安思宇，張 磊，尚獻(xiàn)召，岳洪水，柳文媛，鞠愛春*

1. 天津天士力之驕藥業(yè)有公司，天津市中藥注射劑安全性評(píng)價(jià)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300402 2. 中國(guó)藥科大學(xué)藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009

引 言

近紅外光譜技術(shù)(near infrared spectroscopy, NIR)具有分析速度快、分析效率高、分析成本低、可偶聯(lián)光纖進(jìn)行遠(yuǎn)距離操作、操作技術(shù)要求低等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為過程分析技術(shù)的重要組成部分。通過建立中藥生產(chǎn)過程關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)的NIR定量分析模型，可以實(shí)現(xiàn)活性成分的快速無損測(cè)定，控制中藥產(chǎn)品生產(chǎn)過程質(zhì)量穩(wěn)定性。注射用益氣復(fù)脈(凍干)是基于傳統(tǒng)中藥古方生脈散發(fā)展起來的一種新型凍干粉針制劑，由紅參、麥冬、五味子3種藥材組成，具有益氣復(fù)脈，養(yǎng)陰生津的功效?？傇碥蘸渴亲⑸溆靡鏆鈴?fù)脈(凍干)紅參提取過程的質(zhì)量指標(biāo)，因此需要建立該指標(biāo)的監(jiān)測(cè)方法控制注射用益氣復(fù)脈(凍干)生產(chǎn)過程質(zhì)量。

NIR存在吸收強(qiáng)度弱且譜區(qū)信息重疊嚴(yán)重等瓶頸問題[1-2]，進(jìn)行光譜預(yù)處理雖然可以消除一些影響因素帶來的干擾信息，但是有效的波長(zhǎng)仍然掩蓋在整條光譜中，因此選擇適當(dāng)?shù)淖兞亢Y選方法是提升模型精度的重要手段。目前主要的變量篩選方法有： 連續(xù)投影方法(successive projections algorithm，SPA)[3]、間隔偏最小二乘法(interval partial least squares，IPLS)[4]、移動(dòng)窗口偏最小二乘法(moving window partial least squares，MWPLS)[5]、無信息變量消除法(uninformative variable elimination，UVE)[6]和遺傳算法(genetic algorithm，GA)[7]以及OPUS、TQ Analyst等光譜分析軟件自帶的變量篩選方法，它們都是一次性變量篩選方法且沒有考慮到變量之間的交互作用。

模型集群分析(model population analysis, MPA)的思想打破了傳統(tǒng)的一次性建模思路[8]，隨機(jī)蛙跳法(random frog，RF)[9-10]、競(jìng)爭(zhēng)自適應(yīng)重加權(quán)(competitive adaptive reweighted sampling，CARS)[11-12]、變量組合集群分析法(variable combination population analysis，VCPA)[13-14]以及迭代保留信息變量(iteratively retaining informative variables，IRIV)[15-16]等都是在MPA思想下衍生出的變量篩選方法。其中RF[9-10]、CARS[11-12]已經(jīng)廣泛用于近紅外光譜信息變量篩選中以提高模型性能，而對(duì)于VCPA與IRIV的應(yīng)用研究較少, 目前未有在中藥生產(chǎn)過程質(zhì)量檢測(cè)的應(yīng)用實(shí)例。本研究采用VCPA迭代IRIV[17]變量篩選算法建立紅參總皂苷偏最小二乘(partial least squares，PLS)定量分析模型，對(duì)預(yù)測(cè)集總皂苷含量進(jìn)行預(yù)測(cè)，并與其他變量篩選條件下建立的模型性能進(jìn)行比較。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

MATRIX-F型傅里葉變換近紅外光譜儀(德國(guó)Bruker)，配有OPUS數(shù)據(jù)處理軟件(版本7.5)； SHIMADZU UV-2600紫外-可見分光光度計(jì)(日本Shimadzu)； MS204TS型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo)； MATLAB數(shù)學(xué)軟件(美國(guó)MathWorks)； 紅參提取過程終產(chǎn)物(天津天士力之驕藥業(yè)有限公司提供，共55批，批號(hào)A1—A55)； 人參皂苷Re對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定研究院)。

1.2 紫外-可見分光光度法測(cè)定紅參提取物中總皂苷含量

1.2.1 供試品溶液的制備

精密稱定0.1 g紅參提取終產(chǎn)物，用10 mL 0.5 mol·L-1氫氧化鈉溶液溶解，上預(yù)先處理好的AB-8樹脂柱，分別用0.5 mol·L-1的氫氧化鈉的20%甲醇溶液與20%甲醇溶液洗脫雜質(zhì)，最終用甲醇洗脫待測(cè)物，過濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取人參皂苷Re對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，搖勻，即得。

1.2.3 測(cè)定條件

精密量取對(duì)照品溶液20，40，60，80和100 μL，及供試品溶液40 μL，分別置于10 mL具塞試管中。置水浴中揮盡溶劑后取出，放冷，精密加新配制含5%香草醛的冰醋酸溶液和高氯酸混和液(2∶8) 1 mL，搖勻。置60 ℃水浴中加熱15 min，取出，立即置冰浴中冷卻2 min。精密加冰醋酸5 mL，搖勻，在室溫下放置5 min。以相應(yīng)試劑為空白，在550 nm處測(cè)定吸收度，計(jì)算，即得。

1.3 近紅外光譜采集

稱取2.5 g紅參提取終產(chǎn)物，使用純化水定容至25 mL，混勻，使提取物充分溶解。將所得溶液轉(zhuǎn)移至離心管，使用德國(guó)Bruker公司MATRIX-F型近紅外光譜儀采集近紅外光譜。以內(nèi)部空氣作為參比，光譜采集模式為透射，采集方式為在線探頭采集。NIR采集參數(shù)為： 光程為2 mm，分辨率為2 cm-1，光譜掃描范圍4 000～12 000 cm-1，掃描32次。收集樣本的原始光譜如圖1。

1.4 校正集與驗(yàn)證集的選擇

采用1.2項(xiàng)中的紫外可見分光光度法測(cè)定樣本中的總皂苷值，利用聯(lián)合x-y距離的樣本集劃分(sample set partitioning based on joint x-y distance, SPXY)方法將55批紅參樣本分為40個(gè)校正樣本與15批外部檢驗(yàn)樣本。

圖1 紅參提取物原始近紅外光譜Fig.1 Original near infrared (NIR) spectra of red ginseng

表1 紅參提取物校正集和驗(yàn)證集的劃分結(jié)果Table 1 Statistical characteristics of total saponins value

1.5 光譜預(yù)處理

常見的光譜預(yù)處理方法有均值中心化、多元散射校正、卷積平滑法和小波變換等。本研究的預(yù)處理方法均為多元散射校正(multiplicative scatter correction，MSC)，用來修正各樣品近紅外光譜間的相對(duì)基線平移和偏移現(xiàn)象。

1.6 基于不同方法的特征變量提取過程

為了比較不同變量篩選方法對(duì)紅參提取物總皂苷近紅外定量模型的影響，將經(jīng)過MSC預(yù)處理的紅參總皂苷光譜數(shù)據(jù)分別利用VCPA-IRIV，VCPA，CARS，RF以及OPUS軟件自帶的變量篩選方法進(jìn)行變量篩選。

其中VCPA-IRIV運(yùn)用二進(jìn)制矩陣采樣法(BMS)從紅參提取物近紅外光譜變量中采樣1 000次，得到1 000組不同的變量組合，運(yùn)用PLS方法分別對(duì)這1 000組變量組合進(jìn)行光譜建模，計(jì)算交叉驗(yàn)證均方根誤差(cross validation root mean square error, RMSECV)最小的前15%的變量組合中各光譜變量出現(xiàn)的次數(shù)，以及RMSECV最大的前5%的變量組合中光譜變量出現(xiàn)的次數(shù)，兩者相減即為相應(yīng)光譜變量的貢獻(xiàn)值。運(yùn)用指數(shù)遞減(EDF)函數(shù)迭代運(yùn)行40次，刪除貢獻(xiàn)小的變量，最終剩下100個(gè)變量。迭代結(jié)束后每個(gè)變量被選擇的頻率如圖2。接著聯(lián)用IRIV方法，BMS采樣200次，逐個(gè)波長(zhǎng)變量計(jì)算包含和不包含該變量時(shí)的RMSECV 平均值，得到兩者之差DMEAN(difference of mean values)和非參數(shù)檢驗(yàn)方法曼-惠特尼U檢驗(yàn)的P值，按表2所示變量篩選規(guī)則去除無信息與干擾信息變量，保留強(qiáng)信息與弱信息波長(zhǎng)變量，經(jīng)多次迭代循環(huán)直至無信息和干擾信息變量全部消除，最終篩選出18個(gè)變量。接下來為了體現(xiàn)VCPA與IRIV聯(lián)用的優(yōu)越性，單獨(dú)使用VCPA方法進(jìn)行變量篩選。

CARS模仿進(jìn)化論中的“適者生存”法則，采用蒙特卡洛采樣法抽取80%的樣本為校正集，建立PLS回歸模型，計(jì)算每個(gè)變量回歸系數(shù)，回歸系數(shù)絕對(duì)值越大則貢獻(xiàn)值越大，利用EDF函數(shù)去除貢獻(xiàn)值小的波長(zhǎng)點(diǎn)，此過程迭代500次，得到500組不同的變量子集，最后建立每個(gè)子集的PLS回歸模型，其中RMSECV最小的變量子集即為最優(yōu)子集。

RF是一種類似可逆跳轉(zhuǎn)的馬爾科夫鏈蒙特卡洛算法，通過在模型空間模擬一條正態(tài)分布的馬爾可夫鏈來計(jì)算每個(gè)變量被選擇的概率，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)變量選擇，迭代1 000次后，被選擇概率前10的波數(shù)變量為最后的特征變量。以上4種變量篩選算法均在MATLAB軟件中使用。

光譜采集用的MATRIX-F型傅里葉變換近紅外光譜儀，附帶數(shù)據(jù)處理分析軟件OPUS，該軟件自帶的變量篩選方法操作簡(jiǎn)便、應(yīng)用廣泛，考察該軟件所建PLS模型的性能，可以論證MPA下衍生的變量篩選方法是否有推廣應(yīng)用的價(jià)值。

表2 變量篩選規(guī)則Table 2 Variable classification rules

圖2 VCPA-IRIV變量篩選過程中變量被選擇的次數(shù)Fig.2 The frequency of variables selected by VCPA-IRIV

2 結(jié)果與討論

用不同方法篩選出的變量建立PLS定量分析模型，并對(duì)建模結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表3所示。

表3 不同變量篩選方法的模型結(jié)果Table 3 Comparison on modeling results by differentvariables screening methods

結(jié)果表明OPUS軟件自帶變量篩選方法以及CARS、RF雖然減少了冗余信息，但是其建模效果并不理想，Rc分別為0.601 3，0.565 3與0.644 0，與全波長(zhǎng)光譜建模效果相當(dāng)，并沒有成功篩選出有效變量。這是因?yàn)镺PUS軟件采用一次性采樣方法建模，且只能篩選成段的變量，CARS利用蒙特卡洛采樣法在樣本空間進(jìn)行重復(fù)取樣，RF利用蒙特卡洛采樣法在變量空間進(jìn)行重復(fù)取樣，卻都沒有考慮到變量之間的組合效應(yīng)，不適用于提取紅參提取物中的有效變量。

VCPA-PLS模型的Rc為0.951 2，是所有方法中最高的，但是其RSEP(%)為9.95%，預(yù)測(cè)效果沒有VCPA-IRIV-PLS好，且其RMSEC與RMSEP之間差值最大，過擬合現(xiàn)象最嚴(yán)重。這表明雖然VCPA方法可以通過BMS采樣得到1 000組不同的變量組合，很好地考慮了變量組合效應(yīng)，但是當(dāng)變量數(shù)遠(yuǎn)大于樣本數(shù)時(shí)，VCPA無法實(shí)現(xiàn)所有變量的組合，容易受到無關(guān)信息與干擾信息的影響，導(dǎo)致模型的過度擬合，而IRIV可以更好地去除無關(guān)信息與干擾信息，兩者聯(lián)用時(shí)可以很好地彌補(bǔ)自身的缺點(diǎn)，提高模型預(yù)測(cè)效果。因此VCPA-IRIV更適用于紅參提取物總皂苷的模型建立，可以用來檢測(cè)本公司注射用益氣復(fù)脈(凍干)生產(chǎn)過程，紅參提取過程終產(chǎn)物的總皂苷值。

VCPA-IRIV在考慮變量組合效應(yīng)的同時(shí)，很好地排除無關(guān)信息與干擾信息變量，不僅解決了紅參提取物中的變量篩選問題，也為變量之間存在相關(guān)關(guān)系的近紅外定量分析模型的擬合帶來思路，該方法的推廣有利于近紅外光譜技術(shù)在中藥制劑生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制中的應(yīng)用。將該方法應(yīng)用于其他分析對(duì)象時(shí)，可通過調(diào)整相關(guān)控制系數(shù)，以達(dá)到最佳的模型擬合效果，除了IRIV，還可以在VCPA的基礎(chǔ)上疊加使用其他變量選擇方法，以提升相關(guān)質(zhì)量指標(biāo)分析模型的預(yù)測(cè)性能。