彭秀華 柳明杰

(1錦州市中心醫(yī)院神經內科，遼寧 錦州 121000；2錦州醫(yī)科大學)

帕金森病(PD)是臨床常見神經退行性疾病，常發(fā)生于老年人群，其主要病理特征為基底神經節(jié)中腦黑質致密部多巴胺能神經元的退化及進行性缺失，調查研究顯示PD發(fā)病率逐年增加，嚴重影響患者生活質量〔1〕。既往研究顯示線粒體功能障礙、炎癥、氧化應激、細胞凋亡與PD發(fā)生發(fā)展密切相關〔2〕。微小RNA(miRNA)可通過調控靶基因表達而參與人類多種疾病發(fā)生發(fā)展過程，研究表明miRNA在PD患者異常表達并可調控神經元細胞凋亡、自噬及分化等過程〔3〕。目前PD發(fā)病機制尚未完全闡明，因而探究PD發(fā)病機制及尋找治療靶點具有重要意義。研究表明miR-486-5p在缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷中下調表達，miR-486-5p過表達對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷具有保護作用〔4〕。研究表明miR-486-5p在脂多糖(LPS)誘導的髓核細胞中表達水平降低，miR-486-5p過表達可抑制炎癥因子的表達〔5〕。但miR-486-5p在PD模型細胞中的表達及其對PD模型細胞自噬、凋亡的影響尚未可知。Targetscan預測顯示瞬時受體電位(TRP)M2可能是miR-486-5p的靶基因，研究表明PD患者與1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)誘導的SH-SY5Y細胞中TRPM2的表達水平升高，并可促進MPP+誘導的神經細胞凋亡〔6〕。相關報道指出下調TRPM2的表達可保護缺血性大鼠腦損傷〔7〕。但miR-486-5p是否通過靶向調控TRPM2的表達影響PD模型細胞自噬、凋亡尚未可知。本研究主要探討PD細胞模型中miR-486-5p的表達水平變化，分析其對PD細胞模型自噬及凋亡的影響，初步探究miR-486-5p對TRPM2的調控作用，為揭示PD發(fā)病機制提供新方向。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 MPP+購自北京謹明生物科技有限公司；人SH-SY5Y神經母細胞瘤細胞購自美國ATCC細胞庫。RPMI1640培養(yǎng)基購自上海浩然生物技術有限公司；胰蛋白酶與胎牛血清購自上海玉博生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液購自美國Sigma公司；Trizol與Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒與熒光定量PCR試劑盒均購自北京天根生化科技公司；膜聯蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物公司；miR-486-5p模擬物(mimics)及陰性對照 mimic NC 序列(miR-NC)、TRPM2小干擾RNA(si-TRPM2)及亂序無意義陰性序列(si-NC)購自廣州銳博生物科技有限公司；兔抗人微管相關蛋白輕鏈(LC)3Ⅱ、LC3Ⅰ抗體購自美國CST公司；兔抗人線粒體融合蛋白(Mfn)2多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗人核呼吸因子(NRF)1多克隆抗體購自武漢菲恩生物科技有限公司；兔抗人TRPM2抗體購自武漢艾美捷科技有限公司；兔抗人B淋巴細胞瘤(Bcl)-2、B淋巴細胞瘤-2相關蛋白(Bax)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cleaved-caspase)3抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗購自美國BIOWORLD公司；雙熒光素酶報告基因載體購自南京中洪博元生物科技有限公司；熒光素酶活性檢測試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1構建PD模型 SK-N-SH細胞置于RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，待細胞生長融合度達到80%～90%時，用100 μmol/L的MPP+誘導SK-N-SH細胞24 h，建立PD細胞模型〔8〕。

1.2.2實驗處理及分組 實驗設置Con組(未經MPP+誘導的SK-N-SH細胞)、MPP+組(100 μmol/L的MPP+誘導SK-N-SH細胞24 h)，檢測兩組SK-N-SH細胞中miR-486-5p、TRPM2的表達水平。為探究miR-486-5p表達變化對MPP+誘導的SK-N-SH細胞自噬及凋亡的影響，實驗設置MPP++miR-NC組(miR-NC轉染至SK-N-SH細胞48 h，用含有100 μmol/L MPP+的培養(yǎng)液處理細胞24 h)、MPP++miR-486-5p組(miR-486-5p mimics轉染至SK-N-SH細胞48 h，用含有100 μmol/L MPP+的培養(yǎng)液處理細胞24 h)。為探究TRPM2表達變化對MPP+誘導的SK-N-SH細胞自噬及凋亡的影響，實驗設置MPP++si-NC組(si-NC轉染至SK-N-SH細胞48 h，用含有100 μmol/L MPP+的培養(yǎng)液處理細胞24 h)、MPP++si-TRPM2組(si-TRPM2轉染至SK-N-SH細胞48 h，用含有100 μmol/L MPP+的培養(yǎng)液處理細胞24 h)。為探究miR-486-5p是否調控TRPM2的表達，實驗設置miR-NC組(miR-NC轉染至SK-N-SH細胞48 h)、miR-486-5p組(miR-486-5p mimics轉染至SK-N-SH細胞48 h)、anti-miR-NC組(anti-miR-NC轉染至SK-N-SH細胞48 h)、anti-miR-486-5p組(anti-miR-486-5p轉染至SK-N-SH細胞48 h)，采用Western印跡法檢測各組細胞中TRPM2蛋白表達。后續(xù)實驗設置MPP++miR-486-5p+pcDNA組(miR-486-5p mimics與pcDNA共轉染至SK-N-SH細胞48 h，用含有100 μmol/L MPP+的培養(yǎng)液處理細胞24 h)、MPP++miR-486-5p+pcDNA-TRPM2組(miR-486-5p mimics與pcDNA-TRPM2共轉染至SK-N-SH細胞48 h，用含有100 μmol/L MPP+的培養(yǎng)液處理細胞24 h)，細胞轉染時嚴格按照Lipofectamine2000試劑說明書進行操作。

1.2.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測細胞中miR-486-5p、TRPM2 mRNA表達水平 采用Trizol法提取SK-N-SH細胞總RNA，利用Nanodrop2000c超微量分光光度計測定RNA濃度，按照逆轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，miR-486-5p正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物為：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；U6正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物為：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；TRPM2正向引物為5′-AAGTACGTCCGAGTCTCCCA-3′，反向引物為：5′-CGGAAAATGCTCTTCAGCCG-3′；GAPDH正向引物為5′-CTGAAGAGCTGCTTCACCAA-3′，反向引物為：5′-ATGGTGCTGTCCTTGACAAC-3′，引物均由上海生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR反應體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各0.8 μl，ROX Reference Dye(50×)0.4 μl，ddH2O 6 μl；反應條件：95 ℃預變性2 min循環(huán)1次，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)40次。置于ABI 7500實時熒光定量PCR儀檢測，采用2-ΔΔCt法計算miR-486-5p、TRPM2 mRNA的相對表達量。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組SK-N-SH細胞，0.25%胰酶消化，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗細胞3次，每次5 min，加入500 μl結合緩沖液懸浮細胞，室溫條件下加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI，充分混勻，于1 h內置于流式細胞儀檢測并計算細胞凋亡率。

1.2.5熒光素酶報告基因檢測miR-486-5p的靶基因 TargetScan預測顯示TRPM2的3′UTR區(qū)存在miR-486-5p的持續(xù)性結合位點，利用基因突變技術將集合位點進行突變，分別將結合位點與突變位點分別載入熒光素酶報告基因載體構建野生型載體WT-TRPM2與突變型載體MUT-TRPM2，取對數生長期SK-N-SH細胞，實驗設置4組：WT-TRPM2+miR-NC共轉染組、WT-TRPM2+miR-486-5p mimics共轉染組、MUT-TRPM2+miR-NC共轉染組、MUT-TRPM2+miR-486-5p mimics共轉染組，各組細胞轉染48 h，收集細胞，參照熒光素酶活性檢測試劑盒測定各組相對熒光素酶活性。

1.2.6Western印跡檢測Mfn2、NRF1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3、TRPM2蛋白表達 收集各組SK-N-SH細胞，預冷PBS洗滌細胞3次，每次5 min，加入RIPA裂解液裂解完全，收集上清液(細胞總蛋白)，采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，分離的蛋白凝膠轉移至PVDF膜，室溫條件下用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗(1∶1 000)，4℃搖床內孵育24 h，室溫條件下加入二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h，滴加增強型化學發(fā)光試劑(ECL)顯影，定影，應用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計學處理 應用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1miR-486-5p和TRPM2在MPP+誘導SK-N-SH細胞損傷中的表達 與Con組相比，MPP+組SK-N-SH細胞中miR-486-5p的表達水平顯著降低(P<0.05)，TRPM2 mRNA及蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 TRPM2蛋白表達

表1 miR-486-5p和TRPM2在MPP+誘導SK-N-SH細胞損傷中的表達

2.2miR-486-5p過表達對MPP+誘導SK-N-SH細胞中線粒體相關蛋白和自噬相關蛋白表達的影響 MPP++miR-486-5p組SK-N-SH細胞中miR-486-5p的表達水平顯著高于MPP++miR-NC組(P<0.05)，提示成功上調MPP+誘導SK-N-SH細胞中miR-486-5p的表達。Western印跡檢測結果顯示，與Con組相比，MPP+組SK-N-SH細胞中Mfn2、NRF1蛋白表達量均顯著降低(P<0.05)，LC3Ⅱ蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，而LC3Ⅰ蛋白表達量無明顯變化；相較于MPP++miR-NC組，MPP++miR-486-5p組SK-N-SH細胞中Mfn2、NRF1蛋白表達量均顯著升高(P<0.05)，LC3Ⅱ蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，而LC3Ⅰ蛋白表達量無明顯變化，見圖2、表2。

1～4：Con組、MPP+組、MMP++miR-NC組、MPP++miR-486-5p組；圖3同

表2 miR-486-5p過表達對MPP+誘導SK-N-SH細胞中線粒體相關蛋白和自噬相關蛋白表達的影響

2.3miR-486-5p過表達對MPP+誘導SK-N-SH細胞凋亡的影響 與Con組比較，MPP+組SK-N-SH細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Bax、cleaved-caspase3蛋白表達量均顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達量顯著降低(P<0.05)；相對于MPP++miR-NC組，MPP++miR-486-5p組SK-N-SH細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Bax、cleaved-caspase3蛋白表達量均顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，見表3、圖3、圖4。

表3 miR-486-5p過表達對MPP+誘導SK-N-SH細胞凋亡的影響

2.4干擾TRPM2表達對MPP+誘導SK-N-SH細胞中線粒體相關蛋白和自噬相關蛋白表達的影響 MPP++si-TRPM2組SK-N-SH細胞中TRPM2蛋白表達量較MPP++si-NC組顯著降低(P<0.05)，提示成功降低MPP+誘導SK-N-SH細胞中TRPM2的高表達。相較于MPP++si-NC組，MPP++si-TRPM2組SK-N-SH細胞中Mfn2、NRF1蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，LC3Ⅱ蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，LC3Ⅰ蛋白表達量變化無統(tǒng)計學意義，見表4、圖5。

圖3 Western印跡檢測Bcl-2、Bax、cleaved-caspese3蛋白表達

圖4 miR-486-5p過表達對MPP+誘導SK-N-SH細胞凋亡的影響

表4 干擾TRPM2表達對MPP+誘導SK-N-SH細胞中線粒體相關蛋白和自噬相關蛋白表達的影響

1～4:Con組、MPP+組、MPP++si-NC組、MPP++si-TRPM2組；圖6同

2.5干擾TRPM2表達對MPP+誘導SK-N-SH細胞凋亡的影響 與MPP++si-NC組相比，MPP++si-TRPM2組SK-N-SH細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Bax、cleaved-caspase3蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，見圖6、表5。

圖6 TRPM2和凋亡相關蛋白表達

2.6miR-486-5p靶向調控TRPM2的表達 Targetscan預測顯示TRPM2的3′UTR中含有與miR-486-5p互補的核苷酸序列，見圖7。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，與WT-TRPM2 miR-NC組相比，(WT-TRPM2)miR-486-5p組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；與MUT-TRPM2 miR-NC組相比，(MUT-TRPM2)miR-486-5p組熒光素酶活性變化無統(tǒng)計學意義，見表6。Western印跡檢測結果顯示，與miR-NC組(0.41±0.04)比較，miR-486-5p組SK-N-SH細胞中TRPM2蛋白表達量顯著降低(0.22±0.02，P<0.05)；與anti-miR-NC組(0.39±0.04)比較，anti-miR-486-5p組SK-N-SH細胞中TRPM2蛋白表達量顯著升高(0.85±0.08，P<0.05)，見圖8。表明miR-486-5p可靶向調控TRPM2的表達。

2.7TRPM2過表達逆轉了miR-486-5p過表達對MPP+誘導SK-N-SH細胞中線粒體相關蛋白、自噬相關蛋白的表達和細胞凋亡的作用 相對于MPP++miR-486-5p+pcDNA組，MPP++miR-486-5p+pcDNA-TRPM2組SK-N-SH細胞中Mfn2、NRF1蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，LC3Ⅱ蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，LC3Ⅰ蛋白表達量變化無統(tǒng)計學意義，SK-N-SH細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Bax、cleaved-caspase3蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，見圖9、表7。

表5 干擾TRPM2表達對MPP+誘導SK-N-SH細胞凋亡的影響

圖7 TRPM2的3′UTR中含有與miR-486-5p互補的核苷酸序列

表6 雙熒光素酶報告實驗

1～4：miR-NC組、miR-486-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-486-5p組

1～4：MPP+ miR-NC組、MPP+ miR-486-5p組、MPP+ miR-486-5p+pcDNA組、MPP+ miR-486-5p+pcDNA-TRPM2組

表7 TRPM2過表達逆轉了miR-486-5p過表達對MPP+誘導SK-N-SH細胞中線粒體相關蛋白、自噬相關蛋白的表達和細胞凋亡的作用

3 討 論

miRNA在PD患者腦組織中異常表達，并可在神經系統(tǒng)疾病發(fā)生過程中發(fā)揮重要調控作用，研究表明神經元細胞凋亡、自噬與PD發(fā)生發(fā)展密切相關，miRNA可通過調控神經元細胞凋亡與自噬從而參與PD發(fā)生發(fā)展過程〔9，10〕。既往研究報道顯示用MPP+誘導SK-N-SH細胞建立PD模型〔11〕。本研究通過MPP+誘導SK-N-SH細胞建立PD細胞模型，探尋新型miRNA的表達變化及其在PD發(fā)展進程中的作用機制。

miR-486-5p在膝骨關節(jié)炎患者中呈低表達，其表達量與膝骨關節(jié)炎嚴重程度密切相關〔12〕。相關報道指出miR-486-5p通過靶向Smad2抑制TGF-β2誘導的晶狀體上皮細胞增殖、侵襲〔13〕。但miR-486-5p在PD發(fā)展過程中的作用機制尚未可知。本研究結果顯示，MPP+誘導SK-N-SH細胞中miR-486-5p的表達水平顯著降低，提示miR-486-5p表達下調可能參與PD發(fā)生過程。NRF1作為轉錄因子，可參與線粒體生物合成及呼吸鏈的電子傳遞過程，抑制NRF1表達可促進氧化應激反應的發(fā)生進而促進細胞凋亡，Mfn2是一種線粒體融合基因，研究報道指出Mfn2過表達可保護線粒體免受損傷從而保護神經元細胞〔14，15〕。本研究結果顯示MPP+誘導SK-N-SH細胞中Mfn2、NRF1蛋白表達量顯著下降，而miR-486-5p過表達可明顯提高Mfn2、NRF1蛋白表達量，提示miR-486-5p過表達可降低MPP+誘導的SK-N-SH細胞自噬水平。研究表明LC3屬于自噬相關蛋白，其中LC3Ⅱ是LC3Ⅰ的裂解形式，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高表示自噬活躍，檢測LC3Ⅱ水平可反映自噬的強弱〔16〕。本研究結果顯示MPP+誘導的SK-N-SH細胞中LC3Ⅱ蛋白表達量顯著升高，說明MPP+可提高SK-N-SH細胞自噬活性，進一步研究發(fā)現miR-486-5p過表達可明顯降低LC3Ⅱ蛋白表達量，提示miR-486-5p過表達對PD細胞模型的自噬活性具有明顯的抑制作用。本研究通過流式細胞術發(fā)現，MPP+誘導的SK-N-SH細胞凋亡率顯著升高，但miR-486-5p過表達可明顯降低MPP+造成的高凋亡率，提示miR-486-5p過表達對PD細胞模型的凋亡具有明顯的抑制作用。研究報道指出Bcl-2蛋白屬于抗凋亡蛋白，Bax屬于促凋亡蛋白，細胞接收凋亡信號時，Bax可促使線粒體凋亡因子釋放激活caspase3形成cleaved-caspase3進而促進細胞凋亡〔17〕。本研究進一步檢測發(fā)現MPP+誘導的SK-N-SH細胞中Bcl-2蛋白表達降低，Bax、cleaved-caspase3蛋白表達升高，說明SK-N-SH細胞發(fā)生自噬的同時出現細胞凋亡，但miR-486-5p過表達后SK-N-SH細胞中Bcl-2蛋白表達升高，Bax、cleaved-caspase3蛋白表達降低，提示miR-486-5p過表達可通過上調Bcl-2的表達及下調Bax、cleaved-caspase3的表達從而抑制MPP+誘導的SK-N-SH細胞凋亡。但線粒體自噬與凋亡在PD發(fā)生過程中的相關性及其可能的作用機制仍需進一步研究。

TRPM2屬于細胞膜上的非選擇性陽離子通道，研究表明TRPM2在腦組織中呈高表達，并可調控氧化應激、炎癥反應進而參與多種中樞神經系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程〔18〕。研究報道指出丁基苯酚可能通過下調TRPM2的表達，抑制神經細胞損傷從而對慢性缺血性腦組織神經發(fā)揮保護作用〔19〕。本研究結果顯示MPP+誘導SK-N-SH細胞中TRPM2的表達水平顯著升高，干擾TRPM2的表達可抑制SK-N-SH細胞凋亡，提高Mfn2、NRF1的表達水平，降低LC3Ⅱ的表達水平，提示干擾TRPM2的表達可降低MPP+誘導的SK-N-SH細胞自噬活性。進一步研究顯示干擾TRPM2的表達可降低SK-N-SH細胞凋亡率，抑制Bax、cleaved-caspase3的表達，促進Bcl-2的表達，提示干擾TRPM2的表達可通過調控細胞凋亡相關蛋白表達而抑制PD模型細胞的凋亡。本研究通過雙熒光素酶報告實驗與Western印跡實驗證實miR-486-5p可靶向調控TRPM2的表達，進一步實驗結果顯示TRPM2過表達可逆轉了miR-486-5p過表達對MPP+誘導的SK-N-SH細胞線粒體相關蛋白、自噬相關蛋白的表達及細胞凋亡的作用。提示miR-486-5p過表達可通過下調靶基因TRPM2的表達從而抑制MPP+誘導的SK-N-SH細胞凋亡及自噬。

綜上所述，miR-486-5p在PD細胞模型中表達下調，而TRPM2表達上調，miR-486-5p過表達可通過抑制TRPM2的表達而抑制細胞凋亡及自噬從而保護神經細胞，可為PD的基因治療提供新方向。但本研究僅在體外驗證miR-486-5p過表達與PD模型細胞自噬、凋亡的關系，關于其在體內是否具有相同的作用機制仍需進一步研究。