陳超 馮長松 張偉麗 李先維

(信陽職業(yè)技術(shù)學院 1醫(yī)學院，河南 信陽 464000；2附屬醫(yī)院內(nèi)科)

結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤，腫瘤細胞惡性表型與腫瘤細胞中相關(guān)基因的異常表達有關(guān)，研究腫瘤細胞惡性表型分子機制對于研究腫瘤發(fā)生機制和腫瘤的治療具有重要意義〔1〕。核基質(zhì)結(jié)合區(qū)結(jié)合蛋白質(zhì)(SATB)1在T細胞、前B細胞及神經(jīng)和骨髓組織中表達水平較高，而在正常組織中的表達水平較低〔2〕。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，SATB1與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，其在乳腺癌、肺癌等腫瘤中異常高表達，并且在腫瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮促進作用〔3,4〕。在甲狀腺癌中發(fā)現(xiàn)敲低SATB1具有抑制腫瘤細胞侵襲的作用〔5〕。目前有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)SATB1在結(jié)腸癌中陽性表達率明顯高于癌旁組織，SATB1可能參與結(jié)腸癌細胞惡性增殖和轉(zhuǎn)移過程〔6〕。本實驗探討敲減SATB1對結(jié)腸癌細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等惡性生物學特性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 結(jié)腸癌SW480細胞購自南京科佰生物科技有限公司；陰性對照慢病毒和SATB1 shRNA重組慢病毒由南京雙領(lǐng)生物科技有限公司構(gòu)建；Revert Aid第一鏈cDNA Synthesis試劑盒、Power SYBR Green PCR Master Mix購自美國Thermo；鈣黏附蛋白E(E-cadherin)抗體、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-9抗體、波形蛋白(Vimentin)抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology；基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9抗體、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3抗體、MMP-2抗體購自美國Cell Signaling Technology；SATB1抗體購自美國Abcam。

1.2慢病毒感染和分組 SW480細胞分成3組，分別為：SW480-WT組、SW480-sh-NC組、SW480-sh-SATB1組，SW480-WT組為不感染慢病毒的野生型SW480細胞，SW480-sh-NC組、SW480-sh-SATB1組分別為感染陰性對照慢病毒和SATB1 shRNA重組慢病毒的SW480細胞。SW480細胞接種到6孔細胞培養(yǎng)板中，在倒置顯微鏡下觀察細胞密度為40%可以用于慢病毒感染，常規(guī)方法感染慢病毒，步驟為：把孔內(nèi)的液體吸棄以后，添加MOI=20的慢病毒液，繼續(xù)放置在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h以后，取出細胞培養(yǎng)板，更換細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d以后，用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定感染的細胞株用于后續(xù)實驗。

1.3Realtime PCR測定敲減效果 取融合率超過80%的SW480-WT、SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1細胞，用Trizol試劑提取細胞中的總RNA，吸取2 μl的RNA用紫外風光光度計檢測A260/A280的比值，其比值1.8～2.0可以用于實驗。根據(jù)Revert Aid第一鏈cDNA Synthesis試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，獲取的cDNA進行下一步的PCR擴增。引物設(shè)計如下：GAPDH正義鏈：5′-TGACTTCAACAGCGACACCA-3′,反義鏈5′-CACCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′,SATB1正義鏈：5′-CAGCACACCACCCAGCCGTC-3′,反義鏈：5′-GCTCGCACAACCATCCCTGGC-3′,引物交由上海生工合成。Power SYBR Green PCR Master Mix進行定量PCR，反應(yīng)程序為：95℃，30 s；60℃，30 s；72℃，30 s；共35個循環(huán)。采用2-△△Ct法計算SATB1 mRNA水平。

1.4Western印跡測定敲減效果 取生長至80%的SW480-WT、SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌以后，添加蛋白裂解溶液，放在冰上裂解液30 min，期間每隔10 min混合一次。4℃，12 000 r/min離心10 min后，吸取蛋白上清溶液，添加到5×上樣緩沖液混合后，放在100℃煮沸5 min。按照常規(guī)方法配制5%的濃縮膠和10%的分離膠，按照每個上樣孔中添加50 μg蛋白樣品上樣后，設(shè)置100 V電壓電泳，溴酚藍剛跑出凝膠以后停止電泳。在100 V電壓條件下把蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，放在封閉液(以TBST配制5%牛血清白蛋白)中在室溫中孵育2 h后，將NC膜放在一抗和二抗反應(yīng)液中，抗體反應(yīng)液均以封閉液稀釋，一抗按照1∶800稀釋，二抗按照1∶2 000稀釋。電化學發(fā)光(ECL)以后，暗室中曝光，掃描圖片，用Image J分析條帶灰度值，設(shè)置GAPDH為參照。

1.5噻唑藍(MTT)方法測定結(jié)腸癌細胞增殖 SW480-WT、SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，每個孔中添加100 μl的細胞懸浮液，放在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h以后，于每個孔內(nèi)添加20 μl的MTT溶液，放在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h。取出培養(yǎng)板，把孔內(nèi)液體倒掉，添加DMSO溶液150 μl，置于酶標儀上測定490 nm的吸光度(A)值，以SW480-WT細胞存活率為100%，分析SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1細胞存活率。

1.6平板克隆實驗測定結(jié)腸癌細胞克隆能力 SW480-WT、SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1細胞按照每孔300個細胞接種到6孔板內(nèi)，十字形晃動使細胞均勻分布，培養(yǎng)14 d以后，用甲醇固定，放在空氣中干燥，添加吉姆薩染色后，觀察細胞克隆形成數(shù)目，以克隆形成數(shù)目占接種細胞數(shù)目的百分比表示細胞克隆形成率。

1.7流式細胞術(shù)測定結(jié)腸癌細胞凋亡變化 取SW480-WT、SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1細胞各106個，用預(yù)冷的PBS將細胞洗滌3次以后，添加300 μl的結(jié)合緩沖液混合后，分別加入碘化丙啶(PI)和膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)染液混，上流式細胞儀檢測前添加200 μl的結(jié)合緩沖液。

1.8MTT方法測定結(jié)腸癌細胞黏附能力 將50 μg/ml的纖維黏連蛋白添加到96孔板中，每孔75 μl，用37℃預(yù)熱后的PBS洗滌以后，用牛血清白蛋白將非特異性位點封閉。將SW480-WT、SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1細胞接種到上述96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)2 h以后，用PBS把沒有黏附的細胞洗掉，添加100 μl的細胞液和20 μl的MTT溶液，孵育4 h后，吸除上清，繼續(xù)加入150 μl的DMSO溶液，置于酶標儀上測定490 nm的A值。以SW480-WT細胞黏附率為100%，分析SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1細胞黏附率變化。

1.9細胞劃痕實驗測定結(jié)腸癌細胞遷徙運動能力 SW480-WT、SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1細胞按照每孔中添加5×104個細胞接種到6孔板內(nèi)，細胞至長滿時，用移液槍槍頭在培養(yǎng)板的中央劃出一條細痕，添加PBS洗滌以后，以不含血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)48 h后，取出培養(yǎng)板，用Image pro plus分析劃痕的寬度。劃痕愈合率=100%×(劃痕初始寬度-48 h劃痕寬度)÷劃痕初始寬度。

1.10Transwell小室測定結(jié)腸癌細胞遷移和侵襲能力 細胞侵襲和遷移實驗均用Transwell小室檢測，侵襲實驗前用50 mg/L的基質(zhì)膠將小室濕化后進行實驗。步驟為：將 SW480-WT、SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1細胞以不含血清的培養(yǎng)液懸浮以后，細胞密度為1×105個/ml，各組細胞吸取200 μl添加到Transwell小室的上室中，在下室中添加500 μl的含有胎牛血清的細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h以后，取出小室，用結(jié)晶紫染色以后，隨機選取5個視野，計數(shù)細胞穿膜數(shù)量。

1.11Western印跡檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標志蛋白E-cadherin、Vimentin和侵襲遷移蛋白MMP-2、MMP-9及凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9表達變化 取SW480-WT、SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1細胞，用Western印跡方法測定細胞中E-cadherin(抗體以1∶600稀釋)、Vimentin(抗體以1∶800稀釋)、MMP-2(抗體以1∶1 000稀釋)、MMP-9(抗體以1∶1 000稀釋)、Cleaved Caspase-3(抗體以1∶400稀釋)、Cleaved Caspase-9(抗體以1∶400稀釋)蛋白表達水平。

1.12統(tǒng)計分析 采用SPSS21.0軟件進行方差分析，LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1SATB1 shRNA下調(diào)結(jié)腸癌細胞中SATB1表達 與SW480-sh-NC組比較，SW480-sh-SATB1組細胞中SATB1 mRNA和蛋白表達水平均明顯降低(均P<0.05)，見圖1，表1。

2.2敲減SATB1抑制結(jié)腸癌細胞增殖和克隆 與SW480-sh-NC組比較，SW480-sh-SATB1組細胞存活率和克隆形成率均降低(P<0.05)，見圖2，表2。

圖1 Western 印跡檢測SATB1 shRNA重組慢病毒感染后SW480細胞中SATB1蛋白表達變

表1 SATB1 shRNA重組慢病毒感染后SW480細胞中SATB1 mRNA和蛋白表達水平

圖2 平板克隆實驗檢測SATB1 shRNA重組慢病毒感染后SW480細胞克隆形成能力

表2 SATB1 shRNA重組慢病毒感染后SW480細胞存活率和克隆形成率

2.3敲減SATB1誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞凋亡和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達 與SW480-sh-NC組比較，SW480-sh-SATB1組細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3，圖4，表3。

圖3 流式細胞術(shù)檢測敲減SATB1后SW480細胞凋亡變化

2.4敲減SATB1抑制結(jié)腸癌細胞遷徙運動和黏附 與SW480-sh-NC組比較，SW480-sh-SATB1組細胞劃痕愈合率和細胞黏附率均顯著降低(P<0.05)，見表4。

圖4 Western 印跡檢測敲減SATB1后SW480細胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達變化

表3 SATB1 shRNA重組慢病毒感染后SW480細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平

2.5敲減SATB1抑制結(jié)腸癌細胞侵襲和遷移 與SW480-sh-NC組比較，SW480-sh-SATB1組細胞侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目和MMP-2、MMP-9蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)，見圖5，表5。

表4 SATB1 shRNA重組慢病毒感染后SW480細胞劃痕愈合率和細胞黏附率

圖5 Western 印跡檢測SATB1 shRNA重組慢病毒感染后SW480細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達變化

表5 SATB1 shRNA重組慢病毒感染后SW480細胞侵襲數(shù)目、遷移數(shù)目和MMP-2、MMP-9蛋白表達水平

2.6敲減SATB1抑制結(jié)腸癌細胞EMT 與SW480-sh-NC組比較，SW480-sh-SATB1組細胞E-cadherin蛋白表達水平顯著升高，Vimentin蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖6，表6。

圖6 Western 印跡檢測SATB1 shRNA重組慢病毒感染后SW480細胞中E-cadherin和Vimentin蛋白表達變化

表6 SATB1 shRNA重組慢病毒感染后SW480細胞E-cadherin和Vimentin蛋白表達水平

3 討 論

本實驗結(jié)果說明敲減SATB1能夠抑制結(jié)腸癌體外生長和轉(zhuǎn)移潛能的作用，SATB1可能在結(jié)腸癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮促進作用，SATB1可能是一種癌基因。

SATB1能夠特異性識別核基質(zhì)結(jié)合區(qū)域的作用，參與細胞內(nèi)染色體高級結(jié)構(gòu)的修飾過程，對于多個基因的轉(zhuǎn)錄過程具有調(diào)控作用，在細胞分化、凋亡、增殖等過程中具有重要作用〔7〕。近幾年來的研究報道顯示，SATB1與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)，其在腫瘤患者中高表達與預(yù)后、分期、浸潤具有相關(guān)性〔8〕。在乳腺癌中的研究報道顯示，SATB1通過調(diào)控下游基因的表達參與腫瘤血管形成、細胞黏附、增殖等過程〔9〕。還有報道表明，SATB1在肺癌細胞系中表達水平異常升高，并證實了SATB1是一個與肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的調(diào)控因子，其可以通過激活下游信號增強肺癌轉(zhuǎn)移和惡性增殖能力〔3,10〕。在結(jié)腸癌中的研究表明，SATB1高表達與結(jié)直腸癌患者預(yù)后有關(guān)，SATB1在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用，SATB1具有抑制結(jié)直腸癌細胞生長、遷移的作用，并且SATB1在結(jié)直腸癌患者腫瘤組織的核和胞質(zhì)中的活性高于未改變的結(jié)直腸癌患者黏膜，SATB1調(diào)控機制尚不清楚〔11～13〕。本實驗在體外結(jié)腸癌細胞中證實了SATB1在體外結(jié)腸癌細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移、黏附、運動等生物學作用中的調(diào)控作用，更為全面的說明了SATB1在結(jié)腸癌惡性發(fā)生過程中與在其他腫瘤中作用相同，均可能發(fā)揮促進作用。

腫瘤細胞的惡性生物學特性與細胞內(nèi)的多種調(diào)控因子有關(guān)，細胞凋亡受到細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白如Caspase的調(diào)控作用。目前已知Caspase-3是凋亡反應(yīng)的下游因子，其被活化后形成Cleaved Caspase-3是細胞凋亡不可逆的標志，Caspase-9是凋亡反應(yīng)的起始因子，其活化后形成Cleaved Caspase-9可以誘導(dǎo)Caspase凋亡反應(yīng)發(fā)生〔14〕。在膀胱癌中發(fā)現(xiàn)SATB1基因沉默可以促進Caspase-3活化誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)生〔15〕。本實驗證實了下調(diào)SATB1具有誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達的作用，說明下調(diào)SATB1可能通過激活Caspase凋亡反應(yīng)誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)生。

腫瘤的轉(zhuǎn)移是威脅腫瘤患者生命健康的重要原因，腫瘤細胞侵襲和遷移過程與細胞中MMP有關(guān)，MMP-2、MMP-9是兩個與腫瘤侵襲能力正相關(guān)的MMP成員，其可以將細胞外基質(zhì)降解，促進腫瘤向遠端轉(zhuǎn)移〔16,17〕。在前列腺癌中已經(jīng)證實SATB1表達水平與MMP-2呈正相關(guān)，下調(diào)SATB1抑制促卵泡素誘導(dǎo)的卵巢癌細胞侵襲過程的同時下調(diào)MMP-2表達〔18,19〕。腫瘤轉(zhuǎn)移的早期標志是腫瘤細胞EMT，EMT是廣泛存在于人體組織中的生理過程，其與胚胎發(fā)育、器官生長等有關(guān)〔20〕。EMT發(fā)生時細胞上皮標志物E-cadherin表達水平下降，而間質(zhì)標志物Vimentin表達升高，E-cadherin和Vimentin表達變化是細胞EMT的標志〔21〕。本實驗在結(jié)腸癌中證實了下調(diào)SATB1可以降低細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達，抑制Vimentin表達并促進E-cadherin表達，說明下調(diào)SATB1可以抑制結(jié)腸癌細胞EMT和基質(zhì)金屬蛋白酶合成，這與其在腫瘤轉(zhuǎn)移中的研究報道相符合。

總之，下調(diào)SATB1具有抗結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)移潛能的作用，其作用機制與抗Caspase凋亡反應(yīng)及MMP表達有關(guān)，SATB1在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移和發(fā)展中可能發(fā)揮促進作用，靶向SATB1可能是治療結(jié)腸癌的有效途徑。目前對于SATB1的研究機制發(fā)現(xiàn)，SATB1是Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)的新靶點，SATB1高表達與β-連環(huán)蛋白異常表達，SATB1和β-連環(huán)蛋白與TCF7L2的啟動子和Wnt信號的下游靶點結(jié)合并調(diào)節(jié)它們的表達〔22,23〕。本實驗對于SATB1調(diào)控結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移機制尚未研究，以后實驗中會探討SATB1與β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在結(jié)直腸癌中的調(diào)控機制。