陽(yáng) 創(chuàng)，薛 萊，吳 陽(yáng)，邱紅梅，蔣青松△

（1重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016；2江油市人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)部，四川江油 621700；3中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院心血管中心，廣東深圳 518107）

糖尿病是全球高發(fā)的慢性疾病之一。2019年全球糖尿病患者已達(dá)4 億多人；據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟估計(jì)，至2045 年，這個(gè)數(shù)字會(huì)上升到7 億［1］。血管病變是糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，也是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的首要因素之一［2］。糖尿病血管并發(fā)癥包括微血管并發(fā)癥如糖尿病視網(wǎng)膜病、糖尿病心肌病和糖尿病腎病等，大血管并發(fā)癥有中風(fēng)、冠心病和外周血管疾病等［3］。糖尿病血管病變的參與因素眾多，血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)損傷從而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙是其關(guān)鍵的病理生理基礎(chǔ)［4］。

乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）引起的內(nèi)皮依賴性血管舒張是檢測(cè)血管內(nèi)皮功能的重要指標(biāo)，其功能障礙是血管內(nèi)皮損傷的初始表現(xiàn)之一［5］?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，長(zhǎng)期全身慢性低水平炎癥是促進(jìn)糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要因素。通過(guò)不同信號(hào)通路，炎癥反應(yīng)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，引起內(nèi)皮功能障礙［6］。核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答及腫瘤形成等多種過(guò)程。NF-κB 調(diào)控與炎癥有關(guān)的基因，在糖尿病及其并發(fā)癥中有重要作用［7］。內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種血管活性物質(zhì)以維持正常的血管功能，包括舒血管物質(zhì)如一氧化氮（nitric oxide，NO）、前列環(huán)素（prostacyclin，PGI2）和內(nèi)皮衍生超極化因子等，及縮血管物質(zhì)如內(nèi)皮素-1、血管緊張素Ⅱ和血栓烷A2（thromboxane A2，TXA2）等［8］。其中，NO 和PGI2/TXA2是最為重要的調(diào)控因素之一。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase，COX-2）是NF-κB 的重要下游因子，也是NO 水平和PGI2/TXA2平衡調(diào)節(jié)的關(guān)鍵酶。目前對(duì)NF-κB-iNOS/COX-2 信號(hào)通路的研究主要集中在炎癥和腫瘤等方面［9］，對(duì)于其在糖尿病內(nèi)皮損傷的研究較少，對(duì)高糖條件下內(nèi)皮依賴性血管舒張中的作用目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。

本研究擬采用高糖孵育大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)建立糖尿病血管內(nèi)皮損傷模型［10］，分別給予NF-κB、iNOS和COX-2 抑制劑，觀察ACh 誘導(dǎo)內(nèi)皮依賴性血管舒張作用的變化，以探討NF-κB-iNOS/COX-2 信號(hào)通路在糖尿病內(nèi)皮損傷早期的作用。

材料和方法

1 動(dòng)物

SD 大鼠，SPF 級(jí)，體重250～260 g，雌雄各半，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SYXK（渝）2012-0001。

2 主要試劑

苯腎上腺素（phenylephrine，PE）購(gòu)自上海禾豐制藥有限公司（批號(hào)H31021175）；ACh、二硫代氨基甲酸吡咯烷（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）、S-甲基異硫脲硫酸鹽（S-methylisothiourea sulfate，SMT）和BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自江蘇省碧云天生物技術(shù)研究所；美洛昔康（meloxicam）購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Supermix 和PCR 引物購(gòu)自TaKaRa；兔抗大鼠phospho-NF-κB p65 單克隆抗體購(gòu)自Cell Signal?ing Technology；兔抗大鼠iNOS 多克隆抗體購(gòu)自Ab?cam；兔抗大鼠COX-2 多克隆抗體購(gòu)自Proteintech；兔抗大鼠β-actin多克隆抗體購(gòu)自博奧森生物科技公司；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Thermo。其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

3 方法

3.1 內(nèi)皮依賴性血管舒張功能的檢測(cè)［10］將SD 大鼠脫頸處死后立即取出胸主動(dòng)脈，制成長(zhǎng)3～4 mm的血管環(huán)，置于含20 mL Krebs 液［成分（mmol/L）：NaCl 119，CaCl22.5，KCl 4.7，MgSO41.2，KH2PO41.2，NaHCO325，glucose 11，pH 7.4］的浴槽中37℃保溫，持續(xù)通以0.95 O2+0.05 CO2混合氣體。血管張力經(jīng)張力傳感器（5 g，中國(guó)北京航天醫(yī)學(xué)工程研究所）連接于BL-420S 生物信號(hào)處理系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司），靜息負(fù)荷1 g。每隔15 min 更換Krebs液1次，平衡60 min后加入PE 1 μmol/L 預(yù)收縮血管，達(dá)到坪值并穩(wěn)定后，加入ACh 30 μmol/L 驗(yàn)證內(nèi)皮的完整性（舒張率大于60%認(rèn)為內(nèi)皮功能完好）。換液，平衡30 min 后，再次用PE 預(yù)收縮血管。達(dá)到相似收縮坪值后，移除PE。然后將血管環(huán)置于不同條件（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)分組）的Krebs液中孵育6 h后，Krebs液清洗移去藥物，再次給予PE 收縮血管，達(dá)到孵育前相似收縮坪值并穩(wěn)定后，按濃度梯度法給予ACh（0.5對(duì)數(shù)單位遞增，0.001～30 μmol/L），觀察血管環(huán)的舒張作用，計(jì)算血管最大舒張效應(yīng)（Emax，血管最大舒張作用與PE 收縮力的百分比）和pD2（ACh 產(chǎn)生50%Emax濃度的負(fù)對(duì)數(shù)）。

實(shí)驗(yàn)共分為5 組：正常糖（normal glucose，NG）組：葡萄糖11 mmol/L，加入甘露醇44 mmol/L 調(diào)節(jié)滲透壓；高糖（high glucose，HG）組：葡萄糖55 mmol/L；NF-κB 抑制劑PDTC（1 μmol/L）組、iNOS 抑制劑SMT（10 μmol/L）組和COX-2 抑制劑美洛昔康（100 μmol/L）組：高糖培養(yǎng)并加入相應(yīng)抑制劑。每組重復(fù)6次。

3.2 HE 染色和電鏡觀察 將不同條件孵育血管環(huán)4 %多聚甲醛固定24 h，梯度濃度乙醇和二甲苯脫水，石蠟包埋，作3～5 μm冠狀切片，HE染色，于高倍鏡下觀察血管組織形態(tài)學(xué)變化。

或戊二醛固定2 h，磷酸液漂洗，鋨酸液固定后，用不同濃度乙醇和丙酮脫水、包埋，烘箱過(guò)夜。用超薄切片機(jī)作50～60 nm 切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡下觀察血管超微結(jié)構(gòu)變化。

3.3 RT-qPCR 檢測(cè)mRNA 的表達(dá) 取液氮凍存血管組織，按照RNAiso Plus Total RNA 提取試劑說(shuō)明書(shū)的操作程序提取總RNA。參照GenBank 中大鼠基因序列，由重慶醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)引物，經(jīng)TaKaRa 生物技術(shù)公司合成并驗(yàn)證（引物序列見(jiàn)表1）。按照TaKaRa Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)條件為：95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。以β-actin 為內(nèi)參照，對(duì)熒光強(qiáng)度達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)（即Ct值）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。根據(jù)相對(duì)定量公式進(jìn)行計(jì)算。每組重復(fù)3次。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

3.4 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 血管組織液氮冷凍后勻漿提取總蛋白，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。取30 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 分離，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入Ⅰ抗［β-actin（1∶5 000）、phospho-NF-κB p65（1∶1 000）、COX-2（1∶500）和iNOS（1∶500）］，4℃過(guò)夜；洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗（1∶3 000），洗膜后用ECL 發(fā)光試劑顯影，用Image Lab 軟件進(jìn)行圖像分析。以目標(biāo)蛋白與β-actin條帶的灰度比值表示蛋白表達(dá)的相對(duì)水平。每組重復(fù)3次。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用Excel和GraphPad Prism 5.01 等軟件作圖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 高糖對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)的損傷及PDTC的作用

HE 染色和電鏡觀察結(jié)果顯示，正常組的血管結(jié)構(gòu)清晰完整，血管平滑肌細(xì)胞排列整齊，內(nèi)皮細(xì)胞完整平坦，內(nèi)外彈力層連接緊密；高糖組孵育6 h后，血管結(jié)構(gòu)破壞，內(nèi)皮細(xì)胞受損、腫脹，內(nèi)彈性膜斷裂，內(nèi)層平滑肌細(xì)胞排列疏松紊亂；給予PDTC（1 μmol/L）后，血管形態(tài)顯著改善，平滑肌細(xì)胞排列較整齊，內(nèi)皮細(xì)胞損傷減輕，見(jiàn)圖1。

2 不同抑制劑對(duì)高糖損傷ACh 血管內(nèi)皮依賴性舒張作用的影響

高糖孵育6 h 后，HG 組血管環(huán)的PE 收縮力與NG 組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）；但在高糖環(huán)境下，ACh誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮依賴性舒張明顯減弱，其Emax和pD2均顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖2、表2。

不同抑制劑與高糖共孵育后，PE 的收縮力亦無(wú)明顯變化（P＞0.05）；但PDTC（1 μmol/L）、SMT（10 μmol/L）和美洛昔康（100 μmol/L）均明顯改善高糖損傷的血管內(nèi)皮依賴性舒張功能，其Emax和pD2均顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)圖3、表2。

3 PDTC 對(duì)高糖條件下大鼠胸主動(dòng)脈NF-κB p65、iNOS和COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

與NG 組比較，高糖孵育后NF-κB p65、iNOS 和COX-2 的mRNA 和蛋白水平均顯著上調(diào)（P＜0.01）；給予PDTC（1 μmol/L）后，與HG 組比較，NF-κB p65、iNOS和COX-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平則顯著下降（P＜0.01），見(jiàn)圖4、5。

討 論

Figure 1.The histopathological changes of rat aortic ring.A：HE staining（×400）；B：electron microscope（×7 000）.The black ar?rows indicated endothelium.圖1 大鼠胸主動(dòng)脈組織的病理變化

由于胰島素分泌絕對(duì)/相對(duì)不足，高糖血癥是糖尿病患者的主要特征，常伴特異性大血管和微血管并發(fā)癥。血管病變?cè)谔悄虿〖捌洳l(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。研究已經(jīng)表明，持續(xù)高糖狀態(tài)會(huì)損傷血管內(nèi)皮，出現(xiàn)血管內(nèi)皮功能障礙［11］。本研究中，與相同滲透壓的正常濃度（11 mmol/L）葡萄糖組相比，高濃度（55 mmol/L）葡萄糖使ACh 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮依賴性舒張功能明顯下降至（16.73±6.81）%水平，遠(yuǎn)低于內(nèi)皮完整的60%的標(biāo)準(zhǔn)，提示血管內(nèi)皮功能嚴(yán)重受損，且該損傷作用不是由于滲透壓增加引起。同時(shí)，病理觀察也證實(shí)高糖破壞了血管內(nèi)皮的正常結(jié)構(gòu)；另外，高糖對(duì)PE 所誘導(dǎo)的血管收縮沒(méi)有明顯影響，提示本實(shí)驗(yàn)條件下，高糖可能未損傷血管的收縮功能。大量研究認(rèn)為，內(nèi)皮功能紊亂和缺失是糖尿病血管病變的主要危險(xiǎn)因素。因此，深入研究高糖條件下血管內(nèi)皮損傷的參與因素和相關(guān)信號(hào)通路的作用，對(duì)于糖尿病及其并發(fā)癥的防治具有重要意義。

Figure 3.The effects of different inhibitors on the impaired endothelium-dependent relaxation induced by acetylcholine（ACh）under high glucose（HG）condition.A：the typical traces of the dose-response relationship for ACh-induced relaxation of rat aor?ta；B：the dose-response curves of ACh on aortic rings.Mean±SD. n=6.#P＜0.05，##P＜0.01 vs HG group.圖3 不同抑制劑對(duì)高糖損傷乙酰膽堿內(nèi)皮依賴性舒張血管作用的影響

表2 不同抑制劑對(duì)高糖損傷內(nèi)皮依賴性血管舒張的影響Table 2.The effects of different inhibitors on Emax and pD2 of acetylcholine-induced endothelium-dependent relaxation under high glu?cose（HG）condition（Mean±SD. n=6）

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥是引起血管壁改變，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙的重要因素。糖尿病時(shí)，持續(xù)高血糖狀態(tài)使晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation endproducts，AGEs）增加，AGEs 與內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞上的RAGE 受體結(jié)合，激活NF-κB，上調(diào)腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）等多種細(xì)胞因子的表達(dá)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡和炎癥，引發(fā)血管疾病［12-13］。NF-κB 是多條炎癥通路的交匯點(diǎn)，與多種炎癥相關(guān)紊亂的發(fā)生關(guān)系密切。生理情況下，NF-κB以無(wú)活性形式存在于胞漿中。病理狀態(tài)下，NF-κB迅速活化并移位至胞核，啟動(dòng)一系列炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。NF-κB p65 蛋白是NF-κB 的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄亞基之一，p65/p50異源二聚體是NF-κB最常見(jiàn)的活化形式。Kassan 等［14］的研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB 活化損傷了糖尿病小鼠的血管功能，但NF-κB 對(duì)高糖作用內(nèi)皮依賴性舒張影響的研究較少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖預(yù)孵育后，血管組織NF-κB p65的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高，而NF-κB 抑制劑PDTC 下調(diào)其mRNA 和蛋白表達(dá)同時(shí)，也明顯恢復(fù)ACh 誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張功能，改善高糖損傷的血管結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果提示，對(duì)于糖尿病初期內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生，NF-κB的活化可能也有重要作用。

Figure 4.The effect of PDTC on the mRNA expression of NF-κB p65，iNOS and COX-2 in rat thoracic aorta under high glucose（HG）condition.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs NG group；##P＜0.01 vs HG group.圖4 PDTC對(duì)高糖作用下大鼠胸主動(dòng)脈NF-κB p65、iNOS及COX-2 mRNA表達(dá)的影響

Figure 5.The effect of PDTC on the protein levels of p-NF-κB p65，iNOS and COX-2 in the rat thoracic aorta under high glucose（HG）condition.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs NG group；##P＜0.01 vs HG group.圖5 PDTC對(duì)高糖作用下大鼠胸主動(dòng)脈p-NF-κB p65、iNOS及COX-2蛋白水平的影響

NF-κB 不僅調(diào)節(jié)重要炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，也干預(yù)炎癥反應(yīng)相關(guān)因子的合成，如iNOS 和COX-2［15］。正常情況下，iNOS 在血管內(nèi)皮細(xì)胞低水平表達(dá)。但在炎癥等病理狀態(tài)時(shí)，iNOS 表達(dá)水平明顯增高，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)生成大量NO。過(guò)量的NO 與超氧陰離子（·O2?）結(jié)合，生成過(guò)氧亞硝基陰離子，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，損傷血管內(nèi)皮［16］。與iNOS 相似，生理狀態(tài)下，COX-2在多數(shù)組織不表達(dá)，但受到細(xì)胞因子、感染等因素誘導(dǎo)時(shí)，表達(dá)上調(diào)。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞COX-2 表達(dá)上調(diào)，PGI2合成酶活性下降；同時(shí)，TXA2釋放增加［17］。PGI2/TXA2二者平衡失調(diào)是導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性舒張功能下降的重要因素。雖然已經(jīng)證實(shí)，iNOS和COX-2是NF-κB重要的下游效應(yīng)因子，但對(duì)于三者在高糖作用內(nèi)皮依賴性舒張中的關(guān)系目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。本研究中，高糖使內(nèi)皮依賴性舒張功能顯著降低同時(shí)，iNOS 及COX-2 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著上升；NF-κB抑制劑PDTC改善內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能，并下調(diào)iNOS 及COX-2 的mRNA 和蛋白表達(dá)，提示iNOS 和COX-2 可能也介導(dǎo)了高糖激活NF-κB 損傷血管內(nèi)皮的作用。值得注意的是，選擇性iNOS 抑制劑SMT 和COX-2 抑制劑美洛昔康均只能部分恢復(fù)ACh 誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張作用，提示iNOS 和COX-2 相關(guān)信號(hào)通路作用共同參與高糖損傷的內(nèi)皮依賴性舒張功能。另外，PDTC 也不能完全恢復(fù)高糖損傷的內(nèi)皮依賴性舒張，提示除了NFκB-iNOS/COX2 通路之外，可能還有其他機(jī)制參與高糖血癥血管內(nèi)皮依賴性舒張的調(diào)控。

綜上所述，本研究結(jié)果提示NF-κB-iNOS/COX-2通路參與了高糖損傷血管內(nèi)皮依賴性舒張的作用。該通路的激活在糖尿病內(nèi)皮損傷早期可能有關(guān)鍵作用，對(duì)該通路各靶點(diǎn)的干預(yù)對(duì)于糖尿病血管病變的防治可能有重要意義。但由于糖尿病血管病變發(fā)生參與因素的復(fù)雜性，高糖損傷血管內(nèi)皮依賴性舒張的調(diào)控機(jī)制仍然需要更進(jìn)一步的研究。