周連吉 吳標(biāo)良 楊大偉 王民登 郭星榮 歐麗娜

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣西 百色 533000)

目前糖尿病腎病(DKD)已成為中國(guó)慢性腎臟疾病的第一病因。在過(guò)去的二十年中，DKD的發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)迅速上升〔1，2〕，最新的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，DKD已經(jīng)成為城市人群進(jìn)入透析的終末期腎病的第一病因〔3～5〕。長(zhǎng)鏈非編碼RNA在各種細(xì)胞反應(yīng)、發(fā)育和疾病過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用〔6〕，研究證實(shí)〔7〕，長(zhǎng)鏈非編碼RNA不僅參與了DKD中腎組織纖維化和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，而且還參與了氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和腎小管上皮細(xì)胞的調(diào)亡等過(guò)程。其通過(guò)一系列機(jī)制參與了DKD的發(fā)生與發(fā)展。MALAT1又稱為非編碼核內(nèi)富含轉(zhuǎn)錄物(NEAT)2，由Ji等〔8〕于2003年在非小細(xì)胞肺癌研究中發(fā)現(xiàn)，是哺乳動(dòng)物體內(nèi)高度保守的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)之一。研究表明，MALAT1是最早發(fā)現(xiàn)的LncRNA之一，在高糖培養(yǎng)條件下，其在視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞和糖尿病小鼠視網(wǎng)膜中顯著上調(diào)〔9，10〕，LncRNA MALAT1在糖尿病引起的微血管并發(fā)癥如DKD和糖尿病視網(wǎng)膜病變中調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)〔11～13〕。本研究主要探討LncRNA MALAT1在DKD患者中的作用及可能的發(fā)病機(jī)制，有助于尋找可靠的生物標(biāo)記和治療新靶點(diǎn)。

1 對(duì)象和方法

1.1研究對(duì)象 2017年1月至2017年12月收集在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診的47例糖尿病患者，20例2型糖尿病(T2DM)患者，其中男12例，女8例，平均年齡(54.85±14.24)歲。27例DKD，其中男16例，女11例，平均年齡(56.3±12.67)歲。同時(shí)收集于醫(yī)院體檢中心就診的14例非糖尿病健康者作為對(duì)照組，其中男8例，女6例，平均年齡(49.57±12.54)歲。T2DM組、DKD組及對(duì)照組之間性別、年齡等一般情況比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。DKD組入組條件：符合中國(guó)TG2DM防治指南2019年版DKD診斷標(biāo)準(zhǔn)〔14〕。T2DM組入組條件：①符合1999年世界衛(wèi)生組織WHO公布的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。②排除、感染、傳染性疾病、腫瘤、藥物等影響血糖或尿蛋白其他重大疾病。醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了該方案，每位患者在入組前均提供書面知情同意書。

1.2研究方法 收集所有研究對(duì)象的外周血液、尿液標(biāo)本，收集身高、體重、血壓、心率等基本資料，并計(jì)算體重指數(shù)(BMI)。超氧化物歧化酶(SOD)、血肌酐(Cr)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、血脂等生化指標(biāo)使用邁瑞B(yǎng)S-2000M(中國(guó)，深圳)全自動(dòng)生化儀進(jìn)行檢測(cè)，胰島素測(cè)定使用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光儀(安圖生)進(jìn)行檢測(cè)，尿微量白蛋白尿肌酐(ACR)、尿β2-微球蛋白(MG)、尿α1-MG等使用BA400特種蛋白儀(西班牙，Bio Systems公司)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)均由醫(yī)院受過(guò)專業(yè)培訓(xùn)的技術(shù)人員進(jìn)行。口服葡萄糖耐量試驗(yàn)于次日8點(diǎn)在空腹?fàn)顟B(tài)下開(kāi)始進(jìn)行，將75 g無(wú)水葡萄糖溶入200～300 ml溫開(kāi)水中，于5 min內(nèi)飲完，隨即開(kāi)始采血，并立即送檢標(biāo)本。所有單位均換算為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)單位。

受試者均行尿β2-MG、尿α1-MG、尿微量白蛋白(UMA)、尿肌酐(UCR)檢測(cè)，并計(jì)算ACR。次日清晨在受檢者空腹?fàn)顟B(tài)下收集受檢者5 ml的中段尿液標(biāo)本，10 min 3 000 r/min離心處理，取上清液，通過(guò)使用BA400特種蛋白儀對(duì)標(biāo)本內(nèi)UMA和UCR行免疫比濁法檢測(cè)，并計(jì)算ACR。ACR<3 mg/g為正常，≥3 mg/g為異常；尿β2-MG<0.3 mg/L為正常，≥0.3 mg/L為異常；尿α1-MG<30 mg/L為正常，≥30 mg/L為異常。血肌酐水平正常值：50～106 μmol/L。

1.3Real-time PCR分析LncRNA MALAT1的表達(dá)水平 所有研究對(duì)象抽取5 ml靜脈血，加入9 ml紅細(xì)胞裂解液，混勻后使用超低溫離心機(jī)，于4℃下2 500轉(zhuǎn)離心5 min，棄上清，加入1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行沖洗，提取好的白細(xì)胞于-80℃下進(jìn)行保存。應(yīng)用Trizol 試劑盒(普飛，中國(guó)上海)抽提白細(xì)胞中的總RNA。將提取的總RNA，參照Promega M-MLV 試劑盒(銳博生物，中國(guó)廣州)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄引物購(gòu)自中國(guó)銳博生物有限責(zé)任公司。引物序列：MALAT1上游5′-CAGACCACCACAGGTTTACAG-3′、下游5′-AGACCATCCCAAAATGCTTCA-3′；GADPH上游5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′、下游5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA- 3′。以上操作均嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作。PCR分析采用 SYBR Green (TIANGEN Bio，Beijing，China)有限公司產(chǎn)品。PCR條件：95℃ 15 min；95 ℃ 10 s；60 ℃ 20 s×40個(gè)循環(huán)。PCR使用熔解曲線評(píng)估。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行樣，取3個(gè)樣本的平均值。以 2-ΔΔCt值表示LncRNA MALAT1的表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行t及χ2檢驗(yàn)受試者工作特征(ROC)曲線、Pearson線性回歸法。

2 結(jié) 果

2.13組一般臨床資料對(duì)比 三組BMI、ACR、尿β2-MG、低密度脂蛋白及三酰甘油比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而尿α1-MG、Cr、腎小球?yàn)V過(guò)率(EGFR)、SOD、HbA1c，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.23組LncRNA MALAT1的表達(dá)水平在比較 與對(duì)照組(1.370±0.467)比較，LncRNA MALAT1在T2DM組(2.879±1.435)、DKD組(4.117±1.755)中的表達(dá)水平明顯升高(P<0.001)；LncRNA MALAT1在DKD組中的表達(dá)較T2DM組升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3LncRNA MALAT1在損傷腎小管標(biāo)志物的表達(dá) α1-MG正常組和α1-MG異常組LncRNA MALAT1表達(dá)分別為：3.942±1.564、2.644±1.836。LncRNA MALAT1在β2-MG異常的糖尿病患者血清中的表達(dá)較尿β2-MG正常的糖尿病患者明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(3.548±1.868 vs 2.035±1.359；t=3.55，P<0.05)。LncRNA MALAT1在ACR異常的糖尿病患者血清中的表達(dá)較ACR正常的糖尿病患者明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(3.836±1.804 vs 2.001±1.343；t=2.11，P<0.05)。

表1 3組一般臨床資料對(duì)比

2.4LncRNA MALAT1的表達(dá)與糖尿病患者的SOD、ACR、尿β2-MG、尿α1-MG、Cr、HbA1c的相關(guān)性 LncRNA MALAT1的表達(dá)與ACR、尿β2-MG、尿α1-MG、Cr、HbA1c呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.395、0.470、0.350、0.306、0.320；P<0.01，P<0.001，P<0.05)；而與SOD呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.388,P<0.05)。

2.5ROC曲線分析LncRNA MALAT1對(duì)DKD的標(biāo)記物潛能 首先采用ROC曲線分析LncRNA MALAT1在DKD組和 T2MD組中，其作為DKD患者血清標(biāo)志物的潛能。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ROC曲線下面積(AUC)為0.727(95%CI：0.586～0.868，P<0.05)，敏感度：53.6%，特異性：90.0%；進(jìn)一步分析LncRNA MALAT1在DKD組和健康對(duì)照組中，其作為DKD患者血清標(biāo)志物的潛能，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)AUC為0.952(95%CI：0.894～1.000，P<0.001)，敏感度：82.1%，特異性：100.0%，可知，LncRNA MALAT1的表達(dá)對(duì)DKD有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。

3 討 論

糖尿病是與腎臟、視網(wǎng)膜、神經(jīng)病變等各種并發(fā)癥相關(guān)的慢性代謝性疾病，到2030年，全球約有3.66億糖尿病患者，預(yù)計(jì)到2035年，全球約有5.92億糖尿病患者，占總?cè)丝诘?/10〔15，16〕。DKD是一種長(zhǎng)期存在且控制不佳的糖尿病的常見(jiàn)并發(fā)癥〔17～19〕，我國(guó)20%～40%的糖尿病患者合并DKD，現(xiàn)已成為慢性腎臟病和終末期腎病的主要原因〔3，20〕。盡管DKD的分子機(jī)制并沒(méi)有完全明確，但是隨著研究的不斷深入，越來(lái)越多的證據(jù)表明發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵是遺傳調(diào)節(jié)。許多研究證據(jù)表明lncRNA在各類疾病中起到的關(guān)鍵作用〔21〕。研究證實(shí)MALAT1失調(diào)參與了DKD的進(jìn)展，其具有診斷靶點(diǎn)的價(jià)值意義。

本研究發(fā)現(xiàn)LncRNA MALAT1在T2DM及DKD患者中的表達(dá)較健康對(duì)照組明顯升高，這與Zhang等〔22〕的研究報(bào)告是一致的。DKD患者進(jìn)展緩慢，DKD早期主要表現(xiàn)為腎臟的體積增大及腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)的增加，而沒(méi)有任何的臨床癥狀〔23～26〕，但是隨著病情的進(jìn)展，DKD患者腎小球?yàn)V過(guò)壓增高并且伴有濾過(guò)膜電荷屏障受損，此時(shí)患者尿中將會(huì)出現(xiàn)UMA，但病人的GFR仍處在正常范圍之內(nèi)，也不會(huì)出現(xiàn)相關(guān)的臨床癥狀，僅表現(xiàn)出UMA的異常。目前，UMA是早期DKD實(shí)驗(yàn)室診斷的重要依據(jù)，而臨床通過(guò)ACR來(lái)矯正隨機(jī)UMA的波動(dòng)。本研究結(jié)果說(shuō)明LncRNA MALAT1在腎臟受損上發(fā)揮作用，在Li等〔27〕研究發(fā)現(xiàn)，在DKD中，MALAT1和miR-23c及其靶基因焦磷酸化相關(guān)蛋白胚胎致死性異常視覺(jué)樣蛋白(ELAVL)1在焦磷酸化細(xì)胞死亡的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起潛在作用。在高血糖條件下LncRNA MALAT1的表達(dá)水平增加，熒光素酶測(cè)定證實(shí)，MALAT1是miR-23c的靶基因，因此，miR-23c在細(xì)胞中的表達(dá)下降，焦磷酸化相關(guān)蛋白ELAVL1和NOD樣受體蛋白(NLRP3)炎癥小體的表達(dá)上調(diào)，隨后激活半胱氨酸天冬氨酸酶(Caspase)-1，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-18的分泌，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)。相反地，MALAT1的表達(dá)下調(diào)或miR-23c的表達(dá)上調(diào)誘導(dǎo)了ELAVL1的表達(dá)被阻斷，從而抑制焦磷酸化途徑并調(diào)節(jié)DKD的發(fā)生發(fā)展。

活化氧的大量生成及氧化應(yīng)激反應(yīng)的過(guò)度激活是DKD患者病情發(fā)展變化過(guò)程中重要的病理變化〔28〕。SOD是一種抗氧化物酶，可催化超氧陰離子自由基歧化為過(guò)氧化氫和氧，從而維持體內(nèi)自由基的平衡〔29〕。研究表明，在糖尿病的情況下，SOD 表達(dá)水平的下降會(huì)增強(qiáng)體內(nèi)過(guò)氧化物的含量，使腎小球微系統(tǒng)增強(qiáng)過(guò)氧化物引起細(xì)胞毒性作用，從而導(dǎo)致糖尿病腎臟細(xì)胞的損害〔30〕。SOD 的表達(dá)水平與腎功能損傷程度呈負(fù)相關(guān)，表明 SOD 在DKD不同階段的發(fā)展中具有重要意義，可作為動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)DKD發(fā)展的敏感指標(biāo)。

本研究結(jié)果提示LncRNA MALAT1的高表達(dá)與T2DM患者DKD的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，有望成為預(yù)測(cè)DKD患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。本研究首次報(bào)道了LncRNA MALAT1在DKD患者血清中高表達(dá)，其表達(dá)與ACR、尿β2-MG、尿α1-MG、Cr相關(guān)，本研究將進(jìn)一步豐富DKD的發(fā)病機(jī)制，為DKD靶基因治療提供新的靶點(diǎn)，為尋找DKD診斷及預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物的研究提供依據(jù)，為解決臨床棘手的DKD提供新策略。但是影響DKD的因素很多，其具體的發(fā)病機(jī)制、診斷和預(yù)后療效評(píng)估仍需進(jìn)一步深入研究。