陳玄晶，吳炳鑫，吳煥林，徐丹蘋

（1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，2廣東省中醫(yī)院，廣東廣州 510020；3北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100700）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是眾多心血管疾病的病理基礎(chǔ)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其引發(fā)的重要臟器缺血性功能障礙已成為全球人類死亡的首要原因。WHO 最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，每年全球約1 790 萬人死于AS 所致的心腦血管疾病，約占全球死亡的31%，并且發(fā)病率仍持續(xù)增長(zhǎng)。目前他汀類等降脂藥物為臨床治療AS 的一線藥物，但研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期口服此類藥物容易引起橫紋肌溶解、腎衰等不良反應(yīng)，以及部分他汀不耐受患者無法超越6%原則［1-2］，因此尋找更加有效低毒的抗AS 藥物具有重大意義。中藥在這方面顯示出明顯優(yōu)勢(shì)，其組合協(xié)同作用和較低副作用的特點(diǎn)使其成為抗AS替代療法研究的熱點(diǎn)。

膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)（reverse cholesterol transport）是指外周組織過量膽固醇經(jīng)由高密度脂蛋白（high-densi?ty lipoprotein，HDL）介導(dǎo)，通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，最終排出體外的過程［3］。膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)是體內(nèi)維持膽固醇代謝的經(jīng)典途徑，可有效防止膽固醇在肝外組織累積，促進(jìn)動(dòng)脈血管壁膽固醇酯和游離膽固醇的清除，在AS的防治中發(fā)揮重要作用［4］。

中醫(yī)證候調(diào)研顯示，痰證在現(xiàn)代炎癥性疾病中占比高［5-6］，同時(shí)血脂代謝異常已明確為中醫(yī)痰證的物質(zhì)基礎(chǔ)之一［7-9］。溫膽湯（Wendan decoction）是中醫(yī)化痰的經(jīng)典代表方，其始載于《千金要方》，被后世醫(yī)家廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐。近年相關(guān)研究顯示，加減溫膽湯干預(yù)有效抑制AS性病變的進(jìn)展［10-11］。本團(tuán)隊(duì)前期對(duì)溫膽湯及其類方的系列研究表明，溫膽湯能夠調(diào)節(jié)異常血脂代謝，改善AS 性心臟病患者臨床癥狀及預(yù)后［12-14］。本研究基于高脂飼料喂養(yǎng)的載脂蛋白E 基因敲除（apolipoprotein E gene knockout，ApoE?/?）小鼠AS疾病模型，從膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)角度探討溫膽湯抗AS 的作用機(jī)制，以期為溫膽湯的臨床應(yīng)用提供更加全面的科學(xué)依據(jù)，并為進(jìn)一步開發(fā)靶點(diǎn)明確的抗AS中藥新制劑奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 動(dòng)物

SPF 級(jí)8 周齡ApoE?/?雄性小鼠75 只，SPF 級(jí)8 周齡C57BL/6 雄性小鼠15 只，體重（25±2）g。小鼠購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，飼養(yǎng)于廣東省中醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF 級(jí)動(dòng)物房，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（22±2）℃，濕度為50%～60%，所有小鼠均可自由進(jìn)食和飲水。人工控制室內(nèi)照明，保持12 h 光照和黑暗交替循環(huán)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SYXK（粵）2018-0094。本研究經(jīng)廣東省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

普通飼料由廣東省中醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。高脂飼料（含15%豬油、2%膽固醇和0.05%膽酸）購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2 主要試劑和儀器

法半夏、竹茹、枳實(shí)、茯苓、橘皮、炙甘草和生姜購(gòu)自廣東省中醫(yī)院；辛伐他汀購(gòu)自廣州南新生物制藥有限公司；水合氯醛、油紅O 粉末和脫脂奶粉購(gòu)自Sigma-Aldrich；蘇木素染液和伊紅染液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白濃度試劑盒、5×SDS蛋白電泳上樣緩沖液和HaltTMProtease Inhibitor Single-Use Cocktail 購(gòu)自Thermo Fisher Scientific；PhosStop購(gòu)自Roche；抗ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）抗體、抗小窩蛋白1（caveolin-1）抗體、抗B 類I 型清道夫受體（scavenger receptor class B type I，SR-BI）抗體和抗分化簇36（cluster of differentiation 36，CD36）抗體購(gòu)自Ab?cam；GAPDH rabbit mAb、anti-rabbit IgG/HRP-linked antibody、anti-rat IgG/HRP-linked antibody 和antimouse IgG/HRP-linked antibody 購(gòu)自Cell Signaling Technology；Immobilon ECL Ultra Western HRP Sub?strate購(gòu)自Millipore。

7180全自動(dòng)生化測(cè)試儀（Hitachi）；高速低溫離心機(jī)（Eppendorf）；Multiskan FC 自動(dòng)酶標(biāo)儀和組織包埋機(jī)（Thermo Fisher Scientific）；BT125D 電子天平（Sar?torius）；石蠟切片機(jī)和H1220 型烤片機(jī)（Lecia）；垂直電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)和ChemiDoc XRS 凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）；MB-102 振蕩恒溫金屬浴（杭州博日科技有限公司）；MS 3 digital渦旋混合器（IKA）。

3 方法

3.1 藥物配制 根據(jù)唐代孫思邈《千金要方》中所載溫膽湯，按原經(jīng)方比例配伍。每克生藥加入6 mL超純水，浸泡30 min，加熱煮沸后文火繼續(xù)煎煮30 min，過濾至濾液自然滴盡，收集藥液；每克藥渣加入4 mL 超純水，再次煎煮，方法同前，合并兩次收集的濾液；使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，將濾液濃縮成浸膏；預(yù)冷冷凍干燥機(jī)，放入浸膏，制成凍干粉。按人和動(dòng)物間體表面積折算系數(shù)換算，以溫膽湯臨床給藥劑量的0.5、1 和2 倍換算，分別設(shè)為低、中、高劑量溫膽湯組。按小鼠灌胃劑量10 mL/kg，使用3%羧甲基纖維素鈉溶液配制低、中、高劑量溫膽湯藥劑。

以人最大臨床辛伐他汀用量40 mg，按人和動(dòng)物間體表面積折算系數(shù)換算，小鼠的給藥劑量為5 mg/kg。將辛伐他汀分散片碾碎，制成粉末狀。按小鼠灌胃劑量10 mL/kg，使用3%羧甲基纖維素鈉溶液配制辛伐他汀藥劑。

3.2 分組及給藥 將ApoE?/?小鼠隨機(jī)分為模型（model）組、辛伐他汀組、低劑量溫膽湯（low-dose Wendan decoction）組、中劑量溫膽湯（middle-dose Wendan decoction）組和高劑量溫膽湯（high-dose Wendan decoction）組，每組15 只。15 只相同遺傳背景的C56BL/6 小鼠為對(duì)照組。常規(guī)飲食適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，所有小鼠首次稱重，此后每周連續(xù)稱重并記錄，共10 周。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后ApoE?/?小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)，對(duì)照組小鼠給予普通飼料喂養(yǎng)。各干預(yù)組每日給予相應(yīng)藥物灌胃，模型組和對(duì)照組每日給予等量生理鹽水灌胃。給藥持續(xù)10周。

3.3 觀察指標(biāo)和方法 末次給藥后，小鼠禁食12 h。按照10 mL/kg，使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉；眼眶靜脈叢采集血液標(biāo)本；取血后將小鼠腹部朝上，四肢固定于取材板，沿腹部中線縱向剖開，充分暴露腹腔和胸腔；沿左心室心尖部插入針頭，注入預(yù)冷的生理鹽水，灌注至流出的液體清亮；體視顯微鏡下分離主動(dòng)脈，剝離血管外模周脂肪組織，取下小鼠主動(dòng)脈（主動(dòng)脈弓至雙髂動(dòng)脈分支，保留部分弓部分支，包括頭臂干、左頸總動(dòng)脈和左鎖骨下動(dòng)脈）；剪下連有心臟的部分胸段主動(dòng)脈；收集小鼠肝臟。

3.4 血脂水平的測(cè)定 血液標(biāo)本收集于離心管中，靜置4 h；預(yù)冷離心機(jī)，4℃、1 500 r/min 離心15 min。收集血清，標(biāo)記信息；每組分別隨機(jī)選取6 只小鼠血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠血清甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）和低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein choles?terol，LDL-C）和HDL-C水平。

3.5 油紅O染色檢測(cè)主動(dòng)脈整體斑塊形成的情況各組分別隨機(jī)選取5 只小鼠整體主動(dòng)脈，生理鹽水浸洗，放入4%多聚甲醛，4℃固定24 h；體視顯微鏡下縱向剖開，PBS 浸洗10 min；置于60%異丙醇中10 min；加入油紅O 工作液，室溫染色2 h；60%異丙醇分化，鏡下觀察至無背景色為止，拍照留存。使用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析圖像，計(jì)算斑塊占比。斑塊占比（%）=斑塊面積/主動(dòng)脈內(nèi)壁面積×100%。

3.6 HE 染色檢測(cè)主動(dòng)脈根部斑塊形成的情況 各組分別隨機(jī)選取5 只小鼠胸段主動(dòng)脈，生理鹽水浸洗，放入4%多聚甲醛，4℃固定24 h；清水沖洗1 h，采用梯度乙醇脫水；放入二甲苯中浸沒1 h；將組織放入60℃石蠟溶液中；石蠟包埋組織，冷卻凝固，室溫儲(chǔ)存?zhèn)溆?；使用石蠟切片機(jī)切取厚度為5 μm的組織切片，60℃烤片1 h，室溫保存；將切片放入二甲苯中脫蠟30 min，經(jīng)無水乙醇、梯度乙醇各5 min，脫水完成后，超純水浸潤(rùn)切片5 min×3 次；滴加蘇木素染色10 min，0.5%鹽酸酒精分化1 s，鏡下觀察細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，其余組織無色，流水沖洗切片20 min 返藍(lán)；將切片放入伊紅溶液染色2 min，流水沖洗多余伊紅溶液，鏡下觀察切片顏色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞漿呈紅色或粉紅色；無水乙醇脫水1 min×2次，自然風(fēng)干后中性樹膠封片，顯微鏡觀察切片并拍照留存。使用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析圖像，計(jì)算斑塊占比。斑塊占比（%）=斑塊面積/主動(dòng)脈內(nèi)壁橫截面積×100%。

3.7 Western blot檢測(cè)主動(dòng)脈ABCA1和caveolin-1及肝臟SR-BI 和CD36 蛋白的表達(dá) 各組隨機(jī)選取6 只小鼠的主動(dòng)脈進(jìn)行ABCA1蛋白表達(dá)量檢測(cè)，選取7只小鼠的主動(dòng)脈進(jìn)行caveolin-1蛋白表達(dá)量檢測(cè)，選取7只小鼠的肝臟進(jìn)行SR-BI 和CD36 蛋白表達(dá)量檢測(cè)。取各組主動(dòng)脈和適量肝臟組織，稱重記錄，根據(jù)組織重量加入適量裂解液，加入磁珠勻漿，冰上放置30 min；4℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清液；取適量上清液用于BCA法蛋白濃度檢測(cè)，根據(jù)各組蛋白總體積，調(diào)整各組蛋白濃度一致；恒溫金屬浴100℃煮10 min，于?80℃凍存?zhèn)溆?；每組取30～50 μg 蛋白，于10%SDS-PAGE分離蛋白；轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一定稀釋比例的Ⅰ抗，4℃孵育過夜；TBST洗膜3 次，加入對(duì)應(yīng)Ⅱ抗溶液，室溫孵育2 h；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑顯影曝光。以GADPH 蛋白為內(nèi)參照，使用Image Lab 5.1.0軟件進(jìn)行蛋白條帶灰度分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。服從正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Bonferroni校正t檢驗(yàn)或Tamhane′s T2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 溫膽湯對(duì)ApoE-/-小鼠體重的影響

如圖1A 所示，首次稱重各組小鼠體重基線水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）。此后，模型組與對(duì)照組、各給藥組之間體重差距逐漸拉大（圖2）。至第10 周，末次稱重結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠體重顯著增加（P＜0.01），而辛伐他汀組和各劑量溫膽湯組小鼠體重與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）；辛伐他汀及中劑量溫膽湯干預(yù)顯著降低高脂飼料喂養(yǎng)ApoE?/?小鼠體重，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而低、高劑量溫膽湯組ApoE?/?小鼠平均體重與模型組比較稍有降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）；辛伐他組與各劑量溫膽湯組小鼠體重比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）；各劑量溫膽湯組間比較，小鼠體重的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見圖1B。

Figure 1.The initial weight and last weight of the mice.A：the initial weight of the mice after 1 week adaptation with general meals；B：the last weight of the mice before preoperative fasting.Mean±SD. n=15.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs model group.圖1 小鼠初始體重和末次體重變化的比較

2 溫膽湯對(duì)ApoE-/-小鼠血清脂質(zhì)水平的影響

如表1 所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清TG、TC 和LDL-C 水平均顯著增高，HDL-C 水平顯著降低（P＜0.01）；辛伐他組和各劑量溫膽湯組小鼠血清TC、LDL-C 和HDL-C 水平與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01），而TG 水平與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）。與模型組比較，辛伐他汀和各劑量溫膽湯均能夠顯著降低小鼠血清TG、TC和LDL-C水平（P＜0.05或P＜0.01），而辛伐他組和各劑量溫膽湯組血清HDL-C水平與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）。辛伐他組與各劑量溫膽湯組比較，中、高劑量溫膽湯降低TG 和TC水平的作用略優(yōu)于辛伐他汀，辛伐他汀降低LDL-C水平的作用略優(yōu)于各劑量溫膽湯，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）。各劑量溫膽湯組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），未表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。

3 溫膽湯對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈整體斑塊形成的影響

如圖3所示，對(duì)照組C57BL/6小鼠主動(dòng)脈內(nèi)壁光滑，無明顯紅色著色斑塊；模型組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)壁有明顯分散的紅色斑塊；辛伐他汀組和各劑量溫膽湯組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)壁紅色斑塊面積較模型組減少。定量分析結(jié)果顯示，模型組小鼠主動(dòng)脈整體平均斑塊占比達(dá)（29.90±4.48）%，辛伐他汀組平均斑塊占比（14.66±2.30）%，與模型組比較顯著降低（P＜0.01）；低、中、高劑量溫膽湯組小鼠主動(dòng)脈平均斑塊占比分別 為（19.56±5.89）%、（14.86±4.47）%和（17.80±6.41）%，與模型組比較顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）；各劑量溫膽湯組主動(dòng)脈整體占比與辛伐他汀組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）；各劑量溫膽湯組間比較顯示，中劑量溫膽湯組主動(dòng)脈整體斑塊占比最低，但各劑量組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）。

Figure 2.Changing trend of the mouse body weight.A：changing trend of the mouse body weight in control group，model group，and simvastatin group；B：changing trend of the mouse body weight in low-，middle-and high-dose Wendan decoction groups.Mean±SD. n=15.圖2 小鼠體重的變化趨勢(shì)

表1 小鼠血脂水平Table 1.Serum lipid levels of the mice（mmol/L.Mean±SD. n=6）

Figure 3.Atherosclerotic plaque buildup in whole aorta（oli red O staining）and quantitative analysis of lesion area.Mean±SD. n=5.#P＜0.05，##P＜0.01 vs model group.圖3 主動(dòng)脈整體斑塊的油紅O染色和定量分析

4 溫膽湯對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部斑塊形成的影響

如圖4 所示，對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)壁邊緣平整，無斑塊；模型組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)壁可見明顯斑塊凸起，斑塊內(nèi)可見脂質(zhì)空泡。定量分析結(jié)果顯示，模型組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊占比達(dá)（32.55±1.45）%；辛伐他汀組斑塊占比為（20.55±3.81）%，與模型組相比顯著降低（P＜0.05）；中、高劑量溫膽湯組斑塊占比分別為（20.98±1.87）%和（21.27±2.21）%，與模型組比較顯著降低（P＜0.05），而低劑量溫膽湯干預(yù)后主動(dòng)脈根部斑塊占比為（26.56±8.21）%，與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）；辛伐他汀組與各劑量溫膽湯組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）；各劑量溫膽湯組中，中劑量組斑塊占比最低，低劑量組占比最高，但各劑量組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見圖4。

Figure 4.Atherosclerotic plaque buildup in aortic root（HE staining，×100）and quantitative analysis of the lesion area.A：control group；B：model group；C：simavastatin group；D：low-dose Wendan decoction group；E：middle-dose Wendan decoction group；F：high-dose Wendan decoction group.Black arrows indicated the atherosclerotic lesion.Mean±SD. n=5.#P＜0.05 vs model group.圖4 主動(dòng)脈根部斑塊的HE染色和定量分析

5 溫膽湯對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈ABCA1和caveolin-1蛋白表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組小鼠主動(dòng)脈ABCA1 蛋白水平略微升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）；辛伐他汀組和各劑量溫膽湯組ApoE?/?小鼠主動(dòng)脈ABCA1 蛋白表達(dá)水平均顯著升高，與對(duì)照組和模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；各劑量溫膽湯組小鼠主動(dòng)脈ABCA1 蛋白水平均高于辛伐他汀組，其中低劑量溫膽湯組與辛伐他組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），而中、高劑量溫膽湯組與辛伐他汀組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；各劑量溫膽湯組間比較結(jié)果顯示，中劑量溫膽湯提高ABCA1 蛋白表達(dá)水平的效果最佳，與低劑量溫膽湯組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但與高劑量溫膽湯組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見圖5A。

與對(duì)照組比較，模型組小鼠主動(dòng)脈caveolin-1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），而辛伐他汀組和各劑量溫膽湯組主動(dòng)脈caveolin-1 蛋白水平與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）；與模型組比較，辛伐他汀組和各劑量溫膽湯組caveolin-1 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）；辛伐他汀組與各劑量溫膽湯組小鼠主動(dòng)脈caveolin-1 蛋白表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）；溫膽湯組間比較顯示，中劑量溫膽湯干預(yù)后小鼠主動(dòng)脈caveolin-1 蛋白水平最低，但與低、高劑量溫膽湯組比較的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見圖5B。

6 溫膽湯對(duì)ApoE-/-小鼠肝臟SR-BI 和CD36 蛋白表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟SR-BI蛋白表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）；辛伐他汀組和中、高劑量溫膽湯組小鼠肝臟SR-BI蛋白表達(dá)水平顯著升高，與對(duì)照組和模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），而低劑量溫膽湯組小鼠肝臟SR-BI 蛋白水平與對(duì)照組和模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）；辛伐他汀組與各劑量溫膽湯組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）；各劑量溫膽湯組間比較顯示，中劑量溫膽湯提高SR-BI蛋白水平的作用最顯著，但與低、高劑量溫膽湯組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見圖6A。

Figure 5.The protein levels of ABCA1（A）and caveolin-1（B）in the aorta of mice.Mean±SD. n=6 in A；n=7 in B.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs model group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs simvastatin group.圖5 小鼠主動(dòng)脈ABCA1和caveolin-1蛋白表達(dá)水平的比較

與對(duì)照組比較，模型組和各劑量溫膽湯組小鼠肝臟CD36 蛋白水平均顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），而辛伐他汀組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）；與模型組比較，辛伐他汀干預(yù)能夠明顯降低小鼠肝臟CD36蛋白表達(dá)水平，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而各劑量溫膽湯組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）；辛伐他組與各劑量溫膽湯組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）；各劑量溫膽湯組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見圖6B。

Figure 6.The proteins level of SR-BI（A）and CD36（B）in the liver of the mice.Mean±SD. n=7.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs model group.圖6 小鼠肝臟SR-BI和CD36蛋白表達(dá)水平的比較

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，溫膽湯能夠抑制高脂飼料喂養(yǎng)的ApoE?/?小鼠體重增長(zhǎng)；降低血清TG、TC 和LDL-C 水平，但對(duì)血清HDL-C水平無明顯影響；抑制主動(dòng)脈整體及根部斑塊形成；能夠增加主動(dòng)脈ABCA1 蛋白表達(dá)水平，降低主動(dòng)脈caveolin-1 蛋白表達(dá)水平；并且增加肝臟SR-BI 蛋白表達(dá)水平，但對(duì)肝臟CD36 蛋白表達(dá)無明顯影響。

AS 是以巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)積聚并伴發(fā)炎癥為特征的病變過程。ApoE?/?小鼠的病理改變類似于人類Ⅱ型高脂血癥，AS 斑塊好發(fā)于主動(dòng)脈瓣、主動(dòng)脈弓、胸主動(dòng)脈以及其他主動(dòng)脈的主要分支點(diǎn)，且晚期病變斑塊易出現(xiàn)鈣化，ApoE?/?小鼠AS 病理改變可觀察到人類患者斑塊發(fā)展的所有階段，并且與臨床AS 患者病變特征十分相似，被廣泛運(yùn)用于現(xiàn)代高脂血癥、冠心病及AS 疾病的研究中［15］。本研究中采用高脂飲食喂養(yǎng)的ApoE?/?小鼠作為AS 疾病模型，相同背景的C57BL/6 小鼠為對(duì)照組。小鼠正常飲食適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，首次稱量體重，結(jié)果顯示各組別小鼠初始體重基數(shù)無顯著差異；10周后，末次稱量體重結(jié)果顯示中劑量溫膽湯干預(yù)能夠抑制高脂飼料喂養(yǎng)ApoE?/?小鼠的體重增長(zhǎng)。

對(duì)小鼠血清血脂水平檢測(cè)結(jié)果顯示，溫膽湯劑量依賴性降低ApoE?/?小鼠血清TG 和TC 水平。與模型組相比，高劑量溫膽湯組TG 水平降低78%，TC 水平降低46%，并且中、高劑量溫膽湯藥效有優(yōu)于辛伐他汀的趨勢(shì)。同時(shí)，各劑量溫膽湯均顯著降低ApoE?/?小鼠血清LDL-C水平，以中劑量溫膽湯干預(yù)藥效最佳，與模型組相比降低了約39%。但各劑量溫膽湯干預(yù)對(duì)小鼠血清HDL-C 水平并未產(chǎn)生明顯影響。

此外，對(duì)各組小鼠主動(dòng)脈整體和主動(dòng)脈根部粥樣硬化斑塊的病理觀察結(jié)果顯示，溫膽湯能夠有效抑制主動(dòng)脈整體及主動(dòng)脈根部斑塊形成，以中劑量溫膽湯干預(yù)藥效最佳，與模型組相比斑塊占比分別降低了51%和36%。肥胖和高血脂是AS 疾病公認(rèn)的危險(xiǎn)因素，以上研究結(jié)果表明，溫膽湯能夠顯著抑制肥胖，調(diào)節(jié)血脂異常，并抑制AS病變的進(jìn)展。

小窩是細(xì)胞膜上的特異性內(nèi)陷結(jié)構(gòu)，對(duì)膽固醇有很強(qiáng)的親和力。caveolin-1是研究小窩結(jié)構(gòu)的標(biāo)志性蛋白，廣泛表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種組織細(xì)胞表面，從而介導(dǎo)小窩結(jié)構(gòu)的各種生物學(xué)功能［16］。研究顯示，caveolin-1 在調(diào)節(jié)胞內(nèi)膽固醇平衡中發(fā)揮重要作用，caveolae 結(jié)構(gòu)的缺失可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)和膽固醇的沉積，膽固醇外流減少，從而最終導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成［17］。然而有研究顯示，ApoE?/?小鼠中缺失caveolin-1，對(duì)其AS 斑塊的發(fā)展有抑制作用，當(dāng)caveolin-1 在ApoE?/?小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中重新表達(dá)后，AS 病變范圍變大［18］，其可能的原因是caveolin-1 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。多項(xiàng)研究均表明，caveolin-1 可以抑制多種炎癥因子的表達(dá)，抑制炎癥作用。而過量表達(dá)的caveolin-1 可促進(jìn)單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)皮增生和炎癥反應(yīng)，從而加速AS 病變進(jìn)程［19-20］。有學(xué)者認(rèn)為，caveo?lin-1所介導(dǎo)的小窩結(jié)構(gòu)可能是炎癥應(yīng)答和膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的共同分子平臺(tái)，脂質(zhì)沉積可誘發(fā)炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)則加劇脂質(zhì)積聚［21］。因此，維持caveolin-1 的正常表達(dá)水平尤為重要。我們研究發(fā)現(xiàn)，高脂飼料喂養(yǎng)10 周的ApoE?/?小鼠主動(dòng)脈caveolin-1 表達(dá)水平異常增高，而溫膽湯能有效降低caveolin-1 蛋白表達(dá)水平，與對(duì)照組比較無顯著差異，說明溫膽湯能扭轉(zhuǎn)ApoE?/?小鼠主動(dòng)脈caveolin-1蛋白的異常高水平表達(dá)狀態(tài)，有助于caveolin-1正常水平的維持。

ABCA1 也稱膽固醇流出調(diào)節(jié)蛋白，廣泛表達(dá)于參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的組織細(xì)胞中，如肝臟、小腸和巨噬細(xì)胞等，其以ATP 為能源介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流至外周HDL-C，從而密切參與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的清除［22］。研究顯示，ABCA1基因敲除小鼠盡管體內(nèi)HDL-C 水平正常，其AS 病變?nèi)猿掷m(xù)加重［23］。而ABCA1基因過表達(dá)小鼠AS 病變減輕［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，溫膽湯干預(yù)后，小鼠主動(dòng)脈ABCA1 蛋白表達(dá)水平顯著增高，以中劑量組藥效最佳，約為模型組的2.2 倍。此外，模型組ApoE?/?小鼠主動(dòng)脈ABCA1蛋白水平略高于對(duì)照組。已有研究表明，ABCA1 表達(dá)水平與細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量呈正相關(guān)，細(xì)胞內(nèi)氧化型LDL 及乙酰化LDL均可促進(jìn)ABCA1 mRNA和蛋白的表達(dá)，且AS早期病變處巨噬細(xì)胞聚集區(qū)可發(fā)現(xiàn)ABCA1的表達(dá)，而AS晚期病變處巨噬細(xì)胞聚集區(qū)則不表達(dá)ABCA1［25］，所以我們推測(cè)模型組小鼠ABCA1 的增加可能是因?yàn)锳poE?/?小鼠體內(nèi)高膽固醇水平引起ABCA1代償性上調(diào)的結(jié)果。

SR-BI是膽固醇雙向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在巨噬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流至胞外HDL 處。而肝臟表達(dá)的SR-BI 能夠選擇性識(shí)別循環(huán)血流中的HDL，介導(dǎo)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，在機(jī)體膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程發(fā)揮重要作用［26］。研究表明，肝臟過表達(dá)SR-BI可加速循環(huán)血流中HDL 的清除，并且促進(jìn)機(jī)體膽固醇排泄，降低組織和血液循環(huán)中膽固醇水平，從而抑制AS 病變的進(jìn)展［27］。本研究發(fā)現(xiàn)，中、高劑量溫膽湯能夠明顯促進(jìn)ApoE?/?小鼠肝臟SR-BI蛋白表達(dá)，約為模型組的1.5 倍。同時(shí)我們認(rèn)為溫膽湯對(duì)ApoE?/?小鼠血清HDL水平上調(diào)趨勢(shì)不顯著可能與其促進(jìn)肝臟SR-BI表達(dá)有關(guān)。

CD36 也被認(rèn)為是脂類和脂肪酸的受體，在相關(guān)的心臟活動(dòng)中發(fā)揮作用［28］。在嚙齒類動(dòng)物中，CD36依賴性的脂肪酸傳感已被發(fā)現(xiàn)，脂類傳感器是CD36的新功能。相關(guān)研究表明，CD36作為脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)體主要參與長(zhǎng)鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，在CD36基因敲除小鼠中心臟、骨骼肌及脂肪組織長(zhǎng)鏈脂肪酸的吸收量減少了約50%～80%，將CD36 重新轉(zhuǎn)入CD36基因敲除小鼠后一段時(shí)間，長(zhǎng)鏈脂肪酸的吸收則恢復(fù)至正常水平［29］。在ApoE?/?小鼠肝臟CD36 蛋白水平的檢測(cè)中，我們發(fā)現(xiàn)溫膽湯并未明顯影響CD36蛋白的表達(dá)。還有研究表明，一些顯著促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程的激動(dòng)劑，如LXR 激動(dòng)劑、PXR 激動(dòng)劑等，由于將過量的脂類轉(zhuǎn)運(yùn)集中至肝臟，并增加肝臟自身脂肪的合成，有誘發(fā)肝臟脂肪性病變的風(fēng)險(xiǎn)［30］。因此通過觀察肝臟脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)的主要蛋白CD36，可在一定程度上表明溫膽湯在促進(jìn)ApoE?/?小鼠膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程中誘發(fā)肝臟脂肪性病變副作用的風(fēng)險(xiǎn)，我們的研究結(jié)果顯示，各劑量溫膽湯組小鼠肝臟CD36蛋白水平與模型組相比有降低趨勢(shì)，說明溫膽湯在促進(jìn)小鼠機(jī)體膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的同時(shí)，未表現(xiàn)出類似膽固醇激動(dòng)劑上調(diào)CD36 蛋白而誘發(fā)肝臟脂肪病變的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，我們認(rèn)為溫膽湯干預(yù)可有效降低高脂飼料喂養(yǎng)的ApoE?/?小鼠體重增長(zhǎng)及血清TG、TC 和LDL-C 水平，并抑制主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。相關(guān)機(jī)制可能是：溫膽湯提高小鼠主動(dòng)脈ABCA1 表達(dá)水平，維持主動(dòng)脈caveolin-1 蛋白表達(dá)的正常水平，并且促進(jìn)肝臟SR-BI 蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)主動(dòng)脈病變處膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程，抑制主動(dòng)脈膽固醇沉積。此外，溫膽湯在促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟的同時(shí)，并未顯著增加小鼠肝臟CD36蛋白表達(dá)水平，可能在一定程度上避免現(xiàn)有膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)激動(dòng)劑誘發(fā)肝臟脂肪性病變的風(fēng)險(xiǎn)。