馬冬雪，高維娟，劉真一，張紅軍，王嘉穎，董賢慧△

（1河北中醫(yī)學(xué)院，河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊 050091；2承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北承德 067000）

腦部出現(xiàn)老年斑是阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）的主要病理學(xué)標(biāo)志［1］，其核心成分是β-淀粉樣蛋白（amyloid-β peptide，Aβ）［2］，Aβ 是淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）水解代謝產(chǎn)生的［3］。去整合素金屬蛋白酶10（a disintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10）被認(rèn)為是APP 的非淀粉樣剪切中重要的分泌酶［4］，ADAM10的表達(dá)變化影響著AD的發(fā)生發(fā)展。

AD 患者的腦鐵水平異常升高［5-6］，異常增高的腦鐵啟動(dòng)機(jī)體級(jí)聯(lián)放大機(jī)制，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡［7］。降低增高的腦鐵是防治AD 的一個(gè)有效方法。鐵調(diào)素（hepcidin，HAMP）是近年來發(fā)現(xiàn)的鐵調(diào)節(jié)激素，但HAMP 是否通過調(diào)節(jié)AD 患者腦鐵代謝干預(yù)APP淀粉樣代謝通路，目前尚未見報(bào)道。

中醫(yī)認(rèn)為AD 發(fā)病是以腎虛精虧、氣血不足為本，痰瘀互結(jié)、濁毒內(nèi)生為標(biāo)的本虛標(biāo)實(shí)之證。根據(jù)中醫(yī)“標(biāo)本兼治”的治療原則，治療AD 應(yīng)補(bǔ)腎健脾，益氣養(yǎng)血以培其本，化痰、祛瘀、解毒以治其標(biāo)。本課題組前期研究顯示，應(yīng)用淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方可以有效上調(diào)AD 模型小鼠HAMP 的表達(dá)［8］，緩解小鼠腦組織鐵超載，下調(diào)AD 小鼠模型Aβ的表達(dá)和減少SP 的沉積［9］，但其具體機(jī)制仍然不明確。因此，本課題組以Aβ25-35誘導(dǎo)HT22細(xì)胞為AD細(xì)胞模型，采用免疫熒光、qPCR 和Western blot 方法檢測淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方介導(dǎo)HAMP 對(duì)小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22 細(xì)胞APP 水解中關(guān)鍵酶ADAM10 表達(dá)的影響，為揭示淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方防治AD的內(nèi)在機(jī)制提供參考資料。

材料和方法

1 細(xì)胞株

小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22 由河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

2 藥品、試劑及儀器

黃芪甲苷、淫羊藿苷和葛根素由南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司提供。DMEM 高糖培養(yǎng)液購自Gibco；Triton X-100 購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；ADAM10抗體購自Abcam；OPTI-MEM Amyloid Precursor?I（1×）購自Gibco；Lipofectamine?3000 購自Invitro?gen；Aβ25-35購自Sigma；CCK-8 試劑盒購自莊盟國際生物基因科技有限公司。

3 方法

3.1 HT22 細(xì)胞的培養(yǎng)、分組及處理 HT22 細(xì)胞復(fù)蘇后，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM 完全培養(yǎng)液放入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)即可傳代。取形態(tài)良好、對(duì)數(shù)生長期的HT22 細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Aβ25-35配制方法：將1 mg Aβ25-35溶于943 μL 三蒸水，配成1 000 μmol/L 母液，置于37℃培養(yǎng)箱孵育7 d，使之老化，分裝，于-20℃凍存。用Aβ 的活性片段Aβ25-35誘導(dǎo)HT22細(xì)胞建立AD細(xì)胞模型。

確定淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方作用濃度和沉默效果后，將HT22 細(xì)胞以每孔2×105個(gè)的密度接種于6 孔板，培養(yǎng)12 h 待細(xì)胞貼壁后隨機(jī)分為7組：正常對(duì)照組（不添加任何藥物的等體積的完全培養(yǎng)液）、Aβ 組（加入Aβ25-35處理HT22 細(xì)胞24 h 建立AD 細(xì)胞模型）、RNAi 組（HT22 細(xì)胞轉(zhuǎn)染HAMPsiRNA-3）、Aβ+RNAi 組（加入Aβ25-35處理HT22 細(xì)胞24 h 后轉(zhuǎn)染HAMP-siRNA-3）、Aβ+TCM 組（加入Aβ25-35處理HT22細(xì)胞24 h后加入淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方處理24 h）、RNAi+TCM 組（HT22 細(xì)胞轉(zhuǎn)染HAMP-siRNA-3 24 h 后加入淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方處理24 h）和Aβ+RNAi+TCM 組（加入Aβ25-35處理HT22 細(xì)胞24 h 后轉(zhuǎn)染HAMP-siRNA-3 24 h，然后加入淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方處理24 h）。根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)證明，以淫羊藿、黃芪、葛根提取的有效組分復(fù)方（淫羊藿苷、黃芪甲苷、葛根素成分按照3∶2∶2的比例用藥）。

3.2 CCK-8 法檢測淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方的細(xì)胞毒性 HT22 細(xì)胞以每孔2.5×103個(gè)的密度接種于96 孔板，用含10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方，3 種藥物的比例按其單體的物質(zhì)的量濃度確定為3∶2∶2，最終于藥物復(fù)方組分中取一定的量用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組和中藥組。中藥組設(shè)定藥物劑量分別為7.4、14.8、22.2、29.6 和37 mg/L，作用24 h 后，觀察細(xì)胞存活情況，在每孔中加入10 μL CCK-8 檢測試劑，避光，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，在多功能微孔板讀數(shù)儀中測定A450值，并計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A值?空白對(duì)照組A值）/（對(duì)照組A值?空白對(duì)照組A）×100%。另外根據(jù)研究，Aβ25-35理想造模濃度和處理時(shí)間分別為40 μmol/L和24 h［10］。

3.3HAMP基因沉默

3.3.1 siRNA 的設(shè)計(jì)、合成及轉(zhuǎn)染 siRNA 由中洪博元生物技術(shù)有限公司提供，根據(jù)HAMP基因在Gen-Bank 中的序列設(shè)計(jì)合成HAMPsiRNA，如表1所示。

表1 HAMP siRNA序列Table 1.The sequences of HAMP siRNA

將HT22 細(xì)胞接種在6 孔板上，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體操作按Lipofectamine?3000 轉(zhuǎn)染試劑操作說明書進(jìn)行。細(xì)胞分為：正常對(duì)照（control）組、NC（轉(zhuǎn)染siRNA 陰性對(duì)照）組、Si-1（轉(zhuǎn)染HAMP-siRNA-1）組、Si-2（轉(zhuǎn)染HAMP-siRNA-2）組和Si-3（HAMP-siRNA-3）組。轉(zhuǎn)染48 h 后做Western blot和qPCR驗(yàn)證。

3.3.2 qPCR和Western blot檢測HAMP表達(dá)水平按照試劑盒提取各組RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列見表2。PCR 條件為：95℃30 s→（95℃5 s→60℃30 s）×40 個(gè)循環(huán)。待測樣品的目的基因相對(duì)表達(dá)量用2?ΔΔCt表示。

表2 qPCR引物序列Table 2.Sequences of the primers for qPCR

提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA 法進(jìn)行蛋白定量。電泳后轉(zhuǎn)移到0.45 μm 的PVDF 膜上，5%牛奶封閉2 h，加入兔抗β-actin 和兔抗HAMP，4℃孵育過夜，洗膜。滴加相應(yīng)Ⅱ抗，室溫孵育1 h，洗膜顯影。采用ImageJ軟件分析測量灰度值。

3.4 免疫熒光、Western blot 和qPCR 檢測ADAM10的表達(dá) 將蓋玻片用多聚賴氨酸包被，分組處理后的細(xì)胞種植于包被好的玻片上，制備細(xì)胞爬片，然后進(jìn)行造模及給藥處理。細(xì)胞爬片采用4%多聚甲醛固定20 min；1% Triton X-100 破膜，Ⅰ抗孵育過夜；PBS 洗去Ⅰ抗后，滴加相應(yīng)Ⅱ抗，避光室溫孵育50 min；PBS 洗去Ⅱ抗后，滴加DAPI 染液，避光室溫孵育10 min，封片。每張片子隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行拍照，采用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析。

細(xì)胞處理后，收集各組處理后的HT22 細(xì)胞，使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白并采用BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品加入上樣緩沖液，100℃煮沸5 min 使其變性。離心（1 000×g，10 min）取上清液進(jìn)行SDS-PAGE。將電泳后分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h。TBST 清洗，加入相應(yīng)的Ⅰ抗，4℃過夜。TBST 清洗后加入Ⅱ抗，室溫下孵育2 h。TBST 清洗后ECL 顯影，于凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照。采用ImageJ軟件分析測量灰度值。

細(xì)胞處理后，收集各組處理后的HT22 細(xì)胞，使用PrimeScriptTMreagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用TaKaRa 的TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNase H Plus）試劑盒進(jìn)行，并用熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增和監(jiān)測，用2?ΔΔCt表示待測樣品目的基因相對(duì)表達(dá)量。ADAM10和內(nèi)參照GAPDH的引物序列見表3。

表3 qPCR引物序列Table 3.Sequences of the primers for qPCR

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）來表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度的淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方對(duì)細(xì)胞存活率的影響

在進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)之前，首先對(duì)淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方的細(xì)胞毒性進(jìn)行考察，與control 組相比，不同濃度（7.4、14.8、22.2、29.6 和37 mg/L）的淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方作用于細(xì)胞24 h后，均沒有引起顯著的細(xì)胞毒性，且各組細(xì)胞存活率無顯著性差異，故采取37 mg/L 的藥物濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖1。

Figure 1.Effect of traditional Chinese medicine（TCM；active components of Epimedium，Astragalus and Radix Puerariae）on HT22 cell survival rates.Mean±SD.n=6.圖1 淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方對(duì)HT22 細(xì)胞存活率的影響

2 siRNA對(duì)HT22細(xì)胞HAMP表達(dá)水平的影響

與control 組比較，NC 組HAMP 蛋白和mRNA 表達(dá)水平無顯著差異（P＞0.05），Si-1 組、Si-2 組和Si-3組HAMP 蛋白和mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與NC 組比較，Si-1 組、Si-2 組和Si-3 組HAMP蛋白和mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與Si-1組比較，Si-2 組和Si-3 組HAMP 蛋白和mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與Si-2 組比較，Si-3 組HAMP 蛋白和mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；其中HAMP siRNA-3 序列干擾效率最強(qiáng)，因此選用HAMP siRNA-3序列進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖2。

Figure 2.The effect of siRNA on the HAMP protein and mRNA expression levels in HT22 cells.A：the protein ex?pression of HAMP；B：the mRNA expression of HAMP.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs NC group；△P＜0.05 vs Si-1 group；▲P＜0.05 vs Si-2 group.圖2 siRNA 對(duì)HT22細(xì)胞HAMP 蛋白和mRNA 表達(dá)水平的影響

3 免疫熒光檢測ADAM10的表達(dá)

與control 組比較，Aβ 組、RNAi 組和Aβ+RNAi 組中的ADAM10蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與Aβ組比較，Aβ+RNAi 組中ADAM10 蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低（P＜0.05），Aβ+TCM 組中ADAM10 蛋白表達(dá)增高（P＜0.05）；與RNAi 組比較，Aβ+RNAi 組中的ADAM10蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），RNAi+TCM 組中的AD?AM10蛋白表達(dá)增高（P＜0.05）；與Aβ+RNAi組比較，Aβ+RNAi+TCM 組中的ADAM10 蛋白表達(dá)增高（P＜0.05），見圖3。

Figure 3.Effect of traditional Chinese medicine（TCM；active components of Epimedium，Astragalus and Radix Puerariae）on ADAM10 protein expression in HT22 cells induced by Aβ.Red：AMAM10；blue：DAPI.Scale bar=20 μm.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs Aβ group；△P＜0.05 vs RNAi group；▲P＜0.05 vs Aβ+RNAi group.圖3 淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方對(duì)Aβ誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞中ADAM10蛋白表達(dá)的影響

4 Western blot和qPCR檢測ADAM10的表達(dá)

Western blot結(jié)果及qPCR結(jié)果顯示，與control組比較，Aβ 組、RNAi 組和Aβ+RNAi 組中的ADAM10蛋白及mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05）；與Aβ 組比較，Aβ+RNAi 組中ADAM10 蛋白及mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05），Aβ+TCM 組中ADAM10蛋白及mRNA 表達(dá)增高（P＜0.05）；與RNAi 組比較，Aβ+RNAi 組中的ADAM10 蛋白及mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05），RNAi+TCM 組中的ADAM10 蛋白及mRNA 表達(dá)增高（P＜0.05）；與Aβ+RNAi 組比較，Aβ+RNAi+TCM 組中的ADAM10蛋白及mRNA表達(dá)增高（P＜0.05），見圖4。

討 論

AD 發(fā)病機(jī)制學(xué)說眾多［11］，包括Aβ 級(jí)聯(lián)學(xué)說、Tau蛋白學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說和金屬離子代謝紊亂學(xué)說等［12］。腦部出現(xiàn)老年斑是AD 的主要病理學(xué)標(biāo)志［13］，其核心成分是一種由39～43 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的小神經(jīng)肽Aβ。AD 中Aβ 的重要形式是Aβ1-40和Aβ1-42，Aβ 斑塊中主要的成分是Aβ1-42，它更易于聚集，有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，Aβ1-40是Aβ 主要的可溶性形式，主要存在于血液循環(huán)之中。Aβ25-35被認(rèn)為是Aβ1-42的活性片段，于37℃水浴箱孵育7 d 左右，即為“聚集”狀態(tài)［14］。因此，在本實(shí)驗(yàn)中我們采用Aβ25-35誘導(dǎo)細(xì)胞建立AD細(xì)胞模型。

Aβ 由其前體蛋白APP 水解代謝產(chǎn)生，在α、β 和γ 位使APP 發(fā)生裂解的蛋白酶分別稱之為α、β 和γ-分泌酶［15］，其中α-分泌酶是由整合素和金屬蛋白酶家族（a disintegrin and metalloprotease，ADAM）的成員ADAM9、ADAM10 和ADAM17 組成，所有成員都有相同的結(jié)構(gòu)域。ADAM10 是ADAM 家族中最早就確認(rèn)具有α-分泌酶功能的蛋白酶，是APP 的非淀粉樣剪切中重要的α-分泌酶。ADAM10 可以減少Aβ的形成增加其脫落，以及顯著減少淀粉樣蛋白的過度表達(dá)；相反，ADAM10表達(dá)的減少導(dǎo)致了淀粉樣蛋白形成增加的機(jī)會(huì)［16］。有報(bào)道顯示，中、重度AD 患者血液中ADAM10 的表達(dá)是降低的［17］。HT22 細(xì)胞是小鼠海馬神經(jīng)元永生化的細(xì)胞，具有神經(jīng)元的形態(tài)和功能，是近年來體外研究神經(jīng)退行性病變的常用細(xì)胞。本研究以Aβ25-35誘導(dǎo)HT22 細(xì)胞建立AD 細(xì)胞模型，研究結(jié)果顯示AD 細(xì)胞模型組中ADAM10表達(dá)降低。

Figure 4.Effect of TCM on ADAM10 protein and mRNA expres?sion in HT22 cells induced by Aβ.A：ADAM10 pro?tein expression was measured by Western blot；B：ADAM10 mRNA expression was measured by qPCR.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs Aβ group；△P＜0.05 vs RNAi group；▲P＜0.05 vs Aβ+RNAi group.圖4 淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方對(duì)Aβ 誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞中ADAM10表達(dá)的影響

APP 是一種典型的金屬蛋白，其5′端非翻譯區(qū)（5′-untranslational region，5′-UTR）帶有一個(gè)功能性的鐵反應(yīng)元件（iron-response element，IRE），鐵離子可通過5′-UTR 調(diào)控APP mRNA 的表達(dá)。鐵離子影響著APP 的表達(dá)及Aβ 的分泌和沉積［18］，AD 患者腦內(nèi)Aβ 的產(chǎn)生與多種鐵離子結(jié)合蛋白關(guān)系密切。鐵代謝相關(guān)蛋白包括二價(jià)Tf、TfR1、ferritin、FPN1、Ft?Mt、DMT1、IRPs 和HAMP 等，其中HAMP 是近年來發(fā)現(xiàn)的重要的鐵調(diào)節(jié)激素，是維持細(xì)胞內(nèi)正常鐵代謝的重要金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它精確調(diào)控鐵吸收、儲(chǔ)存和釋放過程［19］。HAMP 是由25 個(gè)氨基酸組成的多肽，主要在肝臟合成并成熟，隨后分泌到血液中，轉(zhuǎn)運(yùn)到它的主要靶器官包括小腸、肝臟、骨髓細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，控制這些器官的鐵代謝活動(dòng)。血液中HAMP 濃度增加，將抑制小腸上皮細(xì)胞鐵吸收蛋白的表達(dá)、進(jìn)而抑制小腸鐵吸收，同時(shí)增加肝臟細(xì)胞，骨髓細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對(duì)鐵的攝取，進(jìn)而增加鐵儲(chǔ)存和鐵利用。通過這一HAMP 介導(dǎo)的途徑，可有效緩解鐵超載；反之，HAMP敲除或者濃度降低，鐵的吸收會(huì)增加，而鐵的儲(chǔ)存和利用減少，造成鐵超載。但其對(duì)APP 水解的影響尚未見報(bào)到。因此，本實(shí)驗(yàn)以HAMP 為靶點(diǎn)，在AD 細(xì)胞模型中使HAMP基因沉默，觀察HAMP 對(duì)ADAM10 的影響。研究結(jié)果顯示，沉默HAMP可抑制ADAM10 的表達(dá)，說明HAMP 可調(diào)節(jié)APP 的水解，從而影響Aβ的產(chǎn)生。

中醫(yī)在抗癡呆方面有著豐富的臨床和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，中藥是我國的傳統(tǒng)瑰寶，有上千年的悠久歷史，在病理治療中以其多靶點(diǎn)和多效性等優(yōu)點(diǎn)有著巨大潛力。我們前期研究觀察，淫羊藿、黃芪、葛根有效組方可以有效緩解AD 模型小鼠腦組織鐵超載，明顯改善AD 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，下調(diào)AD 模型小鼠腦組織Aβ 的表達(dá)，其機(jī)制與淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方可以調(diào)節(jié)AD 模型小鼠腦組織FPN1、DMT1 和HAMP 等鐵代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)［20］，但具體機(jī)制仍然不明確。本實(shí)驗(yàn)在以往研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究淫羊霍、黃芪、葛根素有效成分組方干預(yù)Aβ 表達(dá)的內(nèi)在機(jī)制，研究結(jié)果顯示淫羊霍、黃芪、葛根素有效成分組方介導(dǎo)HAMP 上調(diào)AD 細(xì)胞模型AD?AM10的表達(dá)。

綜上所述，淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方可能通過調(diào)節(jié)HAMP 的表達(dá)，緩解腦細(xì)胞的鐵超載，促進(jìn)ADAM10 的表達(dá)，從而增強(qiáng)APP 的非淀粉樣代謝通路，減少Aβ 沉積，這也可能是淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方防治AD 的內(nèi)在機(jī)制。但本文只在細(xì)胞水平上初步探討了淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方介導(dǎo)HAMP 在APP 水解中的作用情況，而成功建立HAMP基因敲除小鼠，進(jìn)一步在動(dòng)物水平進(jìn)行驗(yàn)證是否對(duì)臨床有意義將是今后研究的方向。