王曉楠 徐茜 張勵(lì) 楊旸 胡雪君

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，遼寧 沈陽 110001)

低血糖是糖尿病患者胰島素治療的潛在并發(fā)癥。重度低血糖可導(dǎo)致明顯的神經(jīng)元死亡和認(rèn)知障礙〔1〕。目前臨床對(duì)于重度低血糖的治療是立即靜脈輸注葡萄糖以迅速升高血糖水平。但有研究發(fā)現(xiàn)，低血糖所致腦損害不但與低血糖本身有關(guān)，還與低血糖后葡萄糖再灌注相關(guān)，而且低血糖后葡萄糖再灌注治療會(huì)誘導(dǎo)活性氧(ROS)產(chǎn)生增加，ROS的產(chǎn)生導(dǎo)致多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)-1活化，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸/三磷酸腺苷(NAD/ATP)耗盡，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，進(jìn)一步加重低血糖性腦損害〔2,3〕。煙酰胺單核苷酸(NMN)是一種NAD+的前體物質(zhì)。NMN不僅可以增加細(xì)胞內(nèi)NAD+水平，還可以降低腦組織內(nèi)ROS的產(chǎn)生〔4〕。本研究觀測(cè)NMN對(duì)低血糖后葡萄糖再灌注大鼠模型認(rèn)知功能的影響，并探討其可能的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料 SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重250～350 g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。NMN購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；生物合成人胰島素(諾和靈R)購(gòu)自丹麥諾和諾德公司；血糖儀(拜安康)購(gòu)自德國(guó)拜耳公司；2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(H2DCF-DA)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組及用藥方法 實(shí)驗(yàn)大鼠以3.6%水合氯醛腹腔注射(1 ml/100 g體重)麻醉后，行頸部靜脈插管術(shù)，術(shù)后觀察24 h，正常飼水食。經(jīng)過3 d的術(shù)后恢復(fù)，將30只反應(yīng)正常的大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、低血糖后葡萄糖再灌注組(GR)、和低血糖后葡萄糖再灌注并給予NMN治療(GR+NMN)組，每組10只。Sham組：經(jīng)頸靜脈泵入胰島素(1.5 U/h)的同時(shí)泵入25%葡萄糖，使血糖水平維持在5～8 mmol/L,維持5 h。GR組：經(jīng)頸靜脈泵入胰島素(1 U/h)誘導(dǎo)低血糖，當(dāng)血糖低于1 mmol/L時(shí)，將血糖水平維持在1 mmol/L左右1 h；隨后給予25%葡萄糖(2.0 ml/h)使血糖水平快速升至5～8 mmol/L，維持3 h。GR+NMN組：經(jīng)頸靜脈泵入胰島素(1 U/h)誘導(dǎo)低血糖，當(dāng)血糖低于1 mmol/L時(shí)，將血糖水平維持在1 mmol/L左右1 h；隨后給予腹膜注射NMN 500 mg/kg，同時(shí)再給予25%葡萄糖(2.0 ml/h)使血糖水平快速升至5～8 mmol/L，維持3 h。造模后1 d大鼠完全清醒后，GR+NMN組給予干預(yù)治療，每天腹膜注射NMN 500 mg/kg，Sham組及GR組腹膜注射等滲NaCl注射液(104.5 mg/kg)，連續(xù)注射1 w。

1.2.2各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)藥物干預(yù)1 w后，參照參考文獻(xiàn)對(duì)各組實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶能力〔5〕。其中定位航行實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5 d，每天4次，每次間隔20 min，主要記錄實(shí)際逃避潛伏期。第5天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄原平臺(tái)象限活動(dòng)時(shí)間及120 s內(nèi)穿越原平臺(tái)的次數(shù)。每次均3組平行進(jìn)行。

1.2.3組織標(biāo)本采集 各組實(shí)驗(yàn)大鼠在最后一次進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)后取材。大鼠用3.6%水合氯醛腹腔注射(1 ml/100 g體重)麻醉后，斷頭處死，迅速取出完整海馬組織，置于液氮中速凍，后移至-80℃冰箱凍存以備檢測(cè)。

1.2.4海馬組織內(nèi)NAD+水平的測(cè)定 將凍存的海馬組織置于室溫下解凍，用75%乙醇-0.05 mol/L K2HPO4溶液將海馬組織搗碎溶解，使NAD+在乙醇脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)換成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，13 000 r/min 14℃離心15 min,取上清液，在400～600 nm的分光光度計(jì)下測(cè)定的NADH熒光值〔5〕。

1.2.5海馬組織內(nèi)ROS聚集水平的測(cè)定 H2DCF-DA來檢測(cè)海馬組織內(nèi)ROS聚集情況。將凍存的海馬組織置于室溫下解凍，將解凍后海馬組織放置于切片機(jī)的載物臺(tái)上，以400 μm厚度進(jìn)行切片，并將其置于1個(gè)微孔的膜插件內(nèi)，再將膜插件置于盛有H2DCF-DA(10 μmol/L)的海馬組織培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，37℃、5% CO2培養(yǎng)(培養(yǎng)液組成：50%MEM，25%Hank平衡鹽溶液，25%無活性馬血清，1%谷氨酸，6.5 mg/L D-葡萄糖，1%青霉素-鏈霉素)30 min后，用PBS沖洗兩次，用5 mmol/L Tris HCl將海馬組織切片搗碎溶解，13 000 r/min 14℃離心15 min,取上清液，在485～535 nm的分光光度計(jì)下測(cè)定DCF的熒光值〔5〕。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析，Scheffe法。

2 結(jié) 果

2.1各組學(xué)習(xí)記憶能力比較 與Sham組比較，GR組逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)，原平臺(tái)象限活動(dòng)時(shí)間顯著降低，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(均P<0.05)。與GR組比較，GR+NMN組逃避潛伏期均顯著縮短，原平臺(tái)象限活動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增多(均P<0.05)。見表1，表2。

表1 各組定位航行實(shí)驗(yàn)中每日平均逃避潛伏期

2.2海馬組織內(nèi)NAD+水平比較 與Sham組比較，GR組大鼠海馬組織內(nèi)NAD+水平顯著降低(P<0.05)，而GR+NMN組NAD+水平未見明顯變化(P>0.05)。與GR組比較，GR+NMN組大鼠海馬組織內(nèi)NAD+水平顯著升高(P<0.05)。見表3。

2.3海馬組織內(nèi)ROS的聚集情況比較 與Sham組比較，GR組大鼠海馬組織內(nèi)ROS的水平顯著升高(P<0.05)，而GR+NMN組大鼠海馬組織內(nèi)ROS的水平未見明顯變化(P>0.05)。與GR組比較，GR+NMN組大鼠海馬組織內(nèi)ROS的水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

表2 各組空間探索試驗(yàn)結(jié)果

表3 各組大鼠海馬組織內(nèi)NAD+及ROS水平

3 討 論

嚴(yán)重的低血糖會(huì)引起海馬組織損傷，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡和認(rèn)知障礙〔1，6〕。低血糖引起的神經(jīng)元死亡并不是能量衰竭的直接結(jié)果，而是由多種因素共同作用的結(jié)果，其中氧化應(yīng)激和多聚磷酸腺苷二核糖聚合酶(PARP)-1活化具有關(guān)鍵性的作用〔7,8〕。在臨床中，一旦發(fā)生嚴(yán)重的低血糖，首選的關(guān)鍵治療方法是立即補(bǔ)充葡萄糖快速提高血糖水平，這對(duì)于避免腦損傷是至關(guān)重要的。但研究發(fā)現(xiàn)，低血糖后葡萄糖再灌注可致繼發(fā)性損傷，從而導(dǎo)致更嚴(yán)重的神經(jīng)元死亡〔3〕。葡萄糖再灌注損傷與ROS的集聚〔3〕、炎癥相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活〔9〕及鋅離子的釋放〔10〕相關(guān)。雖然低血糖和葡萄糖再灌注都會(huì)導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生，但ROS的產(chǎn)生主要發(fā)生在葡萄糖再灌注期間，而不是低血糖本身〔3〕。ROS的產(chǎn)生可誘導(dǎo)DNA損傷及PARP-1活化，而PARP-1活化會(huì)使NAD/ATP耗盡，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。

NAD+是維持細(xì)胞功能和能量代謝所必需的物質(zhì)。越來越多的研究證明NAD+可能在大腦的代謝過程中發(fā)揮重要作用，并對(duì)神經(jīng)傳遞、學(xué)習(xí)和記憶等大腦的功能產(chǎn)生影響〔11,12〕。NMN是一種NAD+的前體物質(zhì)。雖然目前尚不清楚NMN是否能通過血腦屏障，但NMN腹腔內(nèi)給藥可以迅速(15 min內(nèi))增加腦內(nèi)海馬組織和下丘腦內(nèi)的NAD+水平〔13,14〕，這說明NMN可以通過血腦屏障，并誘導(dǎo)腦組織中NAD+的生物合成。另外NMN還可以通過直接抑制ROS的產(chǎn)生而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用〔4〕。

本研究說明NMN有效地改善了低血糖后葡萄糖再灌注大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。綜上所述，NMN可能通過維持海馬組織內(nèi)NAD+的水平及抗氧化應(yīng)激的作用，來拮抗低血糖后葡萄糖再灌注誘導(dǎo)的腦損害，從而改善學(xué)習(xí)記憶能力。本研究為未來臨床防治低血糖后葡萄糖再灌注所致的認(rèn)知障礙可能提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。