孫得勝 劉虹延 劉先勝 歐陽(yáng)瑤

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 1呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，貴州 遵義 563003；2針灸科；3華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 衛(wèi)生部呼吸系統(tǒng)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

肺動(dòng)脈高壓作為常見(jiàn)的肺血管疾病，以顯著的肺動(dòng)脈壓增高為主要特征，它也是多種慢性呼吸系統(tǒng)疾病的并發(fā)癥及多種疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。另外，它也是相關(guān)疾病患者病情加重和死亡的重要原因之一。作為常見(jiàn)的肺血管疾病，肺動(dòng)脈高壓的特點(diǎn)是肺動(dòng)脈及右心室收縮壓力增高，常常引起右心功能不全，預(yù)后很差〔1～5〕。 它往往存在著肺遠(yuǎn)端小血管的重塑，并因此引起血管阻力升高，常伴右心室肥大，甚至造成嚴(yán)重的右心力衰竭〔6,7〕。吸煙者容易發(fā)生肺動(dòng)脈高壓〔8〕，而且有研究顯示〔9～11〕，不少吸煙的慢性阻塞性肺疾病患者在患病初期，未發(fā)生明顯缺氧時(shí)已存在肺小血管重塑。從而說(shuō)明香煙煙霧能夠直接造成肺小血管重塑〔9〕。構(gòu)建有效的肺動(dòng)脈高壓疾病模型是深入研究肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制，并進(jìn)一步為臨床工作提供參考依據(jù)的前提。 在大鼠肺動(dòng)脈高壓模型實(shí)驗(yàn)中，通常采用低氧干預(yù)、野百合堿誘導(dǎo)及外科操作分流等方法。本研究以單純香煙煙霧刺激4個(gè)月的方法建立疾病模型，以右心導(dǎo)管的方法檢測(cè)大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、取肺組織制作病理切片來(lái)檢測(cè)肺血管重塑程度等方法，旨在研究和探討這一種方法制作肺動(dòng)脈高壓疾病模型的可行性，為今后深入探討肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制提供研究平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD雄性大鼠(共20只)，鼠齡8 w，體重200～220 g，從武漢同濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買。造模、測(cè)壓及取材等操作在武漢同濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心內(nèi)進(jìn)行。

1.2主要儀器與試劑 香煙煙霧暴露染毒系統(tǒng)(自主研發(fā)，專利號(hào)ZL201820234399.3)；PowerLab 生物數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)(ADInstruments公司)；石蠟切片機(jī)(MEDITE公司)；4℃低溫冰箱(中國(guó)海爾公司)；Motic image圖像系統(tǒng)(麥克奧迪有限公司)；香煙(煙堿量0.6 mg、焦油含量9 mg、一氧化碳量11 mg 湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司)；多聚甲醛(塞維爾公司)；蘇木素染液(塞維爾公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，拜意爾生物公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1模型的建立 把大鼠用隨機(jī)數(shù)字表法分為：對(duì)照組(n=9)和肺動(dòng)脈高壓模型(模型)組(n=11)。肺動(dòng)脈高壓模型組大鼠在染毒箱〔12〕內(nèi)接受香煙煙霧暴露，每天2次，連續(xù)造模4個(gè)月。監(jiān)測(cè)染毒箱里面的氧氣濃度，控制箱內(nèi)氧氣濃度在18%～21%。同時(shí)，使染毒箱里面的一氧化碳濃度維持在900 ppm左右。滿4個(gè)月時(shí)檢測(cè)右心室收縮壓，然后取肺組織并進(jìn)一步制作病理切片，檢測(cè)肺血管重塑程度。

1.3.2檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo) 參考相關(guān)文獻(xiàn)的方法進(jìn)行〔13，14〕。常規(guī)麻醉大鼠后，行氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)機(jī)械通氣。設(shè)置好潮氣量、呼吸頻率等參數(shù)后，剪開(kāi)大鼠體表皮膚及皮下組織后，以右心導(dǎo)管測(cè)壓，待示波波形穩(wěn)定后，由PowerLab 軟件分析。

1.3.3計(jì)算右心室肥厚指數(shù) 將大鼠心室中的血液放盡后，將心臟分離為右心室、左心室+室間隔兩部分，在干燥程度基本一致的條件下稱量，并計(jì)算心室肥厚指數(shù)。比較兩組間的右心室重量的差異。

1.3.4肺組織標(biāo)本留取及檢測(cè) 將大鼠的右肺上葉以多聚甲醛固定，并進(jìn)一步制作石蠟切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色以中膜厚度的差異比較兩組大鼠的肺血管重塑程度。所有獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 與對(duì)照組相比，模型組大鼠活動(dòng)減少，毛發(fā)較為枯黃。造模過(guò)程中，模型組死亡3只，對(duì)照組有1只大鼠肺組織切片見(jiàn)嚴(yán)重肺炎征象，因此未納入分析。

2.2右室收縮壓 與對(duì)照組相比，模型組右心室收縮壓顯著增高。參考國(guó)際上的研究共識(shí)〔1,5,15〕，可認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)中肺動(dòng)脈高壓模型成立。見(jiàn)圖1、表1。

圖1 右室收縮壓波形圖

表1 兩組各指標(biāo)比較

2.3右心室肥厚程度 模型組大鼠的右心室重量、右心室重量/體重和右心室肥厚指數(shù)，均比對(duì)照組明顯升高，提示模型組大鼠的右心室肥厚程度明顯加重。見(jiàn)表1。

2.4肺血管重塑的觀察 將HE切片放大200倍，觀察那些直徑在50～150 μm的血管。以中膜厚度比作為衡量指標(biāo)，模型組肺血管管壁的厚度顯著增加。見(jiàn)表1、圖2。

圖2 肺血管重構(gòu)水平(HE，×200)

3 討 論

肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，它分為五大類，不同類的肺動(dòng)脈高壓在病因和診療方法也有許多差異。在肺動(dòng)脈高壓的研究領(lǐng)域，目前常用的動(dòng)物造模方法主要有野百合堿誘導(dǎo)、缺氧誘導(dǎo)(聯(lián)合或不聯(lián)合SU5416)、手術(shù)分流等方法〔15～19〕。隨著煙草相關(guān)疾病越來(lái)越受到關(guān)注，香煙煙霧能否直接引起肺動(dòng)脈高壓成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)〔9,20〕

既往研究多注意到長(zhǎng)期吸煙者存在慢性缺氧，而缺氧可引起肺血管收縮和肺血管重構(gòu)，從而認(rèn)為此情況下肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生是繼發(fā)或伴發(fā)于慢性阻塞性肺疾病〔21〕。然而，不少研究發(fā)現(xiàn)，香煙煙霧的刺激功能能夠在不缺氧時(shí)，直接造成肺血管的重構(gòu)，繼而參與疾病的發(fā)生和發(fā)展〔9～11〕。

在本研究中使染毒箱氧氣濃度維持在18%～21%，和空氣中的氧濃度接近，因此可排除環(huán)境缺氧這一因素對(duì)本模型的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)單純的香煙煙霧作用4個(gè)月后，大鼠的右心室收縮壓明顯升高，右心室收縮壓在科研中常用來(lái)反映肺動(dòng)脈收縮壓，故表明該模型順利造成。肺動(dòng)脈高壓組的右心室肥厚程度顯著加重，肺血管重塑水平也明顯增加，提示以香煙煙霧刺激的方法建立的肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型中，肺動(dòng)脈高壓的形成可能與肺血管重塑及右心室肥厚有關(guān)，具體的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。