陳天貴，高 磊，李天博，王江寧

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院骨科，北京 100038）

擠壓傷是交通創(chuàng)傷和自然災(zāi)害等導(dǎo)致的常見損傷，原發(fā)性損傷包括不同程度的軟骨組織和肌肉損傷，傷后若無有效治療，擠壓解除后可合并擠壓綜合征、全身炎癥綜合征、多器官障礙綜合征和急性肢體骨筋膜室綜合征等，直接危及生命［1］。擠壓傷綜合征已是地震傷中除直接死亡的第二大死因［2］，危害嚴(yán)重。在災(zāi)難現(xiàn)場對擠壓傷-擠壓綜合征實(shí)施早期治療方法簡單、方便，若治療時間滯后擠壓解除時間，肢體缺氧壞死產(chǎn)生的毒性物質(zhì)回流入血會對各器官造成損傷［3］，因此積極有效的輔助干預(yù)措施對于緩解疾病有重大意義。脈絡(luò)寧（Mailuoning）可降低缺氧/再灌注后血漿炎癥因子水平，減輕肌細(xì)胞水腫現(xiàn)象，同時可保護(hù)細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)完整性［4］，可減輕擠壓傷綜合征模型豬骨骼肌組織的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡［5］，但具體機(jī)制尚未深入研究。Wnt/β-連接蛋白（β-catenin）通路是機(jī)體經(jīng)典的模式分子信號通路之一，在缺血再灌注模型中Wnt/β-catenin 通路與缺氧再灌注損傷關(guān)系密切，且與Notch 通路關(guān)系密切［6］。推測脈絡(luò)寧可能通過影響Wnt/β-catenin 和Notch 通路實(shí)現(xiàn)對擠壓傷綜合征的治療作用。因此，本研究建立擠壓傷動物模型，探討脈絡(luò)寧局部灌注對擠壓傷綜合征模型豬的保護(hù)機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動物

健康成年巴馬小型豬24只，體重24～30 kg，購自首都醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2019-0007，動物使用許可證號為SYXK（京）2019-0017。動物實(shí)驗(yàn)過程符合2006 年中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》［7］。

2 藥品、試劑及儀器

脈絡(luò)寧注射液（金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠，規(guī)格為每克10 mL，批號20190913）；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號G1120）；Trizol 試劑和cDNA 第1 鏈合成試劑盒（天根生化科技北京有限公司，批號分別為KM1091、KR104）；豬白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子α（tumor ne?crosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒，以及兔抗βcatenin、Delta 樣配體4（Delta-like ligand 4，Dll4）、Notch 和 GAPDH 抗體（Abcam，批號分別為ab100754、ab100756、ab16051、ab270620、ab83232、ab8245）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗（碧云天生物技術(shù)研究所，批號KL0069M）；總蛋白提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號BC3750-80）；組織核蛋白提取試劑盒（上海貝博生物科技公司，批號BB-31152-20T）。顯微鏡（北京佳源興業(yè)科技有限公司，型號UB203i）；Spectra S/TEM 型透射電鏡和ProFlex型RT-qPCR 儀（Thermo Fisher Scientific）；蛋白凝膠成像系統(tǒng)（Tanon，型號5200）。

3 方法

3.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型制備 24 只巴馬小型豬隨機(jī)分為正常對照（normal control，NC）組、模型（model）組、常規(guī)灌注（model+NP）組和脈絡(luò)寧灌注（MP）組，每組6只。按照參考文獻(xiàn)［8］制作擠壓模型，兩塊帶齒金屬夾板，中間設(shè)梯形凹槽固定豬肢體。除正常對照組外，其余各組參考文獻(xiàn)［5］建立擠壓傷模型，肌肉注射氯胺酮誘導(dǎo)麻醉、后耳緣靜脈滴注丙泊酚徹底麻醉豬，將豬右后肢放入擠壓模型帶齒處，調(diào)整肢體使其股骨嵌入梯形卡槽中150 kg 恒定壓力擠壓，擠壓5 h 后建模動物無死亡現(xiàn)象，均建模成功，在此過程中若豬麻醉緩解則追加丙泊酚劑量直至麻醉滿意。正常對照組不做任何處理。

常規(guī)灌注組建模前右后肢擠壓部位解剖出股動、靜脈，股動、靜脈插管并固定后用生理鹽水浸潤紗布覆蓋切口，僅留置股、動靜脈接頭于體外，建模后血管夾夾閉近端股動、靜脈，結(jié)扎可見的側(cè)支循環(huán)，將系統(tǒng)動、靜脈管路分別與豬股動、靜脈接頭連接，簡易止血帶阻斷側(cè)支循環(huán)，解除擠壓。體外循環(huán)行自體同型血灌注（速度170 mL/min，溫度10℃，時長1 h），膜肺裝置（可替代肺臟功能）氧體積分?jǐn)?shù)為10%，灌注過程中以50 mL/h 的速度滴入生理鹽水，灌注完畢后拔除管路，壓迫止血，松血管夾恢復(fù)自身血供，逐層縫合切口。脈絡(luò)寧灌注組將灌注過程中的生理鹽水換成脈絡(luò)寧注射液，灌注體積、速度和時間均相同，且其余步驟相同。模型組只建立擠壓傷模型，模型建立后即刻恢復(fù)自身血供，血管不進(jìn)行任何處理。正常對照組不做任何處理。

3.2 樣本采集 正常對照組和模型組建模后再灌注4 h，常規(guī)灌注組和脈絡(luò)寧灌注組自體同型血灌溉結(jié)束4 h后耳緣靜脈采血，右后肢實(shí)驗(yàn)部位脛前肌取標(biāo)本，部分置于4%多聚甲醛中固定，部分置于戊二醛中固定，部分置于-80℃冰箱保存。

3.3 HE 檢測骨骼肌組織形態(tài) 4%多聚甲醛中取出固定樣本，經(jīng)切片后HE 染色試劑盒染色，封片后顯微鏡下病變部位或與病變部位同位置處拍照。部分新鮮組織，腫脹程度用濕重/干重表示，血管破裂比例=破裂血管/總血管。

3.4 透射電鏡觀察骨骼肌超微結(jié)構(gòu) 戊二醛中取出固定樣本，常規(guī)透射電鏡操作進(jìn)行脫水、包埋、切片，透射電鏡下觀察骨骼肌超微結(jié)構(gòu)。定量Z 線異常情況，Z 線異常百分率（%）=Z 線異常數(shù)/Z 線總數(shù)×100%。

3.5 ELISA 檢測血清中IL-1β 和TNF-α 的水平 靜脈血室溫放置2 h，3 000 r/min 離心10 min，取上清，嚴(yán)格按照豬IL-1β 和TNF-α ELISA 試劑盒說明檢測血清中IL-1β和TNF-α的水平。

3.6 RT-qPCR 檢測骨骼肌組織中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）的mRNA水平 ?80℃冰箱取部分組織，剪碎后加Trizol試劑冰上勻漿并提總RNA，200 ng 總RNA 用cDNA第1 鏈合成試劑盒合成cDNA，RT-qPCR 擴(kuò)增VEGF、MMP-2 和內(nèi)參GAPDH。VEGF、MMP-2 和GAPDH 的引物由上海生工生物工程有限公司合成。VEGF 的上游引物序列為5’-CCTTGCTGCTCTACCTCCAC-3’，下游引物序列為5’-ACTCCAGACCT TCGTC?GTTG-3’；MMP-2 的上游引物序列為5’-GTC?GCCCATCATCAA GTTTC-3’，下游引物序列為5’-TCCTTCAGCACGAACAGGT-3’；GAPDH 的上游引物序列為5’-GGCAGCCCAGAACATCATCC-3’，下游引物序列為5’-GCCAGCCCAAGCATCAAA-3’。上樣體系為20 μL：cDNA（50 mg/L）1 μL，F(xiàn)/R（10 μmol/L）各0.5 μL，SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）10 μL，ddH2O 8 μL。反應(yīng)條件為：95℃3 min；95℃30 s，61℃45 s，40 個循環(huán)。2?ΔΔCt法計算骨骼肌組織中VEGF和MMP-2的mRNA水平。

3.7 Western blot 檢測骨骼肌組織中β-catenin、Dll4和Notch 的蛋白水平 ?80℃冰箱取部分組織，剪碎勻漿，蛋白提取試劑盒提取各組豬組織總蛋白檢測β-catenin總蛋白、Dll4和Notch蛋白水平，部分組織核蛋白提取試劑盒提取核蛋白檢測β-catenin 核蛋白水平，蛋白上樣30 ng，SDS-PAGE 分離、PVDF 膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入抗β-catenin、Dll4、Notch 和GAPDH 的Ⅰ抗（均為1∶2 000 稀釋）4℃孵育過夜，次日加入辣根過氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗（1∶5 000稀釋）室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光液顯色，蛋白凝膠系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度，待測蛋白相對表達(dá)水平=待測蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。GAPDH為內(nèi)參照。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）描述，多組比較行單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 脈絡(luò)寧對豬骨骼肌組織形態(tài)的影響

正常對照組肌纖維排列整齊，可見明顯的橫紋肌，無增生和腫脹或固縮現(xiàn)象，血管形態(tài)正常，無破裂；模型組肌纖維排列紊亂，肌核腫脹或固縮明顯，肌膜皺縮，血管出現(xiàn)破裂、腫脹現(xiàn)象，肌間質(zhì)水腫，炎癥細(xì)胞浸潤明顯，與正常對照組相比組織腫脹和血管破損比例升高（P＜0.05）；常規(guī)灌注組肌纖維排列較模型組稍整齊，肌膜皺縮或腫脹，血管腫脹或破裂，與模型組相比組織腫脹和血管破損比例降低（P＜0.05）；脈絡(luò)寧灌注組肌纖維較常規(guī)灌溉組排列整齊，肌膜皺縮或腫脹現(xiàn)象不明顯，血管基本恢復(fù)正常，分別與模型組和常規(guī)灌注組相比組織腫脹和血管破損比例均降低（P＜0.05）。見圖1、表1。

2 脈絡(luò)寧對豬骨骼肌組織超微結(jié)構(gòu)的影響

正常對照組骨骼肌絲排列緊湊且整齊，肌纖維I帶、A線和Z線清晰可見且規(guī)則，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核位置、形態(tài)正常，線粒體、肌漿網(wǎng)形態(tài)均正常；模型組骨骼肌絲排列紊亂、出現(xiàn)溶解，肌纖維I 帶、A 線和Z 線部分喪失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體腫脹明顯，肌核腫脹，出現(xiàn)大量的核聚集和核內(nèi)移，與正常對照組相比，Z 線異常百分率升高（P＜0.05）；常規(guī)灌注組肌絲排列較模型組明顯規(guī)則，形態(tài)稍微腫脹，間隙變窄，肌纖維I帶、A線和Z線清晰，線粒體出現(xiàn)輕度腫脹，與模型組相比，Z 線異常百分率降低（P＜0.05）；脈絡(luò)寧灌注組與正常對照組基本相似，肌絲排列緊湊且整齊，肌纖維I帶、A 線、Z線清晰可見且規(guī)則，細(xì)胞核排列整齊，腫脹不明顯，分別與模型組和脈絡(luò)寧灌注組相比，Z線異常百分率均降低（P＜0.05）。見圖2、表1。

Figure 1.Morphological changes of skeletal muscle of pigs in the 4 groups（HE staining，×200）.NC：Normal control；NP：normal perfusion；MP：Mailuoning perfusion.圖1 4組豬骨骼肌組織形態(tài)情況

Figure 2.Ultrastructure of skeletal muscle tissue of pigs in the 4 groups（×3 000）.NC：normal control；NP：normal perfusion；MP：Mailuoning perfusion.圖2 4組豬骨骼肌組織超微結(jié)構(gòu)情況

表1 4組豬骨骼肌組織腫脹程度、血管破損比例和骨骼肌組織中Z線異常百分率的比較Table 1.Comparison of the swelling degree of skeletal muscle tissue and the proportion of vascular damage，and Z-line abnormal per?centage in skeletal muscle tissues in the 4 groups（Mean±SD. n=6）

3 脈絡(luò)寧對豬血清IL-1β和TNF-α水平的影響

與正常對照組相比，模型組血清中的IL-1β 和TNF-α 水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，常規(guī)灌注組和脈絡(luò)寧灌注組血清中的IL-1β 和TNF-α 水平降低（P＜0.05）；與常規(guī)灌注組相比，脈絡(luò)寧灌注組血清中的TNF-α水平降低（P＜0.05），見表2。

4 脈絡(luò)寧對豬骨骼肌組織中VEGF 和MMP-2 mRNA水平的影響

與正常對照組相比，模型組骨骼肌組織中VEGF和MMP-2 的mRNA 水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，常規(guī)灌注組骨骼肌組織中MMP-2的mRNA水平，脈絡(luò)寧灌注組骨骼肌組織中VEGF 和MMP-2 的mRNA 水平降低（P＜0.05）；與常規(guī)灌注組相比，脈絡(luò)寧灌注組骨骼肌組織中VEGF 和MMP-2 的mRNA 水平降低（P＜0.05），見表2。

表2 4組豬血清中IL-1β和TNF-α水平和骨骼肌組織中VEGF和MMP-2的mRNA水平的比較Table 2.Comparison of the serum levels of IL-1β and TNF-α，and the mRNA levels of VEGF and MMP-2 in skeletal muscle tissues in the 4 groups（Mean±SD. n=6）

5 脈絡(luò)寧對豬骨骼肌組織中β-catenin、Dll4 和Notch蛋白水平的影響

比較β-catenin 總蛋白在各組間的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＞0.05）。與正常對照組相比，模型組骨骼肌組織中β-catenin 核蛋白/β-catenin 總蛋白、Dll4 和Notch 蛋白水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，常規(guī)灌注組和脈絡(luò)寧灌注組骨骼肌組織中β-catenin 核蛋白/β-catenin 總蛋白、Dll4 和Notch 蛋白水平降低（P＜0.05）；與常規(guī)灌注組相比，脈絡(luò)寧灌注組骨骼肌組織中β-catenin 核蛋白/β-catenin 總蛋白、Dll4和Notch蛋白水平降低（P＜0.05），見圖3、表3。

Figure 3.Expression of β-catenin，Dll4 and Notch proteins in skeletal muscle tissues of the 4 groups.NC：normal control；NP：normal perfusion；MP：Mailuoning per?fusion；total：total protein；nucleus：nuclear protein.圖3 4 組豬骨骼肌組織中β-catenin、Dll4 和Notch 蛋白表達(dá)情況

表3 4組豬骨骼肌組織中β-catenin、Dll4和Notch蛋白水平的比較Table 3.Comparison of β-catenin，Dll4 and Notch protein levels in pig skeletal muscle tissues of the 4 groups（Mean±SD. n=6）

討 論

重物作用下會壓迫骨骼肌，導(dǎo)致壓迫對象遭受休克、腎衰竭等癥狀，造成再灌注損傷，累及全身器官，誘發(fā)擠壓綜合征［9］。本研究發(fā)現(xiàn)擠壓傷后缺氧再灌注會損傷骨骼肌，血管出現(xiàn)破裂、骨骼肌中炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，肌纖維、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體以及細(xì)胞核都出現(xiàn)損傷，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞核暴露，細(xì)胞損傷嚴(yán)重，組織腫脹、血管破損比例，Z 線異常百分率升高。脈絡(luò)寧注射液主要成分為金銀花、牛膝、石斛、玄參，清熱養(yǎng)陰、活血化瘀，可擴(kuò)張血管、增加血流量，同時可清除自由基、提高組織抗缺氧缺血和改善微循環(huán)能力［10］。常規(guī)灌注組肌纖維排列較模型組稍整齊，肌纖維I 帶、A 線和Z 線清晰，肌膜皺縮或腫脹，血管腫脹或破裂，線粒體出現(xiàn)輕度腫脹，組織腫脹、血管破損比例，Z線異常百分率降低。單純的生理鹽水灌注可能通過稀釋毒性物質(zhì)作用，降低氧自由基水平，在一定程度上清除氧自由基、降低氧化應(yīng)激和炎癥水平，實(shí)現(xiàn)對組織的保護(hù)［11］，但能力有限，機(jī)體還會受到一定程度的損傷。而脈絡(luò)寧注射液替換生理鹽水灌注，肌纖維較常規(guī)灌溉組排列整齊，肌纖維I帶、A 線和Z 線清晰可見且規(guī)則，細(xì)胞核排列整齊，肌膜皺縮或腫脹現(xiàn)象不明顯，組織腫脹、血管破損比例，Z線異常百分率得到進(jìn)一步緩解，血管基本恢復(fù)正常。可能是脈絡(luò)寧擴(kuò)張血管、增加血流量較迅速，本身對損傷部位抗氧化、清除自由基能力較強(qiáng)，從而改善損傷部位微循環(huán)，降低有害物質(zhì)經(jīng)血液流經(jīng)全身各器官和組織，減少對機(jī)體的損傷。

IL-1β 在缺血缺氧損傷再灌注中增加興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性作用，可使鈣離子超負(fù)載、加速促凋亡基因，加速細(xì)胞損傷；可影響炎癥因子水平加重?fù)p傷［12］。TNF-α 作為炎癥啟動因子，可激活多種炎癥因子釋放；亦可參與水腫過程，促進(jìn)細(xì)胞、組織水腫［13］。VEGF屬血管內(nèi)皮細(xì)胞特有的促有絲分裂原，廣泛存在于骨骼肌和心肌等組織中，在缺血再灌注中水平升高參與微血管病過程，拮抗VEGF 可減少腦缺血/再灌注損傷，從而實(shí)現(xiàn)在疾病狀態(tài)下對機(jī)體的保護(hù)［14］。MMP-2主要底物包括羅明膠、膠原、層黏連蛋白和彈性蛋白等，再灌注后氧自由基增加升高M(jìn)MP-2 水平，MMP-2 水平升高可使膠原、層黏連蛋白、彈性蛋白等降解，從而破壞血腦屏障完整性，增加血管通透性、加速炎癥細(xì)胞侵入，促進(jìn)腦水腫［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，模型組血清中IL-1β 和TNF-α 水平，骨骼肌組織中VEGF 和MMP-2 mRNA 水平升高，提示擠壓傷綜合征導(dǎo)致的缺血再灌注導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子水平升高，增加神經(jīng)毒性作用，增加鈣離子負(fù)荷，導(dǎo)致血管通透性增加，加強(qiáng)炎癥因子侵入、增加腦水腫，加重疾病進(jìn)程。而脈絡(luò)寧灌注可緩解上述功能，減輕擠壓傷綜合征的損傷。

Wnt/β-catenin 通路可調(diào)節(jié)軟骨的成熟、分化、凋亡等過程，對軟骨外基質(zhì)分解代謝亦發(fā)揮重要作用［16］。在骨代謝過程中，Wnt 拮抗劑可緩解軟骨肥大，并且在炎癥過程中抑制MMPs 水平從而抑制VEGF 產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)［17］。Notch 參與多種信號通路的調(diào)節(jié)，且血管壁存在多種Notch 配體和受體，Dll4 作為Notch 配體之一，病理情況下病理血管激活Dll4/Notch 通路抑制血管內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移，從而加重疾病進(jìn)程［18-19］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin 信號通路與Notch 信號通路相互影響從而發(fā)揮作用［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，模型組骨骼肌組織中β-catenin核蛋白/β-catenin總蛋白、Dll4和Notch蛋白水平升高，說明擠壓傷綜合征骨骼肌組織中Wnt/β-catenin 處于激活狀態(tài)，激活Wnt/β-catenin 促進(jìn)炎癥因子的釋放，從而促進(jìn)增加MMP2 水平，增加毒性作用，增加鈣離子負(fù)荷，同時促進(jìn)VEGF 形成，導(dǎo)致血管通透性增加，加強(qiáng)炎癥因子侵入、增加水腫，并且上調(diào)Dll4/Notch 通路抑制新生血管形成、抑制骨組織新生，加重疾病進(jìn)程。而灌注后可改善上述癥狀，且添加脈絡(luò)寧注射液后對Wnt/β-catenin 和Notch 的抑制作用加強(qiáng)，從而降低炎癥水平，減緩毒性作用，減少水腫，實(shí)現(xiàn)對疾病的治療作用。

綜上所述，脈絡(luò)寧局部灌注可抑制Wnt/βcatenin 和Notch通路，緩解炎癥、及血管損傷，從而實(shí)現(xiàn)對擠壓傷綜合征的治療作用。但脈絡(luò)寧成分復(fù)雜，亦可能通過別的信號通路發(fā)揮作用，且并未研究不同時間點(diǎn)的差異，是擠壓傷綜合征進(jìn)一步研究需要關(guān)注的課題。