雷 港，武和明，江 飛

成釉細胞瘤(ameloblastoma，AM)是一種臨床常見的牙源性良性腫瘤，雖歸屬于良性腫瘤，但呈現(xiàn)浸潤性生長、易復(fù)發(fā)、易惡變，具有惡性腫瘤的性質(zhì)[1]。約占頜骨腫瘤的14%[2]，在發(fā)展中國家發(fā)病率相對更高[3]。目前臨床上對于成釉細胞瘤的治療主要采用手術(shù)切除病變頜骨[1]。由于該病起病癥狀不明顯，進展緩慢，往往發(fā)現(xiàn)臨床癥狀時已造成大范圍頜骨缺損。切除大塊病變頜骨后的重建修復(fù)則成為臨床難題[4]。

對解決臨床上大塊骨缺損再生的難題，目前已有多種策略，包括自體骨移植、異體骨移植[5]，以及基于組織工程原理的骨再生手段[4]。已有研究表明，血管化骨再生的過程與缺損區(qū)域中干細胞的自噬(autophagy)水平密切相關(guān)[6]。自噬是指細胞內(nèi)有“自己吃自己”的現(xiàn)象，通過溶酶體降解長半衰期蛋白及受損細胞器，將降解產(chǎn)物循環(huán)再利用[7]，從而保持細胞內(nèi)的能量平衡，抵御缺氧、饑餓、衰老等壓力及降解有害胞質(zhì)成分和入侵的細菌病毒等[8-11]。自噬作為細胞內(nèi)物質(zhì)循環(huán)再利用過程的組成部分，在清除干細胞自我更新、增殖和分化過程產(chǎn)生的廢棄蛋白及細胞器中起到重要作用[12-14]。成釉細胞瘤是否會影響成骨相關(guān)干細胞的自噬水平，如果影響成骨相關(guān)干細胞的自噬水平，可能直接關(guān)系到切除病變組織后的骨再生效果。本研究通過收集成釉細胞瘤患者切除的腫瘤組織，分離成釉細胞瘤細胞(human ameloblastoma-derived cells, hAMCs)[15]，收集hAMCs條件培養(yǎng)液與正常人骨髓間充質(zhì)干細胞(human bone-marrow mesenchymal stromal cells, hBMSCs)共培養(yǎng)，觀察hBMSCs自噬水平和成骨相關(guān)表型，進而間接分析成釉細胞瘤影響骨再生的相關(guān)機制，為成釉細胞瘤患者切除病灶術(shù)后的骨再生提供優(yōu)化策略。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

α-MEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、雙抗(青霉素/鏈霉素)(均購自Gibco，美國) ，CCK-8試劑盒(Dojindo，日本)，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(分析純，Ameresco，美國)，堿性磷酸酶染色試劑盒(建成，中國) ，堿性磷酸酶活力檢測試劑盒(中生，中國)，茜素紅染色液(Sigma，美國)，RIPA蛋白裂解液(碧云天，中國廣州)，SDS-PAGE凝膠試劑盒(凱基，中國)，蛋白Marker(Fermentas，美國)，SuperSignal?West Pico化學(xué)發(fā)光底物(Thermo，美國)，細胞角蛋白18(Cytokeratin，CK-18)、波形蛋白(Vimentin)、E鈣黏蛋白(E-Cadherin)抗體(Bioworld，美國)，核心結(jié)合蛋白因子2 (Runt-related transcription factor 2， RUNX2)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)、 成骨轉(zhuǎn)錄因子(Osterix，OSX)、骨涎蛋白(Bone sialoprotein， BSP)、骨鈣素(Osteocalcin，OCN)、骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)、Ⅰ型膠原(Type Ⅰ collagen，Collagen Ⅰ)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈(Microtuble-associated protein light chain 3，LC3b)、自噬相關(guān)蛋白6同源物(Autophagy related 6 homolog， Beclin1)、自噬相關(guān)蛋白5同源物(Autophagy related 5 homolog，ATG5)抗體(Abcam，英國)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH)抗體(Bioworld，美國)，山羊抗兔IgG二抗(中杉金橋，中國)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 hBMSCs的培養(yǎng) hBMSCs購自廣州賽業(yè)生物科技有限公司，細胞增殖至80%～90%，使用0.25%胰蛋白酶消化傳代，擴增培養(yǎng)至P3代用于后續(xù)實驗。

1.2.2 hAMCs的分離和培養(yǎng) 取成釉細胞瘤組織，置于4 ℃無血清α-MEM 培養(yǎng)液(含200 U/mL青霉素及200 μg/mL鏈霉素)中移入超凈臺。用含有200 U/mL青霉素及200 μg/mL鏈霉素的PBS漂洗3次，每次3 min。將組織剪成1～2 mm3大小后移入含1 g/L Ⅰ型膠原酶的α-MEM 培養(yǎng)液中，37 ℃孵箱內(nèi)消化4 h，每半小時震蕩15 s。當(dāng)組織塊呈絮狀時停止消化，1 200 r/min離心5 min，去上清液，加入PBS重懸漂洗3次，細胞計數(shù)，以1×106個細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入含10% FBS的α-MEM完全培養(yǎng)基，置于37 ℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)，每2～3 d換液。細胞增殖至80%～90%消化傳代，P1及P2代細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 成釉細胞瘤條件培養(yǎng)液(hAMC-CM)制備 待細胞生長融合至70%后，每天換液置換出來的培養(yǎng)液以3 000 r/min離心15 min，收集上清，用孔徑為0.22 μm的小濾器過濾，加入等量的含10% FBS的α-MEM完全培養(yǎng)基制成條件培養(yǎng)液(hAMC-CM)備用。

1.2.4 CCK-8檢測 制備hBMSCs單細胞懸液以1 000個/孔接種于96孔板中,細胞貼壁后用無血清α-MEM培養(yǎng)液饑餓處理24 h后換用α-MEM完全培養(yǎng)基及hAMC-CM條件培養(yǎng)基培養(yǎng)(每組設(shè)5個復(fù)孔)，隔天換液，連續(xù)培養(yǎng)1、3、5、7、9 d。在每個時間點，根據(jù)CCK-8試劑盒操作步驟檢測各組樣品的吸光度值(450 nm波長)。3次重復(fù)實驗后，統(tǒng)計分析。

1.2.5 堿性磷酸酶活性檢測和染色 將hBMSCs制備成單細胞懸液以1×104個/孔接種24孔板中，待細胞貼壁后更換無血清α-MEM培養(yǎng)液饑餓處理24 h，換α-MEM完全培養(yǎng)基及hAMC-CM條件培養(yǎng)基培養(yǎng)(每組設(shè)3個復(fù)孔)，隔天換液，3、5 d后依據(jù)試劑盒操作說明進行堿性磷酸酶活性檢測及染色。

1.2.6 茜素紅染色 將hBMSCs制備成單細胞懸液以5×104個/孔的細胞密度加在12孔板中待細胞貼壁后換無血清培養(yǎng)基，饑餓處理24 h后分別加入α-MEM完全培養(yǎng)基和hAMC-CM條件培養(yǎng)基配置的成骨誘導(dǎo)液(每組設(shè)3個復(fù)孔)，隔天換液，連續(xù)培養(yǎng)2周后按照染色試劑盒操作說明進行染色。掃描儀記錄染色結(jié)果后用10%氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液溶解染色結(jié)節(jié)，檢測各組吸光度值(560 nm波長)，記錄并作統(tǒng)計分析。

1.2.7 Western blot檢測 用RIPA蛋白裂解液及細胞刮棒收集培養(yǎng)7 d的P0和P2代hAMCs細胞蛋白，利用Western blot方法檢測上皮組織或間充質(zhì)來源的細胞特異性標(biāo)志蛋白CK-18、Vimentin以及E-Cadherin的表達量，用以鑒定不同代數(shù)培養(yǎng)的hAMCs的細胞來源。收集在成骨誘導(dǎo)過程中用α-MEM完全培養(yǎng)基和hAMC-CM條件培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d的hBMSCs細胞蛋白，用Western blot方法檢測成骨分化相關(guān)蛋白ALP、RUNX2、OSX、BSP、OPN、OCN以及Collagen Ⅰ的表達情況，用以檢測條件培養(yǎng)液對成骨作用的影響。類似的，收集不同培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d的hBMSCs細胞蛋白，用Western blot方法檢測自噬相關(guān)蛋白ATG5、Beclin1以及LC3b的表達，用以分析條件培養(yǎng)液對hBMSCs成骨分化過程中自噬行為的影響。實驗重復(fù)3 次。Image J分析各組條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 hAMCs的培養(yǎng)鑒定及擴增

通過組織塊結(jié)合Ⅰ型膠原酶消化法獲得混合生長的hAMCs，其中可以觀察到能相互共存的呈上皮樣生長的細胞群體以及呈成纖維細胞樣生長的細胞群體，細胞生長狀態(tài)良好，且隨著培養(yǎng)時間的持續(xù)，這些細胞群體可以持續(xù)增殖并融合(圖1A)。原代培養(yǎng)的hAMCs中上皮樣細胞(epithelial cell-like hAMCs, E-hAMCs)占據(jù)較多的生長空間而通過傳代培養(yǎng)后細胞的上皮樣群體逐漸萎縮，成纖維細胞樣群體(mesenchymal cell-like hAMCs, M-hAMCs)逐漸占據(jù)生長優(yōu)勢，但均可發(fā)現(xiàn)兩種細胞的存在。通過Western blot實驗我們發(fā)現(xiàn)P0代和P2代細胞均可表達上皮和間質(zhì)細胞的標(biāo)志蛋白，但在P0代hAMCs中上皮細胞來源的標(biāo)志蛋白CK-18和E-Cadherin表達強度強于P2代hAMCs，而間充質(zhì)細胞來源的標(biāo)志蛋白Vimentin的表達卻弱于P2代hAMCs(圖1B)，這與我們細胞培養(yǎng)過程中觀察到的現(xiàn)象一致。

A：原代培養(yǎng)的成釉細胞瘤細胞包括上皮樣及成纖維樣細胞群落；B：P0和P2代成釉細胞瘤細胞的來源鑒定；C：hAMC-CM培養(yǎng)hBMSCs后的細胞形態(tài)照片；D：CCK-8檢測hBMSCs增殖曲線

2.2 hAMC-CM對hBMSCs形態(tài)及增殖的影響

加入hAMC-CM的hBMSCs細胞形態(tài)與常規(guī)α-MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的hBMSCs細胞形體沒有區(qū)別，均呈梭形漩渦狀生長且生長狀態(tài)良好(圖1C)。通過CCK-8試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)hAMC-CM及α-MEM培養(yǎng)的hAMCs在前2 d均增殖稍慢，第3天進入快速生長期，第7 天左右增殖放緩進入平臺期，整體生長曲線近“S”型，各時間點增殖指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，說明hAMC-CM對hBMSCs的增殖狀態(tài)沒有影響(圖1D)。

2.3 hAMCs-CM對hBMSCs早期成骨能力的影響

hAMCs-CM及α-MEM培養(yǎng)基配制的成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)hBMSCs 5 d后，固定細胞ALP染色發(fā)現(xiàn)加入hAMC-CM后hBMSCs的ALP染色強度較α-MEM單純培養(yǎng)組弱(圖2A)。而分別培養(yǎng)3、5 d后，ALP活性檢測結(jié)果顯示單純培養(yǎng)組明顯高于條件培養(yǎng)液組，且培養(yǎng)5 d的ALP活性高于3 d組，各組間均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(圖2B)。通過Western blot實驗發(fā)現(xiàn)成骨早期的轉(zhuǎn)錄因子蛋白RUNX2、OSX以及成骨蛋白ALP在加入hAMC-CM后表達均有不同程度的下調(diào)，灰度值分析具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)(圖2)。

A：hAMC-CM培養(yǎng)hBMSCs 5 d后的堿性磷酸酶染色結(jié)果；B：hAMC-CM培養(yǎng)hBMSCs 3、5 d后的堿性磷酸酶活性檢測結(jié)果；C：hAMC-CM培養(yǎng)hBMSCs 7 d后RUNX2、ALP及OSX的表達情況；D：圖C蛋白條帶的灰度值分析；*：P<0.05,**:P<0.01

2.4 hAMC-CM對hBMSCs晚期成骨能力的影響

兩種培養(yǎng)液配置的成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)hBMSCs 14 d后進行茜素紅染色，結(jié)果顯示α-MEM培養(yǎng)液組著色程度及范圍明顯強于hAMC-CM培養(yǎng)液組(圖3A)，利用10% CPC溶液溶解經(jīng)茜素紅染色后的鈣化結(jié)節(jié)，然后進行相應(yīng)的定量檢測發(fā)現(xiàn)α-MEM培養(yǎng)液組鈣離子濃度顯著高于條件培養(yǎng)液組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖3A)。通過Western blot實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)成骨晚期的相關(guān)蛋白BSP、OPN、OCN以及Collagen Ⅰ的表達在加入hAMC-CM后均有不同程度的下調(diào)，灰度值分析具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01或P<0.05)(圖3)。

A：不同培養(yǎng)液培養(yǎng)hBMSCs 14 d后的茜素紅染色結(jié)果；B：茜素紅染色結(jié)果的鈣離子含量分析；C：不同培養(yǎng)液培養(yǎng)hBMSCs 7 d后BSP、OPN、OCN及Collagen Ⅰ的表達情況；D：圖C蛋白條帶的灰度值分析；*：P<0.05,**:P<0.01

2.5 hAMC-CM對hBMSCs自噬活性的影響

hAMC-CM培養(yǎng)hBMSCs 7 d后通過Western blot實驗發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白ATG5、Beclin1和LC3b的表達較正常培養(yǎng)組均有明顯下調(diào)，灰度值分析，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖4)。說明加入了成釉細胞條件培養(yǎng)液后hBMSCs的自噬活性受到了抑制。

A：hAMC-CM培養(yǎng)hBMSCs 7 d后ATG5、Beclin1及LC3b的表達情況；B：自噬相關(guān)蛋白ATG5、Beclin1及LC3b的灰度值分析；**:P<0.01

3 討 論

本研究根據(jù)文獻所報道的方法[15]分離提取的分離成釉細胞瘤細胞(hAMCs)呈現(xiàn)兩種主要的細胞形態(tài)，即內(nèi)皮細胞樣成釉細胞瘤細胞(epithelial cell-like hAMCs, E-hAMCs)和間充質(zhì)樣成釉細胞瘤細胞(mesenchymal cell-like hAMCs， M-hAMCs)，符合成釉細胞瘤公認(rèn)的組織病理結(jié)構(gòu)中存在上皮成分和纖維成分的特征，通過Western blot對所提取的hAMCs的標(biāo)志物進行驗證，其也與成釉細胞瘤研究的相關(guān)文獻中所提取的hAMCs特征相一致[15-16]。然而，本研究中所獲得的hAMCs在原代培養(yǎng)傳代后出現(xiàn)增殖緩慢，到P2代時逐漸呈現(xiàn)停止增殖并凋亡的趨勢。因此本研究中所收集的hAMCs條件培養(yǎng)液(hAMC-CM)為生長增殖狀態(tài)基本正常的P2代之前的細胞條件培養(yǎng)液(收集時經(jīng)過0.22 μm過濾)。

為研究hAMCs對骨再生的影響，本研究選擇標(biāo)準(zhǔn)提取流程所獲得的hBMSCs作為細胞模型進行體外實驗。首先驗證hAMC-CM的毒性作用，通過CCK-8驗證hBMSCs在hAMC-CM中的增殖情況，結(jié)果顯示，細胞的形態(tài)和增殖情況與對照組(α-MEM)無統(tǒng)計學(xué)差異。因此我們可以判定后續(xù)用hAMC-CM培養(yǎng)的hBMSCs在成骨表型中的所呈現(xiàn)的與對照的差異并非來自hAMC-CM的毒性。我們在實驗中對hBMSCs進行成骨誘導(dǎo)，并選取成骨誘導(dǎo)早期、晚期的特征性實驗和相關(guān)蛋白水平的標(biāo)志物進行驗證[17]。在成骨誘導(dǎo)液中摻入hAMC-CM后，hBMSCs的ALP活性明顯受到抑制，成骨早期的標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄因子RUNX2、OSX以及胞內(nèi)ALP表達顯著下降。RUNX2和OSX同為成骨相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，表達于細胞核內(nèi)，是干細胞成骨分化調(diào)控的重要因子，抑制其表達會直接抑制細胞成骨分化[18]。而ALP是成骨細胞表面標(biāo)志物之一，直接反映成骨細胞的活性或功能狀況[19]，ALP表達降低、活性降低都反映出成骨細胞礦化障礙。經(jīng)過14 d的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，hAMC-CM對hBMSCs成骨分化呈現(xiàn)持續(xù)性的抑制，hBMSCs所形成的礦化結(jié)節(jié)明顯少于對照組。成骨表型相關(guān)的標(biāo)志物OCN、BSP、Collagen Ⅰ[17]也都呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢。腫瘤組織會侵蝕破壞正常頜骨，造成骨質(zhì)破壞。而另一方面，由上述實驗結(jié)果分析可知，成釉細胞瘤還會對正常的骨髓干細胞的成骨分化進行抑制，進而使機體失去自我修復(fù)的能力，間接加重頜骨病變。

已有大量報道發(fā)現(xiàn)hBMSCs的成骨分化過程存在自噬現(xiàn)象[20-21]。為了進一步驗證hAMCs分析對hBMSCs成骨抑制的作用機制，我們驗證了hAMC-CM是否會抑制hBMSCs的自噬水平。結(jié)果顯示hAMC-CM顯著抑制了hBMSCs中自噬相關(guān)標(biāo)志物Beclin1、ATG5和LC3b的表達。Beclin 是自噬過程中重要的調(diào)節(jié)分子[22]，Beclin1主要通過與PI3K形成復(fù)合體來調(diào)節(jié)ATG蛋白在自噬前體結(jié)構(gòu)中定位，調(diào)節(jié)自噬活性[23]。ATG5則是自噬形成的標(biāo)志，其表達量可在某種程度上反應(yīng)細胞自噬活性[24]。LC3是自噬泡膜的通用標(biāo)記物，主要有兩種存在形式：LC3a(胞質(zhì)型)及LC3b(膜型)[25]。LC3a轉(zhuǎn)變?yōu)長C3b表示自噬體形成，因此LC3b常被作為自噬體形成的分子標(biāo)志。結(jié)果表明：成釉細胞瘤細胞在抑制hBMSCs成骨分化的同時還可以抑制hBMSCs自噬，阻礙干細胞的自我循環(huán)利用，間接影響骨髓干細胞對頜骨病損的修復(fù)進程。

4 結(jié) 論

本研究通過分離hAMCs，所收集hAMC-CM可抑制hBMSCs成骨分化，且這一抑制作用與hBMSCs的自噬水平降低密切相關(guān)。說明成釉細胞瘤組織侵蝕正常頜骨組織的同時，間接抑制骨髓間充質(zhì)干細胞促進骨再生的能力。這一研究結(jié)論的意義在于，手術(shù)切除成釉細胞瘤后，可通過調(diào)節(jié)缺損處腫瘤微環(huán)境中骨髓干細胞的自噬水平促進機體內(nèi)源性骨再生，為成釉細胞瘤術(shù)后骨再生提供補充治療策略。