黃 艷 馮 習黃方舟 胡 亮

湖南省長沙市第四醫(yī)院急診科，湖南長沙 410006

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是冠心病、急性心肌梗死等疾病發(fā)生發(fā)展的病理基礎，約70%的急性冠狀動脈事件是由易損斑塊所致[1]。近年來，各種高危因素導致急性心肌梗死等心血管疾病的發(fā)病率越來越高，發(fā)病年齡越來越年輕化，AS 的相關研究也成為當前研究熱點。研究表明，血管壁內多種細胞在刺激因素的作用下引起的功能失調或激活是粥樣斑塊的病理基礎[2]，如激活的血管平滑肌細胞（VSMCs）對粥樣斑塊的形成和穩(wěn)定性有重要作用[3]。因此，深入研究影響AS 斑塊穩(wěn)定性的因素及其機制，尋找穩(wěn)定斑塊、預防斑塊破裂的策略和方法，通過早期診斷和積極有效地干預，對降低AS 相關疾病的致殘致死率有至關重要的研究意義。

長鏈非編碼RNA（long nocoding RNAs，LncRNAs）是一類長度大于200 個核苷酸、缺少蛋白質編碼功能的長鏈非編碼RNA，在發(fā)現之初被當做是基因組內的“噪音”[4]。研究發(fā)現人體內存在眾多的LncRNA與心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[5]。利用轉錄組測序技術（RNA-seq）對組織或細胞中提取的全部RNA 進行測序，進而獲取組織或細胞在某一特定狀態(tài)下基因表達轉錄本的全面信息[6]，從中篩選對AS 病情進展有預示作用的LncRNA 作為疾病標志物[7]，可為深入研究LncRNA在AS 病情進展中的功能和作用機制提供線索[8]。目前已經發(fā)現的與AS 相關的LncRNA包括RAPIA[9]、NORAD[10]、TUG1[11]、ANRIL[12]等。

鑒于VSMCs 與LncRNAs 對于AS 的重要意義[13]，尋找VSMCs 泡沫化進程差異表達LncRNA，能為研究AS 相關疾病的發(fā)生發(fā)展提供重要線索。但是目前的研究大部分還是處于起步階段，本研究對VSMC 沫化進程中差異LncRNAs 進行篩選，并對其功能進行了分析和討論。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞及分組

家兔VSMC：細胞來源于湘雅細胞庫；實驗組細胞：經氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）處理24 h，濃度為80 μg/mL；對照組細胞未經ox-LDL 刺激。實驗組編碼為OX1、OX2、OX3、OX4，對照組編碼為：C1、C2、C3、C4。

1.2 方法與步驟

1.2.1 VSMC 的培養(yǎng)、凍存與復蘇

從液氮罐中取出凍存的細胞，迅速放入37℃恒溫水浴箱中，并不時地搖動凍存管，加快其融解。1000 r/min，r=13.5 cm，離心5 min，棄除上清。加入新鮮RPMI-1640 完全培養(yǎng)基（加10%胎牛血清）重懸細胞，轉移至25 mL 的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，做好標記。細胞培養(yǎng)的條件為95%的空氣混合5%的二氧化碳，溫度為37°C。據細胞生長情況，每天或者隔天更換新鮮培養(yǎng)基。以1∶2傳代培養(yǎng)2～3 代后，將生長良好且存活率高的細胞適當凍存留種，以備后續(xù)實驗補充需要，凍存方法如下：a.選擇處于對數生長期的細胞，去細胞培養(yǎng)液，用0.25%胰蛋白酶消化；b.用吸管吸取培養(yǎng)液反復吹打瓶壁上的細胞，使其成為均勻分散的細胞懸液，將細胞收集于離心管中離心（1000 r/min，r=13.5 cm，10 min）。c.去上清液，加20%小牛血清的完全培養(yǎng)基，4℃預冷15 min，逐滴加入無菌甘油，用吸管輕輕吹打使細胞均勻。d.分裝于安瓿中，火焰噴燈上封口。記錄日期、細胞種類、凍存數量。e.裝入布袋；置于液氮罐頸口處存放過夜，次日轉入液氮中。

1.2.2 實驗組處理及油紅O 染色

實驗組細胞處理：濃度為80 μg/ml ox-LDL 刺激24 h（oxLDL 購自北京索萊寶科技有限公司，貨號：H7950）。油紅O 染色：收集兩組細胞，PBS 離心洗滌2 次，70%乙醇固定細胞20 min，制備細胞鋪片，PBS洗3 次，油紅O 染色20 min，蒸餾水沖洗，蘇木精染色20 s，氨水分色30 s，自來水洗返藍，PVP 封片，顯微鏡下觀察攝片。

1.2.3 RNA 的提取與質量分析

（1）收集生長良好的VSMC，1000 r/min，r=13.5 cm，離心5 min。

（2）Trizol 法提取RNA。①將實驗組和對照組每管加入500 μL 的TRIzol，然后漩渦震蕩30 s，室溫靜置10 min，以致核酸蛋白復合物完全分離開。②在4℃條件下，12 000 r/min（r=13.5 cm）離心15 min，取上清液，然后轉入另一批新高壓滅菌離心管內。每管加入200 μL 氯仿，上下顛倒15 s，室溫靜置7 min。③在4℃條件下，12 000 r/min（r=13.5 cm）離心15 min，樣品被分為3 層（RNA 大部分溶解在上層的水相當中），將上層水相轉移到新的離心管中。④向離心管中加入500 μL 異丙醇，上下顛倒15 s，室溫靜置7 min。在4℃條件下12 000 r/min（r=13.5 cm）離心15 min，棄上清，見RNA 沉于管底。⑤向管中加即時配置的75%乙醇500 μL，上下顛倒15 s，在4℃條件下12 000 r/min（r=13.5 cm）離心10 min，棄上清。⑥向管中加入新配置的75%乙醇500 μL，上下顛倒15 s，在4℃條件下12 000 r/min（r=13.5 cm）離心8 min，棄上清。⑦在4℃條件下8000 r/min（r=13.5 cm）離心2 min，用小Tip頭吸除剩余的水分，室溫靜置7 min，使乙醇揮發(fā)。⑧向沉淀的RNA 中加40 μL 0.1% DEPC，接著放入65℃水浴箱中水浴5 min 以溶解RNA。⑨Nanodrop 檢測提取的RNA 的濃度和純度（OD260/280比值）。

從樣本中提取高質量的RNA 后，寄往北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行LncRNA 測序分析。

1.2.4 高通量測序（RNA-seq）

選取8 個樣品寄往北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行基因測序；測序流程大致為樣品檢測、rRNA 去除、雙鏈cDNA 合成、末端修復、加測序接頭、片段選擇、降解cDNA 第二鏈、PCR 富集、文庫質檢、上機測序。

1.2.5 差異表達LncRNA 篩選及靶基因預測

1.2.5.1 候選LncRNA 篩選 基本篩選、編碼潛能篩選基本篩選：step 1：對所有樣品拼接得到的轉錄本使用cuffcompare 軟件進行合并，選擇同時被兩種拼接軟件拼接到，或者同時出現在至少兩個樣品中的轉錄本；step 2： 選擇轉錄本長度≥200 bp，Exon 個數≥2 個的轉錄本；step 3： 通過cufflinks 計算每條轉錄本的reads 覆蓋度，選擇覆蓋度≥3 的轉錄本；step 4：通過cuffcompare 軟件，將前一步得到的轉錄本與已知LncRNA 進行比較，得到與已知LncRNA 相同的轉錄本。step 5：利用cuffcompare 分析結果中的class_code信息篩選候選LncRNA 轉錄本。

編碼潛能篩選：具有編碼潛能與否是判斷轉錄本是否為LncRNA 的關鍵條件，使用CPC 分析、CNCI分析、pfam 蛋白結構域分析和PhyloCSF 分析結果的交集作為本研究分析預測得到的LncRNA 數據集。

1.2.5.2 靶基因預測 預測原理：cis 作用靶基因預測基本原理是LncRNA 的功能與其坐標臨近的蛋白編碼基因相關，篩選LncRNA 臨近位置的（上下游100 kb）蛋白編碼基因作為其靶基因。trans 作用靶基因預測基本原理是LncRNA 的功能不依賴于和編碼基因的位置關系，而與其共表達的蛋白編碼基因相關?？梢酝ㄟ^樣本間LncRNA 與蛋白編碼基因的表達量相關性分析或共表達分析方法來預測其靶基因。

1.2.6 差異表達LncRNA 靶基因富集與功能預測

1.2.6.1 KEGG 與GO 富集分析 Gene Ontology 是基因功能國際標準分類體系。根據實驗目的篩選特異基因后，研究這些基因在Gene Ontology 中的分布狀況將闡明實驗中樣本差異在基因功能上的體現。

KEGG 是有關Pathway 的主要公共數據庫。在生物體內，不同基因相互協(xié)調行使其生物學功能，通過Pathway 顯著性富集能確定特異基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。

1.2.6.2 malacard 數據整理 在malacard 數據庫查找動脈粥樣硬化相關疾病，例如冠心病等。查找排列前20 位的AS 相關疾病的靶基因，數量總計1944 個。統(tǒng)計高通測序結果中反式作用靶基因，共計56 458 個。將上述兩個表格中的數據在Excel 表格中利用重復項篩選工具進行篩選，共計重復靶基因數量為143 個，這些靶基因即為測序結果中可能與AS 相關的靶基因。

1.2.7 人同源LncRNA 比對與篩選

①28 個差異表達的LncRNA 中篩選出7 個顯著上調LncRNA 和5 個顯著下調LncRNA；篩選標準為：log2（foldchange）絕對值＞1，P ＜0.05。

②通過ensembl 數據庫中Blat Tool 對12 個差異表達顯著的LncRNA 進行同源性對比參數設置方法：輸入LncRNA 序列，參考數據庫選擇非編碼RNA 數據庫，比對物種為人，搜索敏感度選擇遠系同源，Evalue 值選擇1e-4，比對長度＞100 bp，選取同源性較好的LncRNA。

2 結果

2.1 油紅O 染色

顯微鏡下實驗組細胞內觀察到大量紅色脂滴，對照組未發(fā)現明顯紅色脂滴，提示ox-LDL 孵育有效。染色結果見圖1（封四）。

2.2 RNA 質檢及測序原始數據質量評價

Nanodrop 檢測RNA 的濃度和純度 （OD260/280比值）。經Nanodrop 檢測RNA 的濃度達1000 ng/μL 以上，OD260/280比值在1.90～2.00 之間。

Agilent 2100 檢測結果如表1 所示；高通量測序數據質量評估如表2 所示（委托京諾禾致源生物信息科技有限公司完成）。

表1 Agilent 2100 檢測結果

表2 測序質量評估統(tǒng)計

2.3 差異表達LncRNA 篩選及靶基因預測結果

基本篩選：通過方法中描述的5 個步驟，每個步驟根據要求保留符合要求的轉錄本，最后保留3629 個轉錄本。見圖2。

圖2 基本篩選結果展示圖（橫坐標5 個步驟見詳見方法）

編碼潛能篩選：具有編碼潛能與否是判斷轉錄本是否為LncRNA 的關鍵條件，通過CPC 分析、CNCI分析、pfam 蛋白結構域分析和PhyloCSF 分析分別得到各自保留的轉錄本，然后通過區(qū)交集區(qū)域共獲得2037 個無編碼潛能差異轉錄本。見圖3。

圖3 編碼潛能篩選結果維恩圖

篩選結果如下：①差異轉錄本共計506 個，部分數據見表2；其中LncRNA 轉錄本28 個，novel 轉錄本30，mRNA 轉錄本448 個。②448 個mRNA 轉錄本來自446 個編碼基因，絕大部分由已知編碼基因生產。③28 個LncRNA 轉錄本來自28 個編碼基因，編碼基因均未知。④30 個novel 轉錄本來自30 個編碼基因。⑤3 種轉錄本的編碼基因沒有交集。

統(tǒng)計學篩選：篩選標準為log2（fold change）絕對值＞1，P ＜0.05。能滿足P ＜0.05 的轉錄本數目為28 個，同時滿足兩個條件的為12 個。實驗組與對照組比較，其中7 個為表達顯著上調的轉錄本，5 個為表達顯著下調的轉錄本。見表3。

表3 28 個差異表達轉錄本

2.4 差異表達LncRNA 靶基因富集結果

2.4.1 功能預測

對差異表達轉錄本靶基因KEGG 富集分析得到如下結果，Trans 靶基因的KEGG 的聚類結果顯示236 條靶基因富集到的通路中，其中Steroid biosynthesis、Selenocompoundmetabolism、Fattyacidmetabolism、HIF-1 signaling pathway、Glycolysis/Gluconeogenesis 等信號通路出現了富集差異，主要涉及細胞內脂類代謝、合成以及低氧應激等活性。見圖4（封四）。

差異表達基因GO 富集分析如圖5（封四）顯示，Trans 作用涉及到10 867 個靶基因。富集term 中處理組與對照組在response to stress、cell death、death、pro grammed cell death、apoptotic process、intracellular 等細胞功能相關的靶基因上出現顯著富集差異。其他term 主要涉及細胞內代謝合成等相關基因。

2.4.2 Malacard 數據整理

對高通量測序的LncRNA 轉錄本進行靶基因預測，共得到56 458 個靶基因。在malacard 數據庫中以AS 關聯的20 種臨床疾?。ㄐ募」Ｋ?、頸動脈閉塞、缺血性心臟病、冠心病等）為關鍵詞進行搜索，共得到1944 個AS 相關基因，通過Venn 圖計算獲取預測靶基因與malacard 中收錄AS 相關基因的交集，其中143 個基因為本次高通量測序結果中LncRNA 對應的靶基因。見圖6。

圖6 malacard 靶基因預測維恩圖

AS 相關疾病關聯基因的交集結果：GATA4、ANXA5、SOD1、FGB、ITGAM、F7、ABCG8、HFE、PLAT、APOA4、FGA、ANKRD1、PCSK9、PTGS1、CA3、CXCL11、AGTR2、APOA5、ACTA2、EDN1、PAPPA、ACVRL1、PPARG、MGP、HMGCR、GCLM、PGF、HIF1A、PPIG、MKKS、FGF2、LRP6、ANGPT1、CHD7、BMPR2、SETD2、LMNA、MMP2、ADRB1、NOS3、HMOX1、OLR1、PON2、PALLD、HAND2、CKM、CXCL10、CAT、ADRB2、FN1、CA4、PTPN11、ADIPOQ、FABP3、VEGFA、GP1BA、TTN、CCT7、RYR2、F5、ACTC1、NPPC、SERPINC1、PLA2G7、WRN、CAMK2G、HTR2A、ABCA1、VCAM1、TNNT2、F11、NKX2-6、ADAMTS18、DSCAM、POSTN、LTA、PSEN1、CCL5、CASP3、APOB、PDE5A、NOS2、CCL2、SELE、SCN5A、TBX20、ESR1、SORT1、PPARD、ICAM1、DCN、CDH5、MTRR、SERPINE1、SELL、PHACTR1、PIK3C2A、NAMPT、GCLC、CSF1、CST3、SERPINF2、F3、IRAK4、GUCY1A3、TGFB1、LIPC、CD14、HP、MEF2A、GJA1、DSG2、MSR1、GATA6、PSMA6、TAZ、BGN、COG2、ADAMTS13、APOH、LRP8、PROCR、MMP1、NPY、PON1、LPL、IL10、SETD1A、CIITA、CXCR4、IL6、SLC39A2、MME、NR3C2、CEL、PIGL、ADD1、SELP、APOA2、ADM、MAP2、TIMP1。

2.5 人同源LncRNA 比對與篩選結果

通過ensemble 數據庫分別對12 個差異表達顯著的LncRNA 進行同源性對比，排除沒有比對結果的LncRNA，選取同源性較好的6 個LncRNA（ID 值＞80%）。見表4。

表4 人同源LncRNA 比對與篩選結果

3 討論

本研究收集泡沫化進程的VSMC，經過RNA 測序獲得原始序列數據、通過生物信息學分析及統(tǒng)計學分析得到28 個差異顯著的轉錄本，本其中LncRNA全部為首次報道的新轉錄本。通過對28 條差異表達LncRNA 轉錄本進行功能注釋和數據庫聯合分析，發(fā)現這些LncRNA 與AS 疾病存在密切關系。

AS 是最常見的心腦血管系統(tǒng)疾病之一。根據世界衛(wèi)生組織WHO 調查數據，每年全世界有800～1000 萬人因動脈硬化所引起的急性心腦血管疾病死亡，AS已成為影響全人類健康的頭號殺手[14]。AS 的主要病理變化是以動脈管壁脂質沉積、內膜增生、炎性浸潤和粥樣斑塊形成及鈣化為主[15-16]。在構成血管壁的多種細胞中，VSMCs 的增殖和遷移在AS 的發(fā)展中起著重要作用[17]，是引起血管損傷和再狹窄的一個關鍵因素。AS 發(fā)展之初，VSMCs 從收縮型變?yōu)楹铣尚?，且遷移到血管內膜，從而導致內膜增生[18]。研究結果顯示，ox-LDL 能通過上調骨橋蛋白（osteopontin，OPN）表達量來影響VSMCs 的增殖和遷移，并表現為劑量依賴性[19]。在AS 形成過程中，VSMCs 受ox-LDL 刺激由收縮型轉化為合成型[20-21]，并向血管中膜遷移，在增殖的過程中分泌細胞外基質并聚集在病灶部位，從而致使血管內膜上纖維帽形成。這種由ox-LDL 介導的VSMCs 增殖、遷移、凋亡等一系列細胞活動能夠促進粥樣斑塊的形成與發(fā)展，與AS 相關的血管病理改變密切相關[23]。

因此，研究VSMCs 在致病因素刺激下細胞狀態(tài)、細胞活動以及相應細胞成分的改變對于揭示AS 發(fā)生發(fā)展，以及為AS 尋找新的治療和檢測靶點具有重要意義。以RNA-seq 技術為代表的二代測序技術已成為基因表達和轉錄組分析的常用研究手段[24]，近兩年三代全長轉錄組測序也已經開始應用在轉錄水平的測序任務，但目前無論實驗成本和樣本質量要求都還無法達到快速普及的目的[25]。RNA-seq 技術能夠對絕大多數物種的整體轉錄活動進行檢測，通過將組織或細胞中總RNA 反轉錄為cDNA 進行文庫構建再進行測序，統(tǒng)計所有轉錄本的reads 數來計算出不同RNA轉錄本的表達量。在獲得轉錄本的序列特征和表達水平的同時，還能發(fā)掘新轉錄本和稀有轉錄本，識別可變剪切位點及序列的單核酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），在轉錄水平為研究者提供全面的參考信息[26]。

Malacard 為人類疾病基因數據庫，廣泛收錄了大量來自實驗和預測得到的人類基因信息。本研究中，靶基因預測結果與malacard 收錄基因合并分析結果表明，篩選得到的LncRNA 轉錄本與AS 存在密切關系。同時，進一步檢索143 個靶基因所對應的疾病種類，主要包括病理性肥胖、心肌梗死、頸動脈閉塞、先天性心臟病、頸動脈疾病、缺血性心臟病、流行性乙型腦炎、角膜內皮炎、冠心病等，這些疾病都是心腦血管疾病或者與AS 相關的疾病，進一步證明本研究中實驗組所采用的ox-LDL 處理方法和引起VSMCs 在LncRNA 表達水平上發(fā)生改變，提示這種變化可能與AS 的發(fā)生發(fā)展具有相關性。

本研究中篩選得到的差異表達LncRNA28 個，其中顯著表達差異者12 個，GO 和KEGG 數據庫聚類分析結果顯示差異表達LncRNA 對應的靶基因廣泛涉及脂類代謝、合成，細胞凋亡、程序性死亡等生物學過程，這些過程都對AS 的發(fā)生發(fā)展都有重要作用。通過對ox-LDL 刺激的VSMC 測序分析得到28 個差異表達LncRNA，反式作用KEGG 富集分析得到3 個AS 相關通路：萜類化合物支架生物合成、類固醇生物合成、糖酵解和糖質新生。他們從分子功能、細胞成分及各類生物學過程均有富集。針對篩選出的差異LncRNAs，通過同源對比得到人源差異轉錄本及LncRNA信息，為下一步實驗繼續(xù)研究其功能與作用機制，將可能為預防AS 的發(fā)生和控制相關疾病的進展提供新的靶點。