王蓓蓓 徐芳 王愛(ài)利
支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是一種慢性氣道炎癥性疾病,以氣道高反應(yīng)、氣道粘液高分泌為特征,隨著病程的發(fā)展,可出現(xiàn)氣道重塑、肺組織結(jié)構(gòu)性改變。盡管大部分哮喘對(duì)糖皮質(zhì)激素治療敏感,仍有5%~10%重癥哮喘對(duì)糖皮質(zhì)激素治療反應(yīng)差,增加了非計(jì)劃門診、急診或住院率,嚴(yán)重者甚至?xí)?dǎo)致患者死亡[1]。中性粒細(xì)胞在重癥哮喘中發(fā)揮重要作用[2],研究表明,在中性粒細(xì)胞為主的氣道炎癥中,伴隨氧化應(yīng)激的病理過(guò)程[3],且中性粒細(xì)胞與氧化應(yīng)激關(guān)系密切。在McGovern等的研究中發(fā)現(xiàn),氣道氧化應(yīng)激產(chǎn)物與中性粒細(xì)胞在氣道的聚集與氣道高反應(yīng)、氣道炎癥的形成有關(guān),經(jīng)抗氧化治療可阻止中性粒細(xì)胞趨化引誘物的合成及釋放,并減輕氣道炎癥及氣道高反應(yīng)[4]。銀杏內(nèi)酯A是一種從銀杏葉(Ginkgo biloba L)中分離而來(lái)的中藥成分,目前研究發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯A具有抗炎、抗氧化、減輕冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能失調(diào)及神經(jīng)元毒性保護(hù)作用[5-7],基于銀杏內(nèi)酯A的抗氧化、抗炎作用,我們通過(guò)中性粒細(xì)胞性哮喘模型探索GA對(duì)中性粒細(xì)胞為主的哮喘小鼠氣道炎癥的影響及作用機(jī)制,為重癥哮喘提供新的治療策略。
BALB/c小鼠,雌性,6~8周,20~25 g,SPF級(jí),購(gòu)于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心,動(dòng)物合格證號(hào):SYXK(鄂)2016-0057,小鼠于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境中飼養(yǎng),保證飲食充足,12小時(shí)光照、12小時(shí)黑暗循環(huán),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲本院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。卵清蛋白(OVA)(grade V, Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., USA),銀杏內(nèi)酯A、FCA(Sigma,USA),DEX(天津金耀氨基酸有限公司),SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所),兔抗β-actin抗體(天津三箭生物技術(shù)有限公司),辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(Aspen,USA),兔抗磷酸化的ERK1/2抗體、兔抗磷酸化的p38抗體、兔抗磷酸化的p85抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology(CST)公司。
1 哮喘模型建立及給藥干預(yù)
28只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、哮喘組、GA干預(yù)組、DEX干預(yù)組。哮喘組、GA干預(yù)組及DEX干預(yù)組分別于第0、14、21天腹腔內(nèi)注射20 ug卵清蛋白(OVA)+75 ul 氟氏制劑(CFA)致敏,從第22天開(kāi)始直至第24天連續(xù)給予5% OVA霧化激發(fā),每次激發(fā)30分鐘,一天一次,對(duì)照組給予PBS致敏及激發(fā)。GA干預(yù)組及DEX干預(yù)組每次激發(fā)前1小時(shí)給予80 mg/kg GA[8]或1 mg/kg DEX腹腔注射。
2 肺泡灌洗液細(xì)胞分析
末次激發(fā)后24小時(shí),獲取各組小鼠肺泡灌洗液,參照先前的實(shí)驗(yàn)方法[9],即使用0.8 mL經(jīng)4℃預(yù)冷的PBS進(jìn)行雙側(cè)肺泡灌洗,共灌洗三次,每次灌洗后200 g,4℃條件下離心5分鐘。將三次細(xì)胞沉淀濃度調(diào)制1×106/mL,通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù),然后取200 μL細(xì)胞溶液進(jìn)行迪夫快速(Diff-quick)染色,顯微鏡下取10個(gè)不同視野進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。
3 肺泡灌洗中SOD的檢測(cè)
獲取第一次肺泡灌洗液(BALF)上清,使用SOD試劑盒檢測(cè)BALF中SOD水平,詳細(xì)操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。
4 肺組織學(xué)檢測(cè)
末次激發(fā)24小時(shí)后,剪開(kāi)胸壁,于右肺門處結(jié)扎右肺,通過(guò)2 ml注射器針頭(去掉尖端部分)將200 ul 10%中性多聚甲醛注入左肺,使其膨脹。于左肺門處結(jié)扎,獲取左肺,10%多聚甲醛固定24小時(shí),石蠟包埋。沿左肺長(zhǎng)軸切片,切片厚5 um,制片,脫蠟,蘇木精-伊紅(HE)染色、糖原(PAS)染色,光鏡下觀察氣道周圍炎癥及氣道內(nèi)粘液分泌變化。
5 Western blot檢測(cè)
提取各組小鼠右肺組織總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度并進(jìn)行相對(duì)定量,使各樣品總蛋白濃度一致。行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)膜,用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1h,洗滌,分別加1:1000稀釋的兔抗p-ERK1/2抗體、兔抗p-p38抗體、兔抗p-p85抗體、兔抗β-actin抗體4℃孵育過(guò)夜,洗滌,HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1:4000)室溫孵育1h,TBST洗膜,ECL試劑盒化學(xué)發(fā)光法顯示蛋白條帶,圖像分析軟件測(cè)定蛋白條帶的吸光度值。
所有資料通過(guò)GraphPad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)繪圖。所得數(shù)值以`x±s表示,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),差異有顯著性時(shí)進(jìn)一步運(yùn)用S-N-K法進(jìn)行兩兩比較,P<0.05,表示平均值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
末次激發(fā)后24小時(shí)進(jìn)行肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞分類計(jì)數(shù),結(jié)果顯示哮喘組細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)均較對(duì)照組明顯升高,經(jīng)GA干預(yù)后哮喘小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而DEX干預(yù)組上述指標(biāo)變化不明顯(P>0.05)(見(jiàn)表1)。
表1 GA減少中性粒細(xì)胞為主的哮喘小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(n=7,×104/L)
為了探索GA對(duì)哮喘小鼠氣道周圍炎癥細(xì)胞聚集及粘液分泌的影響,我們對(duì)各實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織進(jìn)行H&E染色、PAS染色。哮喘組小鼠氣道及血管周圍可見(jiàn)明顯白細(xì)胞浸潤(rùn)、膠原纖維沉積及粘液分泌,GA干預(yù)后哮喘小鼠氣道及血管周圍炎癥明顯減輕、杯狀細(xì)胞增生及粘液分泌明顯減少,而地塞米松干預(yù)組氣道及血管周圍炎癥變化不明顯(見(jiàn)圖1)。
圖1 各實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織H&E染色、PAS染色哮喘組氣道周圍可見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn),包括中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的聚集增加(黑色粗箭頭),粘液分泌增加(黑色細(xì)箭頭),杯狀細(xì)胞增生(紅色細(xì)箭頭),氣管壁明顯增厚;GA干預(yù)組氣道周圍炎癥細(xì)胞聚集明顯減少、黏液分泌細(xì)胞,杯狀細(xì)胞增生明顯減少,DEX干預(yù)組氣道及血管周圍炎癥上述變化不明顯。(×200)
SOD是一種氧化應(yīng)激產(chǎn)物,為了解GA對(duì)氣道氧化應(yīng)激的影響,我們通過(guò)Elisa檢測(cè)了每組小鼠肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid, BALF)中SOD水平。結(jié)果表明,哮喘組BALF中SOD水平較對(duì)照組明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)GA干預(yù)后,哮喘小鼠血清SOD水平明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而DEX干預(yù)組SOD水平變化不明顯(見(jiàn)圖2)。
圖2 GA對(duì)哮喘小鼠BALF中SOD活性影響
結(jié)果顯示,哮喘組小鼠肺組織中p38被激活,其蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高,經(jīng)GA干預(yù)后p38/MAPK通路的活化明顯被抑制,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05。地塞米松干預(yù)組p38蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化,P>0.05。而p85和ERK的活化與對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P>0.05(見(jiàn)圖3)。
支氣管哮喘是一個(gè)慢性氣道炎癥性疾病,目前全世界約有3億哮喘患者,每年約有25萬(wàn)人因哮喘而過(guò)早地死亡。氧化應(yīng)激在哮喘的病理過(guò)程中扮演重要的角色,因氧化應(yīng)激過(guò)程中活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平明顯增加[10],從而導(dǎo)致氧化與抗氧化失衡,過(guò)多的ROS引起血管通透性增加,粘液高分泌,平滑肌收縮,氣道上皮脫落、損傷及氣道高反應(yīng)[11-12]。SOD是一種對(duì)抗ROS的抗氧化物,在哮喘患者中SOD的活性明顯下降,且SOD活性下降與氣流受限程度及哮喘嚴(yán)重程度明顯相關(guān)[13-14]。與文獻(xiàn)報(bào)告一致,本實(shí)驗(yàn)研究中也發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠BALF中SOD水平較對(duì)照組明顯下降,提示哮喘小鼠炎癥部位SOD大量消耗,氧自由基清除能力下降。
圖3 GA對(duì)P38、ERK、P85活化的影響
銀杏內(nèi)酯A是銀杏葉提取物中重要的活性物質(zhì),在多種疾病模型中顯示了良好的抗炎、抗氧化作用。郝艷玲等通過(guò)細(xì)胞水平缺血再灌注模型發(fā)現(xiàn),銀杏內(nèi)酯A可以增加SOD、減少乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)水平,降低心肌缺血再灌注的損傷程度[15]。Tosaki等研究表明聯(lián)合SOD和銀杏葉提取物(EGB761)可以明顯減少自由基的產(chǎn)生及再灌注導(dǎo)致的室顫(ventricular fibrillation,VF)和室速(ventricular tachycardia,VT)的發(fā)生[16]。本實(shí)驗(yàn)研究也表明,在中性粒細(xì)胞性哮喘模型中,哮喘小鼠經(jīng)銀杏內(nèi)酯A干預(yù)后SOD水平明顯上升,并伴隨著氣道周圍炎癥的減輕,而地塞米松干預(yù)組SOD及氣道周圍炎癥變化均不明顯,提示了銀杏內(nèi)酯A具有抗氧化作用,可能通過(guò)提高SOD水平,維持氧自由基生成與清除的動(dòng)態(tài)平衡,從而對(duì)中性粒細(xì)胞性哮喘產(chǎn)生治療作用,為減少激素的抵抗提供了新的治療策略。
MAPK是高度保守的真核生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)酶,包括JNK、ERK、p38,受不同的細(xì)胞外刺激,如細(xì)胞因子、激素、應(yīng)激等激活后,可將信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)部,調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。其中ERK參與了哮喘氣道重構(gòu)過(guò)程[17],p38在介導(dǎo)糖皮質(zhì)激素抵抗型哮喘病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[18],p38MAPK活化程度與糖皮質(zhì)激素治療的反應(yīng)性及哮喘的臨床嚴(yán)重程度相關(guān)[19]。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)由一個(gè)催化亞基(p110)和一個(gè)調(diào)節(jié)亞基(p85)構(gòu)成,參與氣道平滑肌增生及氣道重構(gòu)過(guò)程。研究表明,p85在氣道上皮及氣道平滑肌中表達(dá)明顯增加,并與氣道平滑肌增生相關(guān)[20]。為了探索銀杏內(nèi)酯A對(duì)中性粒細(xì)胞性哮喘的治療機(jī)制,我們檢測(cè)了各組肺組織中ERK、p38及p85活化后的蛋白表達(dá)情況,Western-blot結(jié)果分析顯示哮喘組p-p38含量較對(duì)照組明顯增加,而p-ERK及p-p85無(wú)明顯變化。經(jīng)銀杏內(nèi)酯A干預(yù)后肺組織中p-p38的表達(dá)明顯下降,提示了p38MAPK信號(hào)途徑參與了銀杏內(nèi)酯A對(duì)中性粒細(xì)胞性哮喘的抗炎作用過(guò)程。
綜上所述,銀杏內(nèi)酯A通過(guò)p38MAPK途徑調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞性哮喘氣道炎癥及氧化應(yīng)激過(guò)程,對(duì)中性粒細(xì)胞性哮喘具有治療作用,為臨床重癥哮喘治療提供了新的依據(jù),對(duì)減少激素的使用及其副作用具有重要意義。但銀杏內(nèi)酯A調(diào)節(jié)p38MAPK的具體分子機(jī)制尚不明確,有待下一步體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討。