徐佳琪，安美玲，袁 月，郝翊帆，王秀文，張 敏，未曉巍，2，李 華，王仁俊△

（吉林師范大學(xué) 1生命科學(xué)學(xué)院，2植物資源科學(xué)與綠色生產(chǎn)吉林省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林四平 136000）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）能夠引發(fā)多種系統(tǒng)病變，造成極高的致殘率和致死率。截止到2013年，我國(guó)成人糖尿病患病率已經(jīng)達(dá)到10.4%，預(yù)計(jì)到2045 年，全球18～99 歲的糖尿病患者將增長(zhǎng)至6.93億［1-2］，可見(jiàn)，糖尿病的防控工作迫在眉睫。近年來(lái)，關(guān)于糖尿病的研究工作大多圍繞糖脂代謝通路展開(kāi)，而在中樞調(diào)控機(jī)制方面的探索研究則十分匱乏。交感神經(jīng)過(guò)度激活參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，加速了慢性心衰［3-5］和2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes melli?tus，T2D）［6-7］的惡化。據(jù)報(bào)道，γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，GABA）［8］和神經(jīng)型一氧化氮合酶（neuro?nal nitric oxide synthase，nNOS）［9］等介導(dǎo)糖尿病狀態(tài)下對(duì)室旁核（paraventricular nucleus，PVN）神經(jīng)元興奮性的調(diào)節(jié)。糖尿病狀態(tài)下，大鼠PVN 神經(jīng)元膜功能是否改變及引起膜功能發(fā)生變化的相關(guān)機(jī)制仍不明確。

細(xì)胞膜上的小電導(dǎo)鈣激活鉀通道（small-conduc?tance calcium-activated potassium channels，SK chan?nels）介導(dǎo)動(dòng)作電位后超極化的發(fā)生，按不同亞基的結(jié)構(gòu)和功能分為SK1～4共4種類(lèi)型，相應(yīng)的編碼基因?yàn)镵CNN1（potassium intermediate/small conductance calcium-activated channel，subfamily N，member 1）、KCNN2、KCNN3及KCNN4。研究發(fā)現(xiàn)，PVN 和視上核（supraoptic nucleus，SON）內(nèi)SK3 高豐度表達(dá)［10］；PVN 內(nèi)SK 通道參與調(diào)控大鼠交感神經(jīng)活性［11-12］。目前未有研究報(bào)道PVN 內(nèi)SK 通道是否參與糖尿病的發(fā)生發(fā)展。

近期研究顯示，微小RNA（microRNA，miRNA，miR）參與T2D中胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和血糖水平的調(diào)節(jié)等過(guò)程，T2D 患者外周血中多種miRNA 的表達(dá)水平隨疾病發(fā)展而改變［13］，但miRNA 是否參與T2D 的中樞發(fā)病機(jī)制還未見(jiàn)研究報(bào)道。本課題組利用Tar?getScan 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-9-5p 與KCNN3 mRNA 的3′UTR 具有結(jié)合位點(diǎn)。miRNA 表達(dá)譜分析顯示大鼠PVN 內(nèi)miR-9 表達(dá)頗豐［14］，且T2D 患者血漿miR-9 表達(dá)顯著上調(diào)［13］。然而，T2D 大鼠PVN 內(nèi)miR-9是否同樣存在差異表達(dá)，進(jìn)一步失衡的miR-9-5p 能否影響SK3 蛋白水平，并引發(fā)交感神經(jīng)興奮亢進(jìn)和血糖調(diào)節(jié)紊亂，仍不明確。故本實(shí)驗(yàn)以T2D 大鼠為研究對(duì)象，觀察PVN 內(nèi)miR-9-5p 和SK3 表達(dá)水平，并進(jìn)一步闡明二者參與T2D 大鼠中樞交感神經(jīng)活動(dòng)的調(diào)控機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物

Wistar 大鼠，雄性，180～220 g，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)為SCXK（吉）2011-0004。置于恒溫（23±2）℃，12 h/12 h 明暗周期的環(huán)境中喂養(yǎng)。

2 儀器及試劑

miR-9-5p和KCNN3基因過(guò)表達(dá)和敲減腺相關(guān)病毒均由上海漢恒生物科技有限公司構(gòu)建和包裝；血漿甘油三酯ELISA試劑盒（Abcam）；瘦素及去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）ELISA 試劑盒（IBL）；胰島素（insulin）ELISA 試劑盒（北京索萊寶）；Trizol 試劑盒（北京鼎國(guó)）。血糖儀（Invitrogen）；腦立體定位儀（Narishige，SR-5M-HT）等。

3 主要方法

3.1 構(gòu)建T2D 大鼠模型 將大鼠隨機(jī)分為2 組，2型糖尿病模型（DM）組給予高脂飲食（high-fat diet，HFD），4周后腹腔注射低劑量（30 mg/kg）鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ），誘導(dǎo)其產(chǎn)生高血糖癥狀，予以HFD 繼續(xù)飼養(yǎng)8 周；糖尿病對(duì)照（diabetes control，DC）組始終飼以正常飲食。喂養(yǎng)期間對(duì)大鼠體重及食物攝入量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

3.2 血漿葡萄糖和胰島素水平的檢測(cè) 對(duì)待測(cè)大鼠禁食12 h，將斷尾法獲取的血液置于含EDTA 的EP 管中，用血糖儀快速檢測(cè)大鼠空腹血糖濃度，空腹胰島素水平則按照ELISA 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。采血完畢進(jìn)行糖耐量實(shí)驗(yàn)，按2 g/kg體重給予大鼠口服葡萄糖，給藥2 h后按相同方法檢測(cè)上述兩種指標(biāo)水平。計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)：胰島素抵抗指數(shù)=空腹血糖×空腹血胰島素/22.5。

3.3 PVN 微量注射 STZ 注射8周后，通過(guò)腦立體定位儀將麻醉大鼠頭部固定，參照Paxinos&Watson大鼠腦圖譜定位下丘腦PVN（前囟向后1.8 mm，旁開(kāi)0.5 mm，深7.2 mm），使用牙科鉆鉆開(kāi)顱骨，將連接微量注射器的導(dǎo)管以1 mm/min 的速度插入PVN內(nèi)，按每30 s 0.2 μL 的速度連續(xù)推注5 min，每側(cè)導(dǎo)管內(nèi)共裝有2 μL 的rAAV2/9-hSyn-EGFP-miR-9-5p（1.5×1013vg/L），和/或rAAV2/9-hSyn-EGFP-sponge（miR-9-5p）（1.5×1013vg/L），或rAAV2/9-hSyn-EGFP-（NC miR-9-5p）（1.5×1013vg/L），或rAAV2/9-hSyn-EGFP-（NC sponge-miR-9-5p）（1.5×1013vg/L），和/或rAAV2/9-hSyn-EGFP-KCNN3 shRNA （siKCNN3）（1.5×1013vg/L），或 rAAV2/9-hSyn-EGFP-KCNN3 shRNA（NC siKCNN3）（1.5×1013vg/L），和/或2.5 μL的 rAAV2/9-hSyn-siKCNN3-P2A-EGFP （9×109vg/side），或rAAV2/9-hSyn-（NC siKCNN3）-P2A-EGFP（9×109vg/side），注射結(jié)束后留針10 min，避免病毒隨導(dǎo)管抽離流出，抽離速度同樣按1 mm/min進(jìn)行，注射完畢封閉鉆孔，縫合皮膚，注射抗生素避免感染。需要對(duì)同1只大鼠PVN內(nèi)注射2種重組腺相關(guān)病毒時(shí)，兩次輸注間隔2 h 進(jìn)行。病毒注射4 周后檢測(cè)各干預(yù)組結(jié)果。

3.4 尿NE 排出量的測(cè)量 STZ 干預(yù)8 周后，將全部大鼠分別置于代謝籠內(nèi)，24 h后收集排出的尿液，裝入含有礦物油的收集管中防止蒸發(fā)，尿液離心后，將上清液轉(zhuǎn)移到含有HCl 的離心管中，置于?80℃條件下儲(chǔ)存。使用NE ELISA 檢測(cè)試劑盒測(cè)定解凍后尿液內(nèi)NE濃度。尿NE排出量=尿NE濃度×尿流量。

3.5 交感驅(qū)動(dòng)指標(biāo)的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)前各組大鼠需禁食12 h，腹腔注射α-氯醛糖（70 mg/kg）和烏拉坦（0.75 g/kg）進(jìn)行麻醉，仰臥位固定，分離出股動(dòng)脈進(jìn)行插管，連接壓力換能器，再將麻醉大鼠俯臥于手術(shù)臺(tái)上，固定后分離其腎交感神經(jīng)，經(jīng)多道生理記錄儀同步獲取大鼠標(biāo)Ⅱ?qū)?lián)心電圖、平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure，MAP）和腎交感神經(jīng)放電（renal sympathetic nerve discharge，RSND）活動(dòng)。

3.6 血液采集及生化指標(biāo)檢測(cè) 暴露麻醉大鼠心臟，于右心耳處剪一小口，迅速采集血液，將收集到的血液裝入離心管內(nèi)，室溫靜置30 min 后，3 000 r/min 離心15 min，留取血清樣本，將樣本分裝并保存于?80℃條件下待測(cè)，避免反復(fù)凍融。血漿甘油三酯、NE 及瘦素水平均通過(guò)ELISA 法進(jìn)行測(cè)定，操作流程嚴(yán)格遵照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

3.7 PVN 組織的提取 對(duì)含PVN 組織的連續(xù)6 張腦片進(jìn)行取樣，每側(cè)PVN 打孔6 次，即每張切片取樣12次，得到PVN組織準(zhǔn)備待測(cè)。

3.8 免疫熒光檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá) 取血完畢在大鼠心尖處入針，插入左心室，先后使用肝素鹽水（約250 mL）和4%多聚甲醛（約250 mL）對(duì)大鼠進(jìn)行灌流，觀察大鼠尾部及四肢僵硬程度，判斷灌流是否成功。灌流完畢取出大腦，置于裝有4%多聚甲醛的15 mL 離心管內(nèi)，4℃條件下固定4 h，然后將大腦依次轉(zhuǎn)移到含20%和30%的蔗糖溶液中梯度脫水，待沉降后取出，用吸水紙小心吸干大腦表面水分，經(jīng)包埋劑包埋，置于?80℃冰箱冷凍。使用冰凍切片機(jī)切片，得到厚度為35 μm 的切片，收集含有PVN 組織的冠狀切片，確定PVN 區(qū)域及注射位點(diǎn)。將得到的腦切片在PBS 溶液中展開(kāi)，挑取帶有PVN 組織的切片置于含PBS 的24 孔板中，洗片后轉(zhuǎn)移到含封閉液（PBS+10%羊血清）的EP 管內(nèi)，37℃封閉1.5 h；沖洗切片，加入I抗，置于37℃培養(yǎng)箱孵育2 h；取出切片，沖洗后避光孵育熒光II 抗，此后操作均在暗環(huán)境下進(jìn)行，同樣在37℃條件下孵育2 h。取出的腦片采用PBS 溶液清洗，沖洗3 次，每次5 min，沖洗后貼片，封片完畢用錫紙包裹，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)移至熒光顯微鏡下檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)。

3.9 real-time PCR 檢 測(cè)miR-9-5p 和KCNN3 mRNA的表達(dá)水平 Trizol 法對(duì)待測(cè)組織內(nèi)總RNA 進(jìn)行抽提，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以U6 和GAPDH 分別作為miR-9-5p 和KCNN3 的內(nèi)參照進(jìn)行real-time PCR，引物序列見(jiàn)表1。檢測(cè)miR-9-5p 的擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性12 s，62℃退火40 s，40 個(gè)循環(huán)。檢測(cè)KCNN3 mRNA 的擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性15 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。

3.10 TargetScan 軟件預(yù)測(cè)KCNN3 mRNA 與miR-9-5p 的相互作用 通過(guò)TargetScan 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)可能影響KCNN3 mRNA 轉(zhuǎn)錄后翻譯的miRNA，分析KCNN3 mRNA與miR-9-5p是否具有靶標(biāo)關(guān)系。

3.11 原代培養(yǎng)乳鼠下丘腦神經(jīng)細(xì)胞和NG108 細(xì)胞 培養(yǎng)過(guò)程在無(wú)菌條件下進(jìn)行，從新生Wistar 鼠（24 h 內(nèi)）下丘腦分離出神經(jīng)細(xì)胞，采用MEM 培養(yǎng)液進(jìn)行體外原代培養(yǎng)。將NG108細(xì)胞接種到含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基內(nèi)補(bǔ)充有HAT（hypoxanthine-aminopterin-thymidine；1%）、鏈霉素（100 mg/L）及青霉素（1×105U/L），接種后置于含5% CO2的培養(yǎng)箱中，保證箱內(nèi)氣體環(huán)境濕潤(rùn)，在37℃條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合率大于85%時(shí)加入胰酶?jìng)鞔?/p>

表1 用于real-time PCR的引物序列Table 1.The sequences of the primers used for real-time PCR

3.12 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-9-5p 將待轉(zhuǎn)染的原代神經(jīng)細(xì)胞和NG108 細(xì)胞分別置于6 孔板培養(yǎng)，并隨機(jī)分組，包括空白對(duì)照組、miR-9-5p 轉(zhuǎn)染組、miR-9-5p+antimiR-9-5p轉(zhuǎn)染組和NC miR-9-5p陰性對(duì)照組，在細(xì)胞融合率達(dá)70%時(shí)，使用agomiR-9-5p（50 nmol），和/或antagomiR-9-5p（100 nmol），或NC agomiR-9-5p（50 nmol）對(duì)NG108 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后，檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組SK3蛋白的表達(dá)水平。

3.13 Western blot 檢測(cè)SK3 的蛋白水平 將蛋白提取緩沖液分別與PVN 組織、原代神經(jīng)細(xì)胞和NG108細(xì)胞混合，超聲破碎后置于離心機(jī)內(nèi)，離心8 min（4℃、12 000 r/min），取上清。BCA 法確定總蛋白濃度。調(diào)整合適蛋白濃度，加入等量的2×4%SDS樣品緩沖液。將蛋白樣本注入SDS-PAGE 凝膠中進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，獲取膠板上的目的蛋白，采用“三明治法”將其轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉，4℃過(guò)夜。加入I抗4℃孵育過(guò)夜，經(jīng)TBS洗滌3次，每次10 min 后，于暗室中使用熒光素標(biāo)記的Ⅱ抗進(jìn)行孵育，1 h 后洗膜TBS 洗滌（3 次，每次10 min），最后對(duì)膜進(jìn)行掃描拍照和分析。蛋白表達(dá)量通過(guò)目標(biāo)蛋白強(qiáng)度與GAPDH強(qiáng)度的比值來(lái)計(jì)算、統(tǒng)計(jì)及分析。

3.14 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 用real-time PCR擴(kuò)增miR-9-5p 與KCNN3 序列上的結(jié)合片段，將該片段插入到pMIR-REPORT 螢光素酶載體中，構(gòu)建KCNN3 野生質(zhì)粒；用KCNN3 野生質(zhì)粒，分別與agomiR-9-5p，和/或antagomiR-9-5p，或NC agomiR-9-5p 共轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞。48 h 后，根據(jù)Dual-Luci?ferase?報(bào)告基因試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組螢光素酶活性，驗(yàn)證miR-9-5p與KCNN3 mRNA的靶向關(guān)系。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）的形式表示。兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 T2D大鼠模型的鑒定

將HFD 聯(lián)合STZ 誘導(dǎo)12 周的DM 組大鼠生理指標(biāo)與DC組大鼠進(jìn)行比較。與DC組相比，DM 大鼠的體重、腹膜后脂肪墊和腎臟重量均顯著增加（P＜0.05）；棕色脂肪組織含量明顯降低（P＜0.05）。DM大鼠血漿甘油三酯、瘦素及空腹血糖水平明顯上調(diào)（P＜0.05），并出現(xiàn)糖耐量異常，DM 大鼠胰島素敏感性指數(shù)有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）。DM 大鼠的RSND 和尿NE 水平顯著增加（P＜0.05），見(jiàn)表2。以上結(jié)果表明DM 大鼠表現(xiàn)出高血糖、高血脂癥、胰島素抵抗和交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)狀態(tài)，證明T2D模型構(gòu)建成功。

2 TargetScan 軟件預(yù)測(cè)miR-9-5p 與KCNN3 存在靶向調(diào)節(jié)關(guān)系

TargetScan 軟件預(yù)測(cè)KCNN3 mRNA 的3′UTR 上存在兩段miR-9-5p 的靶序列，具有多個(gè)堿基互補(bǔ)位點(diǎn)，表明miR-9-5p 可能參與調(diào)控KCNN3 mRNA 的轉(zhuǎn)錄后翻譯，且在人類(lèi)、大鼠和小鼠間高度保守，見(jiàn)表3。

3 Real-time PCR結(jié)果

與DC 組相比，DM 大鼠PVN 內(nèi)miR-9-5p 的表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖1A，而KCNN3 mRNA水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見(jiàn)圖1B。

4 PVN 內(nèi)微量注射miR-9-5p、anti-miR-9-5p、NC miR-9-5p 和NC anti-miR-9-5p 對(duì)2 型糖尿病大鼠交感驅(qū)動(dòng)指標(biāo)和空腹血糖的影響

微量注射rAAV-miR-9-5p 至DC 和DM 大鼠PVN內(nèi)，導(dǎo)致RSND、NE 及血糖水平明顯增加（P＜0.05）；微量注射anti-miR-9-5p 則得到完全相反的結(jié)果，使交感活動(dòng)受到抑制，下調(diào)NE 及血糖水平（P＜0.05），見(jiàn)圖2。與DC 組相比，DM 組大鼠對(duì)病毒干預(yù)的反應(yīng)更為強(qiáng)烈，呈現(xiàn)出增敏狀態(tài)，提示miR-9-5p水平升高可能參與T2D發(fā)病過(guò)程。

5 PVN 內(nèi)微量注射KCNN3、siKCNN3、NC KCNN3和NC siKCNN3 對(duì)2 型糖尿病大鼠交感驅(qū)動(dòng)指標(biāo)和空腹血糖的影響

微注射rAAV-KCNN3 至DC 和DM 大鼠PVN 內(nèi)，可以顯著抑制交感活動(dòng)、降低大鼠血糖水平（P＜0.05）；rAAV 敲減PVN 內(nèi)KCNN3則會(huì)引起交感激活及血糖增高（P＜0.05），見(jiàn)圖3。與DC組相比，DM 大鼠對(duì)微量注射的反應(yīng)更為敏感，提示KCNN3 水平上調(diào)有助于改善T2D的血糖和交感神經(jīng)興奮狀態(tài)。

表2 DM組與DC組大鼠解剖學(xué)和交感驅(qū)動(dòng)生理學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果Table 2.The indexes of anatomy and sympathetic drive in the DM and DC rats（Mean±SEM）

表3 miR-9-5p與KCNN3 mRNA 3′UTR的互補(bǔ)序列Table 3.The complementary sequences between miR-9-5p and the 3′UTR of KCNN3 mRNA

Figure 1.Up-regulated miR-9-5p inhibited KCNN3 expression in PVN of the rats with T2D.A：relative expression of miR-9-5p in PVN of DC and DM rats；B：the mRNA expression of KCNN3 in PVN of DC and DM rats；C：the protein expression of SK3 in PVN and SON of DC and DM rats；D：verification of interaction between miR-9-5p and the 3′-UTR of rat KCNN3 gene in HEK293 cells was determined by luciferase reporter assay.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs DC group；?P＜0.05 vs null group.圖1 T2D大鼠PVN中上調(diào)的miR-9-5p抑制KCNN3表達(dá)

6 免疫熒光檢測(cè)FosB和SK3陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量

微量注射miR-9-5p 至DC 組和DM 組大鼠PVN內(nèi)，導(dǎo)致FosB 陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量顯著增加（P＜0.05），見(jiàn)圖4A、C；SK3 陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少（P＜0.05），見(jiàn)圖4B、D；與DC組相比，miR-9-5p干預(yù)誘發(fā)DM 大鼠PVN 內(nèi)FosB 和SK3 陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量變化的幅度更大，見(jiàn)圖4。

7 Western blot檢測(cè)SK3蛋白的表達(dá)水平

與DC 組相比，DM 組大鼠PVN 內(nèi)SK3 蛋白的表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.05），然而SON 內(nèi)未見(jiàn)SK3 的差異表達(dá)（P＞0.05），見(jiàn)圖1C。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-9-5p 至原代神經(jīng)細(xì)胞或NG108 細(xì)胞均能夠顯著抑制細(xì)胞內(nèi)SK3 蛋白的表達(dá)（P＜0.05）；加入anti-miR-9-5p 后能夠有效解除miR-9-5p 對(duì)KCNN3 mRNA 表達(dá)的阻遏，提升SK3 蛋白水平，NC miR-9-5p 孵育對(duì)SK3 蛋白表達(dá)無(wú)顯著影響（P＞0.05），見(jiàn)圖5。

8 螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-9-5p 和KCNN3的靶向關(guān)系

miR-9-5p 顯著降低KCNN3 mRNA 3′UTR 的螢光素酶活性（P＜0.05），見(jiàn)圖1D。結(jié)果顯示miR-9-5p靶向調(diào)控KCNN3的mRNA表達(dá)。

9 注射位點(diǎn)的鑒定

本文僅展示DM 和DC 大鼠PVN 注射miR-9-5p及KCNN3 mRNA 的位點(diǎn)鑒定結(jié)果。切片的組織學(xué)數(shù)據(jù)顯示，切片內(nèi)共有56 次注射，其中48 次注射到PVN 內(nèi)，8 次偏離PVN，見(jiàn)圖6。注射偏離所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果作為解剖學(xué)陰性對(duì)照。

討 論

本研究在體實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，T2D 大鼠PVN 內(nèi)miR-9-5p 的表達(dá)顯著上調(diào)、SK3 蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)；PVN 內(nèi)過(guò)表達(dá)miR-9-5p 明顯下調(diào)SK3 的蛋白水平、增加FosB 陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量，引起交感神經(jīng)興奮性亢進(jìn)，升高血糖水平；PVN 過(guò)表達(dá)KCNN3 或轉(zhuǎn)染anti-miR-9-5p 均能有效抑制交感興奮并降低血糖水平，DM 組對(duì)干預(yù)的反應(yīng)強(qiáng)于DC 組。本研究離體實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：在原代腦神經(jīng)細(xì)胞或NG108 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-9-5p 可顯著抑制SK3 蛋白的表達(dá)，轉(zhuǎn)染antimiR-9-5p 可有效降低miR-9-5p 對(duì)SK3 蛋白表達(dá)的抑制作用。結(jié)果提示miR-9-5p 很可能通過(guò)抑制KCNN3 mRNA 的轉(zhuǎn)錄后翻譯，進(jìn)一步下調(diào)PVN 內(nèi)SK3 蛋白水平，最終導(dǎo)致T2D 大鼠交感神經(jīng)過(guò)度激活和血糖水平升高。本研究為糖尿病的防治工作提供了新的靶點(diǎn)和新策略。

Figure 2.The effects of microinjection of miR-9-5p，anti-miR-9-5p，NC miR-9-5p and NC anti-miR-9-5p in PVN of rats with T2D on the sympathetic drive indexes and fasting plasma glucose.A：mean arterial pressure（MAP）；B：heart rate（HR）；C：re?nal sympathetic nerve diacharge（RSND）；D：plasma norepinephrine（NE）；E：original tracings of MAP and RSND；F：fasting plasma glucose.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs null group；?P＜0.05 vs miR-9-5p group；?P＜0.05 vs miR-9-5p+antimiR-9-5p group；#P＜0.05 vs DC+null group.圖2 PVN 內(nèi)微量注射miR-9-5p、anti-miR-9-5p、NC miR-9-5p 和NC anti-miR-9-5p 對(duì)2 型糖尿病大鼠交感驅(qū)動(dòng)指標(biāo)和空腹血糖的影響

Figure 3.The effects of microinjection of KCNN3，siKCNN3，NC KCNN3 and NC siKCNN3 in PVN in rats with T2D on the sympathetic drive indexes and fasting plasma glucose.A：mean arterial pressure（MAP）；B：heart rate（HR）；C：renal sympathetic nerve diacharge（RSND）；D：plasma norepinephrine（NE）；E：original tracings of MAP and RSND；F：fasting plasma glucose.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs null group；?P＜0.05 vs KCNN3 group；?P＜0.05 vs KCNN3+siKCNN3 group；#P＜0.05 vs DC+null group.圖3 PVN內(nèi)微量注射KCNN3、siKCNN3、NC KCNN3和NC siKCNN3對(duì)2型糖尿病大鼠交感驅(qū)動(dòng)指標(biāo)和空腹血糖的影響

Figure 4.Effects of microinjection of miR-9-5p，anti-miR-9-5p，NC miR-9-5p and NC anti-miR-9-5p on the number of FosB and SK3 positive cells in PVN in rats with T2D.A：the number of FosB positive cells in the PVN；B：the number of SK3 posi?tive cells in the PVN；C：the immunofluorescence photomicrographs from the sections of the PVN region stained for FosB in DC and DM rats；D：the immunofluorescence photomicrographs from the sections of the PVN region stained for SK3 in DC and DM rats.The scale bar=50 μm.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs null group；?P＜0.05 vs miR-9-5p group；?P＜0.05 vs miR-9-5p+anti-miR-9-5p group；#P＜0.05 vs DC+null group.圖4 微量注射miR-9-5p、anti-miR-9-5p、NC miR-9-5p和NC anti-miR-9-5p對(duì)2型糖尿病大鼠PVN 內(nèi)FosB 及SK3陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量的影響

近年來(lái)，大量研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體內(nèi)miRNA 水平的改變是影響糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要因素［15］。然而，就中樞miRNA 參與心血管疾病自主神經(jīng)調(diào)控的相關(guān)探索十分匱乏，即心衰大鼠PVN 內(nèi)miR-133a 下調(diào)會(huì)使血管緊張素原和血管緊張素II 型1 型受體表達(dá)增加，引起交感興奮［16］；我們前期研究發(fā)現(xiàn)慢性心衰大鼠PVN 內(nèi)miR-7b 抑制PVN 內(nèi)GABBR1 表達(dá)，從而促使交感過(guò)度激活［17］。值得注意的是，近期有研究表明T2D患者外周血漿miR-9水平升高，本研究觀察到的PVN內(nèi)升高的miR-9-5p是內(nèi)源性的還是由外周血穿過(guò)血腦屏障引起的還未可知。由此，升高的miR-9-5p 的來(lái)源還有待進(jìn)一步研究。另外，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ捅憩F(xiàn)出高血脂癥、β細(xì)胞功能損害及胰島素抵抗等特征，將來(lái)可以將檢測(cè)miR-9-5p 水平對(duì)幾種特征的直接影響作為研究目的，探索miR-9-5p 水平失衡與T2D發(fā)病機(jī)制間的更多關(guān)聯(lián)。

Figure 5.The effect of miR-9-5p，anti-miR-9-5p and NC miR-9-5p on the protein expression of SK3 in primarily cultured neonatal rat hypothalamus neurons and NG108 cells.A：the protein expression of SK3 in the primarily cultured neonatal rat hypothala?mus neurons；B：the protein expression of SK3 in the NG108 cells.Mean±SEM. n=6. *P＜0.05 vs null group；?P＜0.05 vs miR-9-5p group.圖5 miR-9-5p轉(zhuǎn)染對(duì)原代培養(yǎng)新生大鼠下丘腦神經(jīng)細(xì)胞和NG108細(xì)胞內(nèi)SK3蛋白表達(dá)量的影響

Figure 6.Schematic drawings of rat hypothalamus PVN in coronal section.The distance（in mm）posterior to bregma is shown for each section.“●”represent the sites of termination of an injection that is within the PVN region in DC group；“+”repre?sent that in DM group.3V：the third cerebral ventricle；AHP：anterior hypothalamic area，posterior part；AHC：anterior hypothalamic area，central part.圖6 大鼠下丘腦PVN微量注射位點(diǎn)鑒定示意圖

交感神經(jīng)興奮亢進(jìn)是T2D 患者的一項(xiàng)重要病理特征，PVN 是下丘腦內(nèi)控制交感傳出的關(guān)鍵核團(tuán)，免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，DM 組大鼠PVN 內(nèi)FosB 陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量較DC 組明顯增加，表明中樞神經(jīng)被慢性激活［18］。微量注射miR-9-5p到PVN顯著上調(diào)兩組大鼠的FosB 水平，引起血漿NE 和RSND 升高，提示miR-9-5p 過(guò)表達(dá)可促進(jìn)中樞交感神經(jīng)系統(tǒng)慢性激活。SK 通道作為調(diào)控交感神經(jīng)活動(dòng)的重要功能蛋白在PVN 和SON 內(nèi)高度表達(dá)，本研究結(jié)果顯示DM大鼠PVN 內(nèi)SK3 水平顯著低于DC 組，提示PVN 內(nèi)SK3 表達(dá)下調(diào)可能在T2D 大鼠交感激活中發(fā)揮作用。在體實(shí)驗(yàn)和離體實(shí)驗(yàn)均表明過(guò)表達(dá)或敲減miR-9-5p分別降低或增加SK3 蛋白水平，同時(shí)改變大鼠交感神經(jīng)興奮狀態(tài)，證實(shí)PVN 內(nèi)miR-9-5p 與糖尿病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。另有研究表明，部分miRNA在T2D 和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后的表達(dá)圖譜相反，例如具有抗炎作用的miR-192 和miR-24 等［13］，表明運(yùn)動(dòng)的抗炎特性可能對(duì)T2D 患者有益，而運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是否能夠調(diào)節(jié)miR-9-5p 水平，能否對(duì)miR-9-5p 的中樞作用產(chǎn)生影響，這將是我們后續(xù)的研究課題。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)HFD 聯(lián)合STZ 誘導(dǎo)T2D 大鼠PVN 內(nèi)miR-9-5p 和SK3 蛋白表達(dá)失衡可誘發(fā)交感神經(jīng)過(guò)度激活和血糖水平升高，這種作用可能與miR-9-5p 通過(guò)抑制KCNN3 mRNA 的轉(zhuǎn)錄后翻譯，進(jìn)一步下調(diào)PVN 內(nèi)SK3 蛋白水平有關(guān)。本研究為糖尿病的防控和治療提供了全新的干預(yù)靶點(diǎn)、途徑和策略。