顯著降低（＜0.05），補(bǔ)陽(yáng)還五湯組與雙歧桿菌組間無(wú)顯著差異，提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯能改善缺血性腦卒中氣虛血瘀證大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。如圖1所示，與對(duì)照組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠腦梗死體積比顯著降低（＜0.001）；與雙歧桿菌組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠腦梗死體積比顯著降低（＜0.01）。

表1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響 ()

與對(duì)照組比較：*＜0.05

*< 0.05control group

與對(duì)照組比較：***P＜0.001；與雙歧桿菌組比較：##P＜0.01

3.2 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)缺血性腦卒中氣虛血瘀證大鼠腸道菌群群落結(jié)構(gòu)的影響

基于OTUs序列開(kāi)展腸道細(xì)菌群落α多樣性分析，如表2所示，對(duì)照組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、雙歧桿菌組間Chao、Ace、Shannon、Simpson指數(shù)均無(wú)顯著差異，提示樣本腸道菌群多樣性和豐富度無(wú)顯著差異。進(jìn)一步分析腸道菌群β多樣性，判斷組間群落組成差異，在OTUs水平上基于未加權(quán)UniFrac距離進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA），如圖2-A所示，對(duì)照組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、雙歧桿菌組有明顯區(qū)別；如圖2-B所示，經(jīng)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3組之間群落組成情況存在顯著差異（＜0.01）；Anosim檢驗(yàn)如圖2-C所示，證實(shí)3組之間組間差異顯著大于組內(nèi)差異。綜上，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組腸道菌群豐富度和多樣性與其他2組無(wú)顯著性差異，但腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)與其他2組間存在顯著性差異。

表2 大鼠腸道菌群α多樣性指數(shù)

與對(duì)照組比較：**P＜0.01；與雙歧桿菌組比較：##P＜0.01

為進(jìn)一步明確補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)缺血性腦卒中氣虛血瘀證大鼠腸道菌群分類(lèi)學(xué)的影響，本研究基于細(xì)菌門(mén)和科分類(lèi)水平進(jìn)行差異物種分析。通過(guò)對(duì)OTUs序列進(jìn)行物種注釋?zhuān)?組在門(mén)分類(lèi)水平共鑒定出10類(lèi)菌種，其中擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、疣微菌門(mén)、放線菌門(mén)、脫鐵桿菌門(mén)為豐度最高的6個(gè)菌門(mén)，其物種分類(lèi)疊圖如圖3-A所示，可見(jiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯組與其他組之間物種相對(duì)豐度存在差異。經(jīng)Welch’s檢驗(yàn)如圖3-B所示，與對(duì)照組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組顯著下調(diào)放線菌門(mén)（Actinobacterium）相對(duì)豐度（＜0.01）；與雙歧桿菌組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組顯著下調(diào)變形菌門(mén)（Proteobacteria）相對(duì)豐度（＜0.05），上調(diào)擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）相對(duì)豐度（＜0.05），雙歧桿菌組與對(duì)照組之間未發(fā)現(xiàn)顯著差異的物種。在科分類(lèi)水平上，如圖3-C所示，與對(duì)照組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組顯著下調(diào)脫硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）、紅蝽菌科（Coriobacteriaceae）、理研菌科（Rikenellaceae）、消化球菌科（Peptococcaceae）相對(duì)豐度（＜0.05、0.01），雙歧桿菌組顯著下調(diào)氨基酸球菌科（Acidaminococcaceae）相對(duì)豐度（＜0.05）；補(bǔ)陽(yáng)還五湯組與雙歧桿菌組之間無(wú)明顯差異菌群。

為進(jìn)一步分析補(bǔ)陽(yáng)還五湯改變腸道菌群結(jié)構(gòu)后可能引起的功能變化，采用Tax4Fun對(duì)群落進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）功能預(yù)測(cè)。通過(guò)熱圖展示KEGG通路二級(jí)水平上KO豐度前20的通路，如圖4-A所示，不同樣本之間存在差異。經(jīng)Welch’s檢驗(yàn)如圖4-B所示，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組顯著上調(diào)多糖的生物合成及代謝（glycan biosynthesis and metabolism）、轉(zhuǎn)運(yùn)及分解代謝（transport and catabolism），顯著下調(diào)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性（cell motility）（＜0.05），雙歧桿菌組無(wú)顯著性差異。

綜上，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以通過(guò)改變?nèi)毖阅X卒中氣虛血瘀證大鼠腸道菌群物種組成結(jié)構(gòu)，從而影響菌群相關(guān)的功能。雙歧桿菌四聯(lián)活菌片對(duì)缺血性腦卒中氣虛血瘀證大鼠腸道菌群影響較小，且對(duì)其功能影響與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異，可能與胃酸大量殺傷活菌有關(guān)。補(bǔ)陽(yáng)還五湯較雙歧桿菌四聯(lián)活菌片有更強(qiáng)的調(diào)節(jié)腸道菌群作用。

3.3 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)缺血性腦卒中氣虛血瘀證大鼠血漿代謝產(chǎn)物的影響

研究表明，腸道菌群可以通過(guò)代謝產(chǎn)物影響缺血性腦卒中神經(jīng)損傷和修復(fù)[13]。為了探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯影響缺血性腦卒中氣虛血瘀證大鼠的腸道菌群組成后，對(duì)相關(guān)代謝產(chǎn)物的影響，本研究采用非靶向代謝組學(xué)即LC-MS法，分析大鼠血漿代謝產(chǎn)物。如圖5所示，利用OPLS-DA發(fā)現(xiàn)正離子模式和負(fù)離子模式下，與對(duì)照組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠血漿代謝譜存在差異，經(jīng)交叉驗(yàn)證證實(shí)模型穩(wěn)定（正離子模式：2＝0.881、2＝0.293；負(fù)離子模式：2＝0.873、2＝0.26）。如圖6所示，差異代謝物聚類(lèi)熱圖直觀顯示出對(duì)照組與補(bǔ)陽(yáng)還五湯組之間在正、負(fù)離子模式下的代謝產(chǎn)物的聚類(lèi)差異，提示對(duì)照組與補(bǔ)陽(yáng)還五湯組間代謝輪廓存在差異。補(bǔ)陽(yáng)還五湯組與雙歧桿菌組、雙歧桿菌組與對(duì)照組模型穩(wěn)定性差，有過(guò)擬合現(xiàn)象，提示其代謝輪廓差異性不明顯。

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與雙歧桿菌組比較：#P＜0.05

與對(duì)照組比較：*P＜0.05

結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析OPLS-DA中VIP≥1且＜0.05來(lái)篩選不同組間的顯著差異代謝物[14]，發(fā)現(xiàn)POS和NEG模式下有多個(gè)代謝物失調(diào)。與對(duì)照組比較，在POS模式下補(bǔ)陽(yáng)還五湯組上調(diào)10個(gè)代謝產(chǎn)物，下調(diào)17個(gè)代謝產(chǎn)物；在NEG模式下，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組上調(diào)12個(gè)代謝產(chǎn)物，下調(diào)19個(gè)代謝產(chǎn)物。由于大部分代謝物未定性，故只列出部分已定性且有顯著差異的代謝產(chǎn)物，見(jiàn)表3。綜上，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以改變?nèi)毖阅X卒中氣虛血瘀證大鼠的血漿代謝產(chǎn)物，可能是補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療缺血性腦卒中的重要途徑。

圖5 正離子模式(A) 和負(fù)離子模式(B) 下對(duì)照組與補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠血漿代謝產(chǎn)物OPLS-DA得分圖

圖6 正離子模式(A) 和負(fù)離子模式(B) 下對(duì)照組與補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠血漿差異代謝產(chǎn)物的聚類(lèi)熱圖

3.4 補(bǔ)陽(yáng)還五湯通過(guò)改變?nèi)毖阅X卒中大鼠腸道菌群影響其血漿代謝輪廓

為了探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯組改變?nèi)毖阅X卒中氣虛血瘀證大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與其血漿代謝產(chǎn)物之間的關(guān)聯(lián)性，本研究利用O2PLS模型結(jié)合皮爾遜相關(guān)系數(shù)（Pearson correlation coefficient，cor），對(duì)腸道微生物組和血漿代謝組學(xué)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析[15-16]。O2PLS模型顯示了腸道微生物與代謝物之間的共變（2＝0.537、2＝0.354、2cor＝0.537、2cor＝0.354），腸道菌群在科水平的變化與代謝物變化相關(guān)，提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以通過(guò)改變?nèi)毖阅X卒中氣虛血瘀證大鼠的腸道菌群，從而影響其血漿代謝產(chǎn)物（|cor|＞0.5、＜0.05）。為清晰直觀地呈現(xiàn)微生物與代謝物的相關(guān)性，取|cor|＞0.5的關(guān)系以熱圖展示，如圖7-A所示，科水平微生物與代謝產(chǎn)物存在較強(qiáng)的相關(guān)性，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組顯著下調(diào)紅蝽菌科（Coriobacteriaceae）豐度，與代謝產(chǎn)物POS8344、POS13328、POS13329、POS2402、POS4011、POS7208（α-亞麻酸肉堿）等呈正相關(guān)，與POS862、POS630、POS4803（-棕櫚酰肉堿）等呈負(fù)相關(guān)；補(bǔ)陽(yáng)還五湯組顯著下調(diào)理研菌科（Rikenellaceae）豐度，與POS5541、NEG2023、NEG7802、NEG7803、NEG7847呈正相關(guān)。

表3 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)缺血性腦卒中氣虛血瘀證大鼠部分內(nèi)源性代謝物的影響

Table 1 Effect of Buyang Huanwu Decoction on endogenous metabolites in IS rats with qi deficiency and blood stasis syndrome

“↑”表示上調(diào)，“↓”表示下調(diào)

“↑” denotes upregulation, “↓” denotes downregulation

為了進(jìn)一步展示腸道微生物與血漿代謝物之間的關(guān)系，在腸道菌群科水平將配對(duì)顯著相關(guān)的微生物與代謝物構(gòu)建相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，如圖7-B所示，可見(jiàn)1個(gè)代謝物可以與多個(gè)腸道菌群相關(guān)，1個(gè)腸道菌群可以與多個(gè)代謝物相關(guān)，提示腸道菌群與代謝物之間存在復(fù)雜關(guān)系。綜上，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以通過(guò)影響缺血性腦卒中氣虛血瘀證大鼠腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)，從而影響其相關(guān)代謝產(chǎn)物，這可能是補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療缺血性腦卒中的重要機(jī)制。

4 討論

缺血性腦卒中的病因和病理生理過(guò)程復(fù)雜，對(duì)于無(wú)法在時(shí)間窗內(nèi)開(kāi)通血管恢復(fù)局部血液供應(yīng)的患者，其缺血半暗帶腦組織繼發(fā)性損傷機(jī)制更為復(fù)雜，目前臨床上仍缺少有效的生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。本研究采用高通量16S rRNA基因測(cè)序和非靶向代謝組學(xué)分析補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)缺血性腦卒中氣虛血瘀證大鼠腸道微生物群和血漿代謝產(chǎn)物的影響，通過(guò)整合腸道微生物和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠顯著改變?nèi)毖阅X卒中氣虛血瘀證大鼠腸道微生物群落組成結(jié)構(gòu)及其血漿代謝產(chǎn)物，且腸道菌群的改變與血漿代謝物變化顯著相關(guān)，表明補(bǔ)陽(yáng)還五湯不僅改變了腸道菌群，還影響了其相關(guān)的代謝表型。整合腸道菌群和代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)有助于篩選補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療缺血性腦卒中有效的血漿代謝產(chǎn)物及其相應(yīng)的腸道微生物群落，為其臨床應(yīng)用提供思路。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯為治療缺血性腦卒中氣虛血瘀證的代表方劑，方中重用黃芪120 g，約為其他藥材總用量的5倍。黃芪及其有效成分具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用。張宇等[17]研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖有扶植有益菌、抑制有害菌的作用；孫立群等[18]采用納米級(jí)黃芪治療潰瘍性結(jié)腸炎大鼠，發(fā)現(xiàn)大鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳酸桿菌水平明顯上升，腸球菌、腸桿菌水平下降，大鼠腸道菌群比例恢復(fù)正常。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中大鼠腸道菌群失調(diào)表現(xiàn)為厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)豐度下調(diào)，變形菌門(mén)、脫鐵桿菌門(mén)豐度上調(diào)，與Wang等[2]研究一致，提示上述腸道菌群失調(diào)可能導(dǎo)致缺血性腦卒中神經(jīng)損傷加重。本研究結(jié)果顯示，與雙歧桿菌組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯顯著下調(diào)缺血性腦卒中氣虛血瘀證大鼠腸道變形菌門(mén)，顯著上調(diào)擬桿菌門(mén)；與對(duì)照組比較，顯著下調(diào)放線菌門(mén)（Actinobacterium），表明補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以調(diào)節(jié)缺血性腦卒中后的腸道菌群失調(diào)，促進(jìn)腸道菌群正常結(jié)構(gòu)的恢復(fù)，且作用明顯優(yōu)于雙歧桿菌四聯(lián)活菌片。補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用可能是其治療缺血性腦卒中氣虛血瘀證的重要機(jī)制，后續(xù)將進(jìn)一步通過(guò)糞菌移植的方法來(lái)驗(yàn)證上述機(jī)制。

格子顏色由白到紅表示正相關(guān)由弱到強(qiáng)，由白到藍(lán)表示負(fù)相關(guān)由弱到強(qiáng)

為了闡明缺血性腦卒中后腸道菌群的改變導(dǎo)致代謝組學(xué)的變化，本研究對(duì)大鼠血漿進(jìn)行非靶向代謝譜分析。通過(guò)OPLS-DA和PLS-DA等多變量統(tǒng)計(jì)分析顯示，補(bǔ)陽(yáng)還五湯改變了缺血性腦卒中大鼠血漿的代謝輪廓。與對(duì)照組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組共發(fā)現(xiàn)甘氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、精氨酸等58種血漿代謝產(chǎn)物存在顯著性差異，表明補(bǔ)陽(yáng)還五湯可能通過(guò)影響氨基酸代謝發(fā)揮治療缺血性腦卒中的作用；補(bǔ)陽(yáng)還五湯組油酸酰胺、異甘草苷血漿濃度分別上調(diào)2.17倍和2.43倍，提示抗氧化作用是其參與缺血性腦卒中后神經(jīng)保護(hù)的機(jī)制[19-20]；補(bǔ)陽(yáng)還五湯組華法林血漿濃度上調(diào)3.43倍，提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯可降低缺血性腦卒中血液高凝狀態(tài)。這些代謝產(chǎn)物均可能是補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療缺血性腦卒中的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，后續(xù)有待進(jìn)一步驗(yàn)證。非靶向代謝組學(xué)檢測(cè)的代謝產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量一般小于1000，且質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)資料有限，尤其是中藥有效成分質(zhì)譜數(shù)據(jù)的短缺，導(dǎo)致大部分物質(zhì)無(wú)法識(shí)別定性，可能存在未發(fā)現(xiàn)的具重要治療作用的血漿代謝產(chǎn)物。

腸道菌群相關(guān)的代謝表型變化有助于了解疾病的發(fā)生發(fā)展[21-22]。本研究將2個(gè)組學(xué)的數(shù)據(jù)通過(guò)O2PLS模型進(jìn)行結(jié)合分析，發(fā)現(xiàn)某些血漿代謝產(chǎn)物與組間有顯著差異的腸道菌群存在較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，這些代謝產(chǎn)物可能是腸道菌群直接作用于缺血性腦卒中的重要物質(zhì)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組紅蝽菌科豐度顯著下調(diào)，導(dǎo)致其相關(guān)代謝產(chǎn)物-棕櫚酰肉堿（POS4803）顯著上調(diào)、α-亞麻酸肉堿（POS7208）顯著下調(diào)，提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群從而影響肉堿的代謝和吸收，而肉堿在神經(jīng)系統(tǒng)中有重要的抗氧化保護(hù)作用。

綜上所述，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以調(diào)節(jié)缺血性腦卒中氣虛血瘀證大鼠腸道菌群，促進(jìn)缺血性腦卒中后大鼠腸道菌群的恢復(fù)，并且影響其血漿代謝輪廓，而部分代謝產(chǎn)物的改變與腸道菌群顯著相關(guān)，提示腸道菌群可能是補(bǔ)陽(yáng)還五湯發(fā)揮治療作用的重要生物學(xué)基礎(chǔ)，作用機(jī)制可能與影響代謝產(chǎn)物有關(guān)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of Buyang Huanwu Decoction on gut microbiota and plasma metabolites in ischemic stroke rats withdeficiency and blood stasis syndrome

WU Wan-feng1, 2, NIE Hui-fang1, HU Li-juan1, SUN Yi-hang1, LUO Ning1, JIANG Cheng-ting1, CHENG Shao-wu1, GE Jin-wen1

1. College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 2. The First Affiliated Hospital of Hunan College of Traditional Chinese Medicine, Zhuzhou 412000, China

To study the effect of Buyang Huanwu Decoction (補(bǔ)陽(yáng)還五湯) on gut microbiota and plasma metabolites in ischemic stroke rats withdeficiency and blood stasis syndrome.Rat models withdeficiency and blood stasis of ischemic stroke were established by combing TCM syndrome and middle cerebral arteryocclusion(MCAO) modeling methods. Rats were divided into control group, Buyang Huanwu Decoction (24g/kg) group and bifidobacterium (0.81 g/kg) group. Except rats in control group were ig normal saline, rats in the other groups were ig corresponding drugs. After 72 h, whole brain of rats were collected and TTC staining were performed to detect the volume of cerebral infarction; Contents of cecum were collected to detect the intestinal flora by 16S rRNA gene sequencing; Plasma were separated to detect the plasma metabolites by metabolomics, the relationship between intestinal flora and metabolite were analyzed by establishing model.Compared with control group, Buyang Huanwu Decoction improved neurological deficit score (< 0.05), reduced the infarct volume (< 0.001), and regulated the gut microbiota significantly (< 0.01). Therefore, it affected the plasma metabolites profile of ischemic stroke in rats model. Conversely, bifidobacterium quadruple viable tablets displayed little effect on gut microbiota and plasma metabolites, which had no effect on neurological deficit score and infarction volume.Buyang Huanwu Decoction has a therapeutic effect ondeficiency and blood stasis syndrome by regulating rats gut microbiota of ischemic stroke and influencing the plasma metabolism profile.

Buyang Huanwu Decoction (補(bǔ)陽(yáng)還五湯); ischemic stroke;deficiency and blood stasis syndrome; gut microbiota; metabolites

R285.5

A

0253 - 2670(2021)01 - 0118 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.01.015

2020-07-19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81774174）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（2018CX01）

吳萬(wàn)豐，男，副主任醫(yī)師，博士研究生，從事腸道微生態(tài)與腦病的中西醫(yī)結(jié)合研究。Tel: 13786364825 E-mail: wwffxy@163.com

葛金文，博士，教授，從事中西醫(yī)結(jié)合防治心腦血管病的研究，Tel: (0731)88458007 E-mail: 40831556@qq.com

成紹武，博士，教授，從事神經(jīng)生物學(xué)與中藥抗衰老。E-mail: 702058195@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]