蘇苗賞，薛思忱，徐 莉，任錫凱，黃 楠，唐祝親，徐漫歡

（1溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院、第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江溫州 325027；2溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院，浙江溫州 325035）

臨床流行病學(xué)調(diào)查顯示，阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea hypopnea syn?drome，OSAHS）患兒夜遺尿發(fā)病率明顯增高，尤其是女性O(shè)SAHS 患兒，夜遺尿發(fā)生率增高達(dá)4倍以上，嚴(yán)重影響患兒的身心健康［1-2］。既往研究已證實(shí)，間歇性低氧（intermittent hypoxia，IH）是OSAHS 的主要病理生理學(xué)機(jī)制，OSAHS 可導(dǎo)致全身多系統(tǒng)功能損害［3］。IH 可導(dǎo)致腎損害和夜間遺尿，前期的研究已經(jīng)成功建立OSAHS 大鼠的遺尿模型［4］。兒茶酚雌激素在氧化應(yīng)激作用下，通過(guò)膀胱神經(jīng)受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可誘發(fā)OSAHS 大鼠的遺尿反射［4］。中藥益智仁（Al?piniae oxyphyllaeFructus，AOF）在OSAHS 大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)中起重要調(diào)節(jié)作用［5］，但其作用機(jī)制尚不清楚。為進(jìn)一步觀察OSAHS 對(duì)逼尿肌細(xì)胞凋亡的影響及AOF 的調(diào)節(jié)機(jī)制，本研究通過(guò)建立模擬OSAHS 的逼尿肌細(xì)胞模型，觀察IH 環(huán)境對(duì)人逼尿肌細(xì)胞凋亡及其鈣離子通道的影響，探討不同濃度AOF對(duì)逼尿肌細(xì)胞鈣離子通道的調(diào)節(jié)機(jī)制。

材料和方法

1 主要試劑和儀器

特異性抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）單抗（bs-10169R，Bioss）和即用型DA?PI 染液（KGA215-50，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit（AP101-100-kit，杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）；P2X3受體拮抗劑（Proteintech）；β3受體拮抗劑（Abcam）；M3受體拮抗劑（Abcam）；益智仁提取物（AOF，澳門萬(wàn)生堂藥材公司）；取不同劑量AOF 溶解于PBS 緩沖液，調(diào)節(jié)至干預(yù)濃度為10 mg/L、50 mg/L 和100 mg/L 備用。PBS 緩沖液：秤取NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·2H2O 2.85 g 和KH2PO40.24 g，加雙蒸水900 mL 溶解，調(diào)pH 值至7.4，量筒定容至I L，高溫高壓滅菌后使用；0.5% Triton X-100：取50 μL Triton X-100 加入10 mL PBS 中，然后放入37℃水浴鍋溶解。使用儀器包括：熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9054，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）；藥品冷藏柜（BYC-310，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9070A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；熒光顯微鏡（CKX53，OLYM?PUS，奧林巴斯中國(guó)有限公司）；NovoCyte?流式細(xì)胞儀（艾森生物杭州有限公司，型號(hào)：NovoCyte 2060R）。

2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組干預(yù)

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人膀胱逼尿肌細(xì)胞株購(gòu)自上海中科院細(xì)胞生物研究所。細(xì)胞株復(fù)蘇后接種至底面積為25 cm2的培養(yǎng)瓶，加入含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和1×105U/L 鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)液，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)生長(zhǎng)。每隔2 d 傳代1 次。取傳代2～3 代后穩(wěn)定對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞，消化后吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×109/L，按每孔2 mL 接種于6孔板，48 h后用于實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前更換無(wú)血清培養(yǎng)液。光鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)、密度變化情況。細(xì)胞圖像通過(guò)顯微鏡（×200）攝取。每組獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)均采集超過(guò)30個(gè)區(qū)域的細(xì)胞。

2.2 分組干預(yù) 將逼尿肌細(xì)胞隨機(jī)分為6 組，每組設(shè)8 個(gè)復(fù)孔，共進(jìn)行8 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)：P2X3受體拮抗劑+IH 組（A 組）、M3受體拮抗劑+IH 組（B 組）、β3受體拮抗劑+IH 組（C 組）、AOF+IH 組（D 組）、生理鹽水+IH對(duì)照組［陰性對(duì)照（negative control，NC）組］和空氣模擬對(duì)照（AC）組。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，P2X3、M3和β3受體拮抗劑的最佳干預(yù)濃度均為100 nmol/L，AOF干預(yù)的最佳干預(yù)濃度為50 mg/L。

3 方法

3.1 IH 細(xì)胞模型 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定IH 模式為5%O260 min 和20% O230 min，6 個(gè)循環(huán)。IH 環(huán)境下細(xì)胞造模參考蔡曉紅等［4］的方法：（1）氧艙主要由以下部分組成：實(shí)驗(yàn)艙、空氣模擬對(duì)照艙、PLC 及電腦控制系統(tǒng)、氧氣管道、氮?dú)夤艿?、二氧化碳管道、空氣輸注管道、氣體減壓閥、氣體流量控制閥和溶解氧電極。實(shí)驗(yàn)艙側(cè)壁設(shè)有氧氣、氮?dú)夂投趸歼M(jìn)氣單向閥門，空氣模擬對(duì)照艙設(shè)有空氣和二氧化碳單向閥門，均由程序控制電磁閥開關(guān)，艙內(nèi)壓力始終保持常壓。通過(guò)PLC 及電腦控制系統(tǒng)編程不同程序，調(diào)控艙內(nèi)氧氣濃度，模擬不同的IH 環(huán)境。利用氧氣和二氧化碳濃度檢測(cè)儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)箱和對(duì)比箱中的氧氣和二氧化碳濃度。采用溶解氧電極監(jiān)測(cè)細(xì)胞層面上方1 mm 處培養(yǎng)液中溶解氧濃度。（2）間歇性低氧模式設(shè)定：維持實(shí)驗(yàn)艙和對(duì)照艙溫度為37℃，CO2含量為5%。6 孔板每孔添加3 mL 培養(yǎng)液，將艙內(nèi)氧濃度從20%迅速降至5%，監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液中氧分壓變化，繪制氧分壓-時(shí)間曲線。根據(jù)曲線特點(diǎn)，當(dāng)培養(yǎng)液中氧分壓降至（56±4）mmHg 時(shí)維持（10～40）s，統(tǒng)計(jì)所需時(shí)間。再將艙內(nèi)氧濃度從5%升至20%，記錄培養(yǎng)液中氧分壓達(dá)到正常所需時(shí)間。根據(jù)記錄的低氧和復(fù)氧時(shí)間，結(jié)合人體OSAHS 疾病特點(diǎn)，設(shè)定該模型間歇性低氧的循環(huán)頻率和時(shí)間。

3.2 免疫熒光法檢測(cè)α-SMA 表達(dá) 免疫組化熒光染色光鏡下觀察逼尿肌細(xì)胞形態(tài)及α-SMA 表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)流程如下：（1）細(xì)胞的固定：在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的培養(yǎng)皿用PBS浸洗3次，每次3 min；用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗培養(yǎng)皿3次，每次3 min；（2）細(xì)胞的通透、打孔：0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫通透20 min；（3）封閉：PBS浸洗培養(yǎng)皿3 次，每次5 min，移液器吸干PBS，在培養(yǎng)皿內(nèi)滴加5%BSA，37°C 封閉30 min；（4）免疫反應(yīng)：加Ⅰ抗移液器吸掉封閉液，不洗，培養(yǎng)皿內(nèi)滴加足夠量的稀釋好的Ⅰ抗（α-SMA，1∶200），37℃孵育3 h；（5）加熒光Ⅱ抗：PBS 浸洗培養(yǎng)皿3 次，每次3 min，移液器吸干培養(yǎng)皿內(nèi)多余液體后滴加稀釋好的熒光Ⅱ抗CY3（1∶200），37℃孵育30 min，PBS 浸洗培養(yǎng)皿3 次，每次3 min；注意：從加熒光Ⅱ抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進(jìn)行；（6）復(fù)染和封片：滴加DAPI避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，用PBS 沖洗多余的DAPI；用50%甘油封閉培養(yǎng)皿。然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。每張切片隨機(jī)選擇5 個(gè)視野（×200），相同條件下拍攝，利用Image-Pro Plus 5.0軟件測(cè)定陽(yáng)性部位的吸光度值（IA）和面積（mean ar?ea），通過(guò)計(jì)算得到的平均吸光度值（MA）。

3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集（1～3）×106個(gè)細(xì)胞，加1 mL PBS，200×g離心3 min，洗兩遍；用雙蒸水將5×Binding Buffer 稀釋為1×Binding Buffer；取300 μL 預(yù)冷的1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞；每管各加入3 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI-PE；輕微混勻后，室溫避光孵育10 min；再向每管中加入200 μL 預(yù)冷的1×Binding Buffer；混勻后上流式儀檢測(cè)。

3.4 膜片鉗法檢測(cè)鈣離子通道 以微弱電流信號(hào)測(cè)量為基礎(chǔ)，利用玻璃微電極與細(xì)胞膜高阻封接技術(shù)，測(cè)量鈣離子通道產(chǎn)生的電流，其值達(dá)到pA 量級(jí)。實(shí)驗(yàn)分為3 組，選擇人膀胱逼尿肌細(xì)胞密度在50%～60%時(shí)，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，加入不同濃度的AOF，分別為10 mg/L、50 mg/L 和100 mg/L。AOF 孵育24 h 后記錄離子通道。每組記錄10 個(gè)膀胱逼尿肌細(xì)胞，細(xì)胞膜鉗制電壓為-80 mV，通過(guò)去極化脈沖使膜去極至?90 mV，時(shí)程為2 ms，通過(guò)積分計(jì)算得到單個(gè)膀胱逼尿肌細(xì)胞的膜電容。膜片鉗數(shù)據(jù)的采集及分析由計(jì)算機(jī)軟件（pCLAMP 6.02，Axon），經(jīng)數(shù)/模轉(zhuǎn)換成電壓信號(hào)，控制細(xì)胞膜電位。將記錄到的細(xì)胞膜電流信號(hào)通過(guò)500 M 探頭，輸入膜片鉗放大器（Axonpatch-200B）經(jīng)膜片鉗放大器的電流-電壓轉(zhuǎn)換后，輸入到模/數(shù)轉(zhuǎn)換卡，存入硬盤以便進(jìn)一步分析處理，其采樣頻率為1 kHz，低通濾波器濾波頻率為3 kHz。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組正態(tài)計(jì)量資料數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，多組間的資料比較采用單因素方差分析，組與組之間的兩兩比較，若方差齊則用LSD 檢驗(yàn)，方差不齊則用Dunnett′s T3 檢驗(yàn)。各組計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組細(xì)胞密度及形態(tài)學(xué)改變

如圖1、2 顯示，與AC 組細(xì)胞比較，NC 組細(xì)胞密度增高、反應(yīng)活躍，部分細(xì)胞出現(xiàn)突起、變圓，細(xì)胞邊界模糊；A 組和D 組細(xì)胞密度較NC 組有顯著減低；B組和C 組的細(xì)胞未見(jiàn)明顯異常反應(yīng)。進(jìn)一步用計(jì)數(shù)板法比較各組人逼尿肌細(xì)胞密度。結(jié)果如表1 顯示，與AC 組比較；NC 組的細(xì)胞密度顯著增高（P＜0.05）；而A 組、D 組（與NC 組比較，細(xì)胞密度有不同程度降低（P＜0.05）。

2 各組細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)情況

如圖2、表1 顯示，與AC 組細(xì)胞比較；NC 組細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)的MA顯著增高（F=3.25，P＜0.05）；而A 組和D 組細(xì)胞分別與NC 組細(xì)胞比較，其α-SMA蛋白表達(dá)的MA均有顯著降低（P＜0.05）。

3 各組細(xì)胞凋亡率的比較

Figure 1.Cell density and morphological changes of human bladder detrusor cells in each group under light microscope.Scale bar=100 μm.圖1 普通光鏡下各組人膀胱逼尿肌細(xì)胞學(xué)鑒定

表1 各組人膀胱逼尿肌細(xì)胞密度及凋亡情況Table 1.Cell density and apoptosis rates of human bladder detrusor cells in each group under light microscope（Mean±SD. n=8）

結(jié)果如表1、圖3 顯示，與AC 組細(xì)胞比較，NC 組細(xì)胞凋亡率顯著減低（P＜0.05）；A 組與D 組的細(xì)胞凋亡率分別與NC比較有顯著增高（P＜0.05）。

4 各組細(xì)胞鈣離子通道表達(dá)改變

Figure 2.Cytological identification of human bladder detrusor cells in each group under immunofluorescence staining light micro?scope.Scale bar=100 μm.圖2 免疫熒光染色光鏡下各組人膀胱逼尿肌細(xì)胞學(xué)鑒定

記錄AC 組和IH 干預(yù)組逼尿肌細(xì)胞孵育24 h 后的鈣通道電流，保持電壓控制在?80 mV，指令電壓為?80 mV～+80 mV，階躍命令為+10 mV，持續(xù)時(shí)間200 ms，頻率1 Hz，得到各個(gè)測(cè)試電壓的鈣通道電流值，繪制電流-電壓關(guān)系曲線。AC組細(xì)胞鈣通道在去極化至大約?20 mV 時(shí)被激活，最大內(nèi)向峰值電流在+20 mV～+30 mV［（268.00±25.56）pA］；IH 干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)向電流顯著減低［（163.83±31.40）pA］，表明IH 干預(yù)可抑制鈣離子內(nèi)流，見(jiàn)圖4。記錄經(jīng)不同濃度（10 mg/L、50 mg/L 和100 mg/L）AOF 干預(yù)孵育24 h 后人逼尿肌細(xì)胞的鈣通道電流，在10 個(gè)細(xì)胞有8 個(gè)可記錄出內(nèi)向鈣電流。用測(cè)試電位在+20 mV 時(shí)的鈣通道電流值為峰值，并以細(xì)胞膜電容標(biāo)化。結(jié)果表明，100 mg/L 和50 mg/L AOF 干預(yù)組鈣離子通道電流與IH 對(duì)照組比較均顯著增高（P＜0.05），而小劑量組（10 mg/L）干預(yù)與IH對(duì)照組比較無(wú)顯著增高（P＞0.05），見(jiàn)圖5。

討 論

既往臨床研究已證實(shí)OSAHS 患兒可導(dǎo)致夜間遺尿，OSAHS 對(duì)腎臟的影響主要表現(xiàn)為夜間多尿、腎功能改變、蛋白尿和腎小管功能受損等［6-10］。本研究在前期動(dòng)物模型［3］基礎(chǔ)上建立OSAHS 誘導(dǎo)膀胱逼尿肌細(xì)胞功能改變的IH 細(xì)胞模型，探討IH 對(duì)膀胱逼尿肌細(xì)胞凋亡的影響及其調(diào)節(jié)機(jī)制。研究結(jié)果顯示，IH 可通過(guò)P2X3神經(jīng)受體調(diào)節(jié)逼尿肌細(xì)胞增殖和凋亡，中、高劑量AOF 可改變鈣離子通道并對(duì)IH 誘導(dǎo)的細(xì)胞損害起保護(hù)作用。

關(guān)于IH 細(xì)胞模型的建立：前期研究已經(jīng)應(yīng)用人肺腺癌細(xì)胞A549 建立一種改良的IH 細(xì)胞模型［4］，并驗(yàn)證：5%O260 min 和20%O230 min 的IH 和復(fù)氧細(xì)胞模式，能模擬OSAHS 的病理生理過(guò)程，是研究OSAHS較理想的細(xì)胞模型［6］。本研究在前期IH細(xì)胞模型基礎(chǔ)上改進(jìn)并建立一種IH 環(huán)境下的人膀胱逼尿肌細(xì)胞模型，旨在探討OSAHS 誘導(dǎo)遺尿的作用及AOF的調(diào)節(jié)機(jī)制。

Figure 3.Comparison of bladder detrusor cell apoptosis rates in each group（n=8）.圖3 各組人膀胱逼尿肌細(xì)胞凋亡率的比較

本研究通過(guò)普通光鏡和熒光染色后觀察膀胱逼尿肌細(xì)胞的密度及形態(tài)改變，結(jié)果顯示與空氣對(duì)照組比較，IH 組的細(xì)胞密度增高、反應(yīng)活躍，部分細(xì)胞出現(xiàn)突起、變圓，細(xì)胞邊界模糊，提示IH 可改變?nèi)税螂妆颇蚣〖?xì)胞的結(jié)構(gòu)形態(tài)和生理功能；通過(guò)阻斷P2X3膀胱受體信號(hào)和AOF干預(yù)后可顯著緩解IH對(duì)人膀胱逼尿肌的病理?yè)p害。免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞α-SMA表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與空氣對(duì)照組比較，IH 組的細(xì)胞MA數(shù)值顯著增高，提示IH 可促進(jìn)人膀胱逼尿肌細(xì)胞增殖，這可能是IH 引起膀胱不穩(wěn)定導(dǎo)致夜遺尿的重要原因；通過(guò)阻斷P2X3膀胱受體信號(hào)和AOF 干預(yù)后可顯著緩解逼尿肌的過(guò)度增殖；為進(jìn)一步觀察IH對(duì)逼尿肌細(xì)胞增殖和凋亡的作用機(jī)制及益智仁的調(diào)節(jié)作用，本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果顯示，IH組膀胱逼尿肌細(xì)胞的凋亡率顯著減低；通過(guò)阻斷P2X3膀胱受體信號(hào)和AOF 干預(yù)后，逼尿肌細(xì)胞的凋亡率均有顯著增高。這提示IH 主要是通過(guò)P2X3膀胱受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮作用；而AOF對(duì)膀胱細(xì)胞損害具有一定保護(hù)作用。

Figure 4.I/V curve of calcium channel current and voltage in human bladder detrusor in air control group and IH intervention group.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs air control group.圖4 人膀胱逼尿肌空氣對(duì)照組和IH干預(yù)組鈣通道電流電壓I/V曲線圖

Figure 5.Effect of different concentrations of AOF on calcium channels in human bladder detrusor cells.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs IH control group.圖5 不同濃度AOF對(duì)人膀胱逼尿肌鈣離子通道的調(diào)節(jié)作用

既往研究表明［11-12］，P2X3在膀胱上皮和逼尿肌上均有表達(dá)，P2X3mRNA 介導(dǎo)大多數(shù)中樞和外周感覺(jué)神經(jīng)元生理性或機(jī)械性刺激，并且睡眠狀態(tài)時(shí)尿感敏感度與膀胱不穩(wěn)定相關(guān)［13-15］。鈣離子能使肌肉舒張，低氧導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流受阻可導(dǎo)致肌肉不自主收縮，推測(cè)IH 神經(jīng)受體P2X3對(duì)鈣離子通道的影響可能是引發(fā)遺尿的關(guān)鍵因素，而Ca2+通道與膀胱不穩(wěn)定相關(guān)機(jī)制目前研究甚少。本研究通過(guò)膜片鉗檢測(cè)結(jié)果顯示，與空氣對(duì)照組細(xì)胞比較，IH組細(xì)胞鈣離子通道表達(dá)顯著減低；提示IH 可抑制鈣離子內(nèi)流減少膀胱細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步揭示AOF調(diào)節(jié)逼尿肌細(xì)胞增殖和凋亡的作用機(jī)制，本研究用不同濃度AOF 對(duì)IH 逼尿肌細(xì)胞模型進(jìn)行干預(yù)試驗(yàn)。結(jié)果表明，大劑量（100 mg/L）和中劑量（50 mg/L）細(xì)胞鈣離子通道電流與IH 組比較均有顯著增高，而小劑量AOF 干預(yù)組細(xì)胞與IH 組比較無(wú)顯著變化，提示AOF 對(duì)膀胱不穩(wěn)定的保護(hù)作用具有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。AOF 是祖國(guó)傳統(tǒng)中藥材，來(lái)源于姜科植物益智的干燥成熟果實(shí)?！侗静輦湟分杏涊dAOF能燥脾腎，補(bǔ)心腎。溫中進(jìn)食可縮小便，腎與膀胱相表里，益智辛溫固腎。鹽水炒，同烏藥等分，酒煮，山藥糊丸，鹽湯下，名縮泉丸。因此AOF 醇提物具有穩(wěn)定膀胱和調(diào)節(jié)內(nèi)分泌功能［16-17］。