喬建新，劉熙鵬，劉 明，曹 兵

（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北張家口 075000）

缺血性腦卒中約占腦卒中患者的80%，具有較高的致殘、致死率和復(fù)發(fā)率，恢復(fù)時間長且預(yù)后不理想。血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）是一種存在于血液循環(huán)和腦組織之間的特殊屏障，通過調(diào)控腦內(nèi)外物質(zhì)交換對維持腦神經(jīng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起到重要作用。缺血性腦卒中及實現(xiàn)血流再灌注后，活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（in?terleukin-1β，IL-1β）、IL-6 等炎癥因子大量釋放，將破壞BBB 結(jié)構(gòu)和通透性，是導(dǎo)致血管源性腦水腫而致殘、致死的重要因素［1-3］。因此，研究以保護(hù)BBB為靶向的藥物對降低腦缺血再灌注（ischemia-reper?fusion，I/R）損傷具有重要意義。

甲磺酸加貝酯（gabexate mesilate，GM）是一種非肽類蛋白酶抑制劑。既往有研究顯示，GM 能夠通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)對大鼠I/R 損傷的肝臟和小腸具有保護(hù)作用［4-5］，但GM 對I/R 損傷的腦組織是否具有保護(hù)作用的文獻(xiàn)報道尚不多見。尼莫地平（nimodipine，NMP）是一種鈣拮抗劑，可用于預(yù)防與治療缺血性腦血管病，也是腦I/R 相關(guān)動物實驗研究常用的陽性對照藥物。有研究表明，腦缺血早期給予NMP 對BBB 具有保護(hù)作用［6］。本實驗通過制備腦I/R 大鼠模型，以NMP 為陽性對照藥物，探討GM 對腦I/R大鼠BBB的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。

材料和方法

1 實驗動物

SPF 級Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠180 只，7周齡，體質(zhì)量（230±10）g，購自承德醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供［許可證號：SCXK（冀）2017-001］。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開展實驗研究，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（25±1）℃、相對濕度（60±5）%、12 h 光照黑暗交替，自由飲水進(jìn)食。

2 藥物與試劑

注射用GM（成都天臺山制藥有限公司；規(guī)格：0.1 g；批號：201906024）；注射用NMP（北京四環(huán)科寶制藥有限公司；規(guī)格：2 mg；批號：190531）；伊文思藍(lán)（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和丙二醛（malo?ndialdehyde，MDA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；TNF-α、IL-1β 和IL-6 ELISA 試劑盒（北京博奧森生物科技有限公司）；基質(zhì)金屬蛋白酶2（ma?trix metalloproteinase-2，MMP?2）、MMP?9、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和β-actin 單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；RNeasy Mini 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和OneStep RT-PCR 試劑盒（Qia?gen）。

3 實驗方法

3.1 動物分組、給藥與造模 （1）對180 只SD 大鼠進(jìn)行數(shù)字編碼后，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為6 組：假手術(shù)組（sham 組）、模型組（I/R 組）、NMP（2 mg·kg?1·d?1）組和GM（5、10 和20 mg·kg?1·d?1）組［藥物劑量選擇依據(jù)：根據(jù)人和大鼠藥物劑量換算公式，大鼠劑量（mg/kg）=6.3X（X 為人臨床劑量，單位：mg/kg），GM 人臨床使用劑量為100 mg/d，按照成人體重65 kg 計算，可得：GM 大鼠劑量為9.69 mg·kg?1·d?1，因此確定10 mg·kg?1·d?1為中劑量，另設(shè)5 mg·kg?1·d?1為低劑量，20 mg·kg?1·d?1為高劑量。同理，算得NMP大鼠劑量為1.16～2.33 mg·kg?1·d?1，并參照段晉寧等［7］報道的大鼠實驗劑量，確定NMP 組所用NMP劑量為2 mg·kg?1·d?1］，每組30 只。（2）精確稱取GM和NMP 粉針劑加入適量0.9%氯化鈉溶液制備濃度2.5、5和10 g/L的GM 溶液和濃度1 g/L的NMP溶液。造模前10 min，GM（5、10 和20 mg·kg?1·d?1）組腹腔注射濃度2.5、5 和10 g/L 的GM 溶液，NMP（2 mg·kg?1·d?1）組給予濃度1 g/L 的NMP 溶液，假手術(shù)組和模型組給予0.9%氯化鈉溶液，注射劑量均為2 mL/kg。（3）腦I/R 模型制備［8］：造模手術(shù)前12 h 禁食不禁水，實施麻醉后沿頸部正中切口、鈍性剝離右側(cè)頸總動脈和頸外、頸內(nèi)動脈，夾閉頸總動脈并結(jié)扎頸外動脈后，由頸外動脈切口插入直徑0.235 mm 的線栓進(jìn)入頸內(nèi)動脈，遇阻力止（深度距分叉處約18 mm），固定線栓后逐層縫合皮膚并擦拭碘伏進(jìn)行消毒處理；假手術(shù)組除不在頸外動脈切口和插入線栓外，其余同模型組。再灌注6 h后行各指標(biāo)檢測。

3.2 Longa 評分法檢測大鼠神經(jīng)功能 各組隨機(jī)選取10 只大鼠，參照Longa 評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分［9］∶大鼠神態(tài)、動作正常計0 分；缺血對側(cè)前爪不能伸展計1分；爬行時向缺血對側(cè)轉(zhuǎn)圈行走計2 分；向缺血對側(cè)傾倒計3 分；不能爬行計4 分。Longa 評分越高則說明大鼠神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

3.3 BBB通透性檢測 參照邱珂等［10］報道的伊文思藍(lán)滲透法檢測BBB 通透性：評分完成后的各組10 只大鼠，以4 mL/kg 劑量尾靜脈注射2%的伊文思藍(lán)溶液；1 h后麻醉，實施心臟灌注300 mL 0.9%氯化鈉溶液后斷頭、取右側(cè)大腦；研磨勻漿后加入3 倍量甲酰胺溶液，60℃孵育24 h 后3 000 r/min 離心10 min（離心半徑15 cm），取上清液；然后通過酶標(biāo)儀測定610 nm 波長處的吸光度（A）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算伊文思藍(lán)含量，腦組織伊文思藍(lán)含量可反映BBB通透性。

3.4 腦組織含水量檢測 各組隨機(jī)選取10只大鼠，頸椎脫臼處死后斷頭取腦，去除小腦和腦干，沖洗干凈并用濾紙拭干后稱重，即為濕重（W1）；置于95℃烘箱24 h 后稱重，即為干重（W2）。腦組織含水量（%）=（W1?W2）/W1×100%

3.5 腦組織生化指標(biāo)檢測 各組隨機(jī)選取10 只大鼠，頸椎脫臼處死后斷頭取腦，切取右側(cè)大腦組織置冰上，剪碎后加入9 倍量4℃預(yù)冷裂解液，研磨得到腦組織勻漿液。經(jīng)4 500×g離心10 min 后（離心半徑15 cm）取上清液，然后按照各試劑盒操作步驟，通過生化分析法檢測SOD 和GSH-Px 活性及MDA 含量；通過ELISA 試劑盒檢測TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量。

3.6 RT-PCR 法檢測腦組織MMP-2、MMP-9 和NFκB 的mRNA 表達(dá) 取0.1 g 腦組織，采用RNeasy Mini 試劑盒分離純化總RNA，通過核酸分析儀檢測RNA 濃度和純度后，遵照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。遵照OneStep RT-PCR 試劑盒操作說明進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，程序設(shè)置為：94℃15 s，55℃30 s，70 ℃30 s，共40 個循環(huán)。將PCR 產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳并顯影、拍照。以β-actin 為內(nèi)參照，半定量計算目的基因的相對表達(dá)量。所用引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Table 1.The sequences of the primers used in RT-PCR

3.7 Western blot 法檢測腦組織MMP-2、MMP-9 和NF-κB 蛋白表達(dá) 取腦組織勻漿液，4℃、16 000×g離心20 min 后取上清液，通過總蛋白提取試劑盒提取總蛋白、BCA 法檢測總蛋白含量后，上樣（20 μg 總蛋白）、行凝膠電泳（當(dāng)樣品指示劑到達(dá)分離膠時電壓由80 V 變?yōu)?20 V）、冰上轉(zhuǎn)膜（電壓100 V，時間1 h），5%脫脂牛奶室溫封閉1 h 后，滴加兔抗鼠MMP?2、MMP?9 和NF-κB 單克隆抗體，4℃過夜，TBST 溶液洗膜后滴加II 抗，室溫孵育1 h，TBST 洗膜后ECL顯色，通過凝膠成像儀獲得條帶；以β-actin 為內(nèi)參照，以條帶灰度值半定量MMP?2、MMP?9和NF-κB蛋白表達(dá)量。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠神經(jīng)功能測定結(jié)果

通過Longa評分檢測各組大鼠神經(jīng)功能，結(jié)果顯示，與sham 組比較，I/R 組大鼠Longa 評分顯著升高（P＜0.01）；與I/R 組比較，GM（10 和20 mg·kg?1·d?1）組和NMP（2 mg·kg?1·d?1）組Longa 評分顯著降低（P＜0.01）；與NMP（2 mg·kg?1·d?1）組比較，GM（20 mg·kg?1·d?1）組Longa評分顯著降低（P＜0.05），見圖1。

Figure 1.The nerve function of the rats in each group measured by Longa scoring method.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs sham group；△△P＜0.01 vs I/R group；#P＜0.05 vs NMP（2 mg·kg?1·d?1）group.圖1 各組大鼠神經(jīng)功能測定結(jié)果

2 各組大鼠BBB通透性測定結(jié)果

伊文思藍(lán)滲透實驗結(jié)果顯示，與sham 組比較，I/R 組大鼠BBB 通透性顯著升高（P＜0.01）；與I/R 組比較，GM（10 和20 mg·kg?1·d?1）組和NMP（2 mg·kg?1·d?1）組BBB 通透性顯著降低（P＜0.01）；與NMP（2 mg·kg?1·d?1）組比較，GM（20 mg·kg?1·d?1）組BBB通透性顯著降低（P＜0.05），見圖2。

3 各組大鼠腦組織含水量測定結(jié)果

與sham 組比較，I/R 組大鼠腦組織含水量顯著升高（P＜0.01）；與I/R 組比較，GM（10 和20 mg·kg?1·d?1）組及NMP（2 mg·kg?1·d?1）組腦組織含水量降低（P＜0.05 或P＜0.01）；GM（20 mg·kg?1·d?1）組腦組織含水量與NMP（2 mg·kg?1·d?1）組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

4 各組大鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)測定結(jié)果

與sham 組比較，I/R 組大鼠腦組織SOD 和GSHPx 活性顯著降低，MDA 含量顯著升高（P＜0.01）；與I/R 組比較，GM（10 和20 mg·kg?1·d?1）組和NMP（2 mg·kg?1·d?1）組腦組織SOD 和GSH-Px 活性顯著升高，MDA 含量顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）；與NMP（2 mg·kg?1·d?1）組比較，GM（20 mg·kg?1·d?1）組SOD 活性顯著升高，MDA 含量顯著降低（P＜0.05），但兩組間GSH-Px活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

Figure 2.The BBB permeability of the rats in each group mea?sured by Evans blue permeation method.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs sham group；△△P＜0.01 vs I/R group；#P＜0.05 vs NMP（2 mg·kg?1·d?1）group.圖2 各組大鼠BBB通透性測定結(jié)果

Figure 3.The brain water content of the rats in each group.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs sham group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs I/R group.圖3 各組大鼠腦組織含水量測定結(jié)果

5 各組大鼠腦組織炎癥反應(yīng)指標(biāo)測定結(jié)果

與sham 組比較，I/R 組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β和IL-6 含量顯著升高（P＜0.01）；與I/R 組比較，GM（10 和20 mg·kg?1·d?1）組和NMP（2 mg·kg?1·d?1）組TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）；與NMP（2 mg·kg?1·d?1）組比較，GM（20 mg·kg?1·d?1）組TNF-α含量顯著降低（P＜0.05），但兩組間IL-1β 和IL-6 含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖5。

Figure 4.Determination results of oxidative stress indexes in brain tissue of the rats in each group.A：the activity of SOD；B：the ac?tivity of GSH-Px；C：the content of MDA.Mean±SD. n=10.**P＜0.01vs sham group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs I/R group；#P＜0.05 vs NMP（2 mg·kg?1·d?1）group.圖4 各組大鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)測定結(jié)果

Figure 5.Measurement results of inflammatory response indexes in brain tissue of the rats in each group.A：the content of TNF-α；B：the content of IL-1β；C：the content of IL-6.Mean±SD. n=10.**P＜0.01vs sham group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs I/R group；#P＜0.05 vs NMP（2 mg·kg?1·d?1）group.圖5 各組大鼠腦組織炎癥反應(yīng)指標(biāo)測定結(jié)果

6 各組大鼠腦組織MMP-2、MMP-9 和NF-κB 的mRNA表達(dá)檢測結(jié)果

與sham 組比較，I/R 組大鼠腦組織MMP?2、MMP?9和NF-κB 的mRNA 表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）；與I/R 組比較，GM（10 和20 mg·kg?1·d?1）組和NMP（2 mg·kg?1·d?1）組MMP?2、MMP?9 和NF-κB mRNA 表達(dá)下調(diào)（P＜0.01）；與NMP（2 mg·kg?1·d?1）組比較，GM（20 mg·kg?1·d?1）組MMP?2、MMP?9和NF-κB 的mRNA 表達(dá)下調(diào)（P＜0.01），見圖6。

7 各組大鼠腦組織MMP-2、MMP-9和NF-κB 蛋白表達(dá)檢測結(jié)果

與sham 組比較，I/R 組大鼠腦組織MMP-2、MMP-9和NF-κB蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）；與I/R組比較，GM（10 和20 mg·kg?1·d?1）組和NMP（2 mg·kg?1·d?1）組MMP?2、MMP?9 和NF-κB 蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05 或P＜0.01）；與NMP（2 mg·kg?1·d?1）組比較，GM（20 mg·kg?1·d?1）組MMP?2、MMP?9和NF-κB蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），見圖7。

討 論

BBB 是以內(nèi)皮細(xì)胞為核心并依靠星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、周細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等提供結(jié)構(gòu)和功能支持，在細(xì)胞間輔以緊密連接蛋白復(fù)合體（tight junc?tion protein systerm，TJPs）而形成的生理性屏障［11］，能夠阻止有害物質(zhì)由血液進(jìn)入腦組織，從而保證腦組織穩(wěn)態(tài)。其中，TJPs 由跨膜蛋白、胞質(zhì)附著蛋白、細(xì)胞骨架蛋白等相互作用形成，對維持BBB 結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要［12］。

Figure 6.The mRNA expression levels of MMP?2，MMP?9 and NF-κB in brain tissue of the rats in each group detected by RT-PCR.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs sham group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs I/R group；##P＜0.01 vs NMP（2 mg·kg?1·d?1）group.圖6 RT-PCR檢測各組大鼠腦組織MMP?2、MMP?9和NF-κB的mRNA表達(dá)水平

Figure 7.The protein expression levels of MMP?2，MMP?9 and NF-κB in brain tissue of the rats in each group detected by Western blot.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs sham group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs I/R group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs NMP（2 mg·kg?1·d?1）group.圖7 Western blot檢測各組大鼠腦組織MMP?2、MMP?9和NF-κB蛋白表達(dá)水平

缺血性腦卒中及實現(xiàn)再灌注后，缺血區(qū)線粒體能量代謝障礙、呼吸鏈?zhǔn)茏瓒T發(fā)ROS 大量產(chǎn)生以及炎癥因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 大量釋放［13-14］，導(dǎo)致以ROS 為底物的抗氧化酶SOD 和GSH-Px 被過度消耗，使機(jī)體ROS 代謝失衡而過剩蓄積，攻擊核酸、蛋白等大分子物質(zhì)生成具有毒性的MDA［15］。此外，Wang等［16］的研究顯示，ROS攻擊細(xì)胞膜而破壞細(xì)胞骨架，降解跨膜蛋白和胞質(zhì)附著蛋白而破壞TJPs，從而破壞BBB 結(jié)構(gòu)；He 等［17］和陸正齊［18］的研究表明，炎癥因子TNF-α 和IL-1β 能夠刺激中性粒細(xì)胞等進(jìn)一步產(chǎn)生和釋放炎癥因子，從而誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)；炎癥反應(yīng)能夠?qū)е耇JPs 結(jié)構(gòu)損壞，并且TNF-α 和IL-1β 能夠活化NF-κB 而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子［細(xì)胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、血管細(xì)胞粘附分子（vascular cell adhesion molecule，VCAM）等］上調(diào)表達(dá)，進(jìn)而增加BBB 通透性；IL-6 則能夠刺激ROS 大量釋放，從而加重ROS所造成的損傷。閆磊等［19］的研究顯示，通過給藥抑制腦I/R 大鼠炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，能夠降低BBB 通透性并減輕腦缺血再灌注損傷；何平平等［20］的研究表明，通過藥物干預(yù)保護(hù)腦I/R大鼠TJPs結(jié)構(gòu)能夠有效降低BBB 通透性并緩解腦水腫，減輕腦缺血再灌注損傷。本實驗結(jié)果顯示，GM 干預(yù)能夠有效降低腦I/R 大鼠神經(jīng)功能Longa 評分，抑制氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)，下調(diào)NF-κB 轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，降低BBB 通透性，減輕腦水腫，并且20 mg·kg?1·d?1劑量的GM 對神經(jīng)功能和BBB 通透性的保護(hù)作用及對氧化應(yīng)激指標(biāo)、炎癥因子、NF-κB 轉(zhuǎn)錄與表達(dá)的調(diào)控作用均優(yōu)于NMP，提示GM 可能通過抑制氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)對腦I/R 大鼠BBB 和神經(jīng)功能起到保護(hù)作用。

細(xì)胞外基質(zhì)也是BBB 的重要組成部分，MMP 在催化降解細(xì)胞外基質(zhì)以維持其合成-消化降解平衡中起著關(guān)鍵作用，并且MMP?2 和MMP?9 能夠消化降解跨膜蛋白和內(nèi)皮細(xì)胞基底層而破壞BBB 結(jié)構(gòu)［21］。劉菡等［22］和宋俊科等［23］的研究通過藥物干預(yù)下調(diào)MMP?2和MMP?9表達(dá)能夠保護(hù)腦I/R大鼠BBB，進(jìn)而減輕腦缺血再灌注損傷。本實驗結(jié)果顯示，GM 干預(yù)能夠有效抑制腦I/R 大鼠腦組織MMP?2 和MMP?9的mRNA 及蛋白表達(dá)上調(diào)，并且20 mg·kg?1·d?1劑量的GM 對MMP?2和MMP?9 mRNA 及蛋白表達(dá)的調(diào)控作用優(yōu)于NMP。這可能是GM 保護(hù)腦I/R 大鼠BBB的另一機(jī)制。

綜上所述，本研究證實了GM 對腦I/R 大鼠BBB和神經(jīng)功能具有保護(hù)作用，其潛在機(jī)制可能是抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)以及下調(diào)MMP?2、MMP?9 和NF-κB 蛋白表達(dá)。本研究為GM 作為腦I/R 損傷防治藥物提供了實驗依據(jù)。