李軍鴿 董雪蓮 董金香 邱智東 賈艾玲

(長春中醫(yī)藥大學，吉林 長春 130117)

口腔潰瘍是發(fā)生在口腔黏膜上的淺表潰瘍，黃豆粒大小，成圓形或橢圓形黏膜損傷〔1～3〕，在中醫(yī)學范疇屬于“口瘡”〔4,5〕，是一種口腔黏膜疾病，在臨床上比較常見，中老年人口腔潰瘍發(fā)病率要比青年和兒童的發(fā)病率高，且反復發(fā)病，情況比較頻繁，原因之一可能與老年人機體免疫力下降，免疫細胞應答機制減弱有關〔6〕，如果不給予及時治療，可能會導致嚴重口腔疾病，危及整個口腔，嚴重影響患者的進食和說話〔7,8〕。早在1953年就有研究者用蜂膠治療復發(fā)性口瘡，蜂膠這一天然藥物對治療口腔疾病有著獨特的優(yōu)勢〔9,10〕。課題組結(jié)合超分子化學自組裝原理以核黃素為小分子凝膠因子，制備了一種蜂膠小分子凝膠〔11〕，將其應用于老年大鼠口腔潰瘍模型〔12〕，觀察蜂膠小分子凝膠治療口腔潰瘍的效果，探討其治療機制，為治療口腔潰瘍新制劑開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物及材料 清潔級Wistar大鼠(鼠齡為12個月)80只，雄性，體重280～350 g，購于吉林大學實驗動物中心，SCXK(吉)2016-0005。將購買后的大鼠飼養(yǎng)1 w，房間溫度20～25℃，相對濕度45%～65%，正常飲食，晝夜規(guī)律〔13〕。

蜂膠小分子凝膠、蜂膠提取物微粉(長春中醫(yī)藥大學中藥藥劑實驗室制備)。水合氯醛(天津市光復精細化工研究所)。冰醋酸(天津新通精細化工有限公司)。蜂膠口腔膜(華潤紫竹藥業(yè)有限公司)。腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-2、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒(Ek-Bioscience)。

1.2模型的制備 將50只老年大鼠分別稱重后10%水合氯醛麻醉(3 ml/kg)，取一小塊脫脂棉球置于直徑為3 mm的塑料管上，塑料管一端邊緣與脫脂棉球?qū)R，然后將玻璃管和棉球端放在40%冰醋酸溶液中，待脫脂棉球被40%冰醋酸溶液浸透后，置于大鼠右頰黏膜上燒灼30 s，24 h后觀察〔14～17〕。

1.3動物分組及給藥 將口腔潰瘍模型的老年大鼠，隨機分為5組，每組10只。模型組(A組)不給藥；膜劑組(B組)貼市售紫竹藥業(yè)蜂膠口腔膜，每天1次，每次半貼；蜂膠提取物微粉組(C組)給予蜂膠提取物微粉，每天1次，每次1 mg；基質(zhì)組(D組)給予不載蜂膠提取物微粉的小分子凝膠基質(zhì)，每天1次，每次半支；蜂膠小分子凝膠組(E組)給予蜂膠小分子凝膠，每天1次，每次半支(半支蜂膠小分子凝膠中含蜂膠提取物微粉1 mg)。

給藥方式為麻醉后涂抹于老年大鼠口腔潰瘍面，要求均勻涂布，涂布過程均采用無菌棉簽蘸取涂布，此過程不超過1 min。麻醉時間設計1 h，各組大鼠于麻醉蘇醒后均可正常進食。

1.4檢測指標

1.4.1測量潰瘍直徑，觀察愈合情況 于每次給藥后次日給藥前用電子游標卡尺測量潰瘍直徑，觀察潰瘍愈合情況，肉眼看不見潰瘍面即為愈合。

1.4.2記錄體重的變化 于每次給藥后次日給藥前，記錄每日大鼠的體重，比較治療過程中各組大鼠的體重。

1.4.3記錄治療天數(shù)，計算潰瘍愈合時間 各組大鼠持續(xù)治療，直至潰瘍完全愈合，詳細記錄大鼠的治療天數(shù)，計算潰瘍平均愈合時間。

1.4.4檢測血清中TNF-α、IL-2和IL-6水平〔18〕變化 將30只口腔潰瘍老年大鼠模型隨機分為3組，模型組(A組)、膜劑組(B組)、蜂膠小分子凝膠組(E組)，每組10只，A組不給藥，B組和E組給予相應的藥物治療，各組于1 d、3 d和7 d尾靜脈取血5 ml，室溫靜置1.5 h，離心后收集血清，按試劑盒方法測定TNF-α、IL-2和IL-6含量。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件和Graphpad Prism5軟件進行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1造模結(jié)果 灼燒30 s后可以看見大鼠右頰有輕微的白色損害，24 h后明顯看見大鼠口腔右頰處有直徑3 mm左右的橢圓或圓形的白色潰瘍面〔19〕，潰瘍周圍紅腫。

2.2各組潰瘍愈合情況 治療前、治療后第1天和第2天各組口腔潰瘍直徑比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，治療后第3天，B、C、E組口腔潰瘍直徑與A組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，治療后第4天B組、C組、D組、E組口腔潰瘍直徑與A組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組治療不同時間口腔潰瘍直徑比較

2.3各組治療前后體重變化 造模后各組大鼠體重均有明顯下降趨勢，各組大鼠體重與前一時間點比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，A組第7天開始回升，B組、C組第4天開始回升，D組第6天開始回升，E組第3天體重開始回升。見表2。體重回升時間：E組(3 d)

表2 各組治療不同時間體重變化

2.4各組潰瘍愈合情況 B組、C組、D組、E組口腔潰瘍平均愈合時間明顯小于A組(P<0.05，P<0.01)，B組、C組和E組口腔潰瘍平均愈合時間與D組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，B組、C組和E組口腔潰瘍平均愈合時間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

治療7 d后經(jīng)比較，A組愈合率為20%，D組愈合率為60%，而B組、C組與E組相同，愈合率達100%。B組和C組與E組的平均愈合時間無明顯差異(P>0.05)，說明二者與蜂膠口腔膜治療效果相當，C組和E組平均愈合時間接近，但5 d內(nèi)愈合率為100%，是C組的2倍，說明蜂膠小分子凝膠治療口腔潰瘍時間更集中，需要時間更短，效果更明顯。見表3。

表3 各組治療不同時間口腔潰瘍愈合情況

2.5各組血清中TNF-α、IL-2和IL-6水平比較 隨給藥時間的延長，A組、B組和E組TNF-α和IL-6的水平逐漸減低，IL-2的水平逐漸增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，同時B組和E組TNF-α和IL-6的水平明顯低于A組，IL-2的水平明顯高于A組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表4。提示蜂膠小分子凝膠治療老年大鼠口腔潰瘍機制可能與炎癥因子引起的免疫功能調(diào)節(jié)有關。

表4 各組治療不同時間血清TNF-α、IL-2、IL-6水平比較

3 討 論

口腔潰瘍模型的制備方法有很多，其中化學灼燒法制備的老年大鼠口腔潰瘍模型基本符合人類口腔潰瘍模型〔20〕。目前口腔潰瘍的治療多以局部用藥為主，治療藥物的種類較多，以化學藥物為首，另外可用的劑型比較局限，多為散劑、膜劑、噴霧劑等，蜂膠小分子凝膠是以維生素B2為載藥基質(zhì)，利用超分子自組裝原理，通過凝膠-溶膠法承載蜂膠提取物微粉得到的一種治療口腔潰瘍新型制劑，方法研究結(jié)果證明這種蜂膠小分子凝膠對老年大鼠口腔潰瘍有顯著的治療作用，能明顯縮短老年大鼠口腔潰瘍愈合時間。從愈合時間來看蜂膠小分子凝膠的治療效果與蜂膠口腔膜劑相差不多，蜂膠提取物微粉組與蜂膠小分子凝膠組比較，更能體現(xiàn)后者治療過程見效快，時間短的特點，在實驗過程中還發(fā)現(xiàn)基質(zhì)組的平均愈合時間也比模型組的平均愈合時間短，可能這種以核黃素為凝膠基質(zhì)的小分子凝膠對口腔潰瘍有輔助促進治療作用，這為蜂膠小分子凝膠的開發(fā)提供有利依據(jù)。對于藥物治療口腔潰瘍機制研究，大多數(shù)研究結(jié)果表明，淋巴細胞和單核細胞釋放的一些炎癥因子參與口腔潰瘍的形成，其中主要以TNF-α、IL-2和IL-6等炎癥因子為主〔21～23〕，這些炎癥因子可以調(diào)節(jié)機體免疫功能〔24〕，當機體發(fā)生炎癥形成潰瘍時TNF-α和IL-6水平大幅增加，IL-2水平降低，蜂膠小分子凝膠治療老年大鼠口腔潰瘍機制可能與炎癥因子引起的免疫功能調(diào)節(jié)有關，通過抑制TNF-α和IL-6等因子和增強IL-2等因子促使口腔潰瘍愈合。