高雪，呂偉華，馬波，王念民，韓世成，張穎

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070;2.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306）

與其他脊椎動物一樣，魚類的生殖活動主要受下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)控，促性腺激素釋放激素（GnRH）、促性腺激素（GtHs）和性腺類固醇激素在該過程中起著重要的調(diào)控作用[1]。GnRH 誘導(dǎo)垂體合成并釋放GtHs，與細(xì)胞表面上的同源受體GtHRs 結(jié)合而協(xié)同參與體內(nèi)重要的生理過程[2,3]。促黃體素釋放激素類似物（LHRH-A）是哺乳類GnRH的類似物，可以刺激鯉Cyprinus carpio、鯽Carassius auratus 和草魚Ctenopharyngodon idellus 垂體碎片中基礎(chǔ)GtH 的釋放[4]。GtHs 由垂體糖蛋白激素共有的α 亞基和每個GtH 獨(dú)特的β 亞基組成。已在多種魚類中確認(rèn)，在魚類的各個生長階段和生殖循環(huán)過程中都有表達(dá)，各自發(fā)揮著不同的生理功能[5-7]。與哺乳動物一樣，魚類的α 亞基含有兩個潛在的N-糖基化位點(diǎn)和10 個位于相同序列位置的保守半胱氨酸，形成五個分子內(nèi)的二硫鍵，在魚類中的氨基酸水平上最為保守[8]。硬骨魚類GtH 的生理作用最先在鮭科魚類中證實(shí)，它在卵子生成、發(fā)育、成熟、排精排卵以及類固醇激素信號傳導(dǎo)方面發(fā)揮著重要作用[9,10]。目前，已經(jīng)在條紋狼鱸Morone saxatilis[11]、日本鰻鱺Anjuilla japonica[12]、西伯利亞鱘Acipenser baeri[13]、大馬哈魚Oncorhynchus keta Walbaum[14]和撫仙金錢鲃Sinocyclocheilus tingi[15]等多種硬骨魚中克隆得到GtHα 基因。

施氏鱘Acipenser schrenckii 隸屬于鱘形目、鱘科、鱘屬，在我國黑龍江、烏蘇里江和松花江等地均有分布，是我國重要的養(yǎng)殖鱘[16]。施氏鱘肉質(zhì)鮮美、生長迅速、抗病力強(qiáng)，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，尤其是魚卵營養(yǎng)價(jià)值更高,有“黑色珍珠”的美譽(yù)[17]。施氏鱘性成熟晚，無副性征，研究其性腺發(fā)育調(diào)控，尤其是早期配子形成的分子調(diào)控機(jī)制，具有重要意義。施氏鱘的生殖活動受下丘腦-垂體-性腺軸（HPG軸）的調(diào)控，其中促性腺激素具有重要的作用，克隆GTHα 基因，研究其在施氏鱘早期性腺分化中的表達(dá)、分布及調(diào)控作用，掌握GTHα 基因的時空規(guī)律，為進(jìn)一步闡明GTHα 的生理功能和分子機(jī)制和施氏鱘早期生殖調(diào)控提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及樣品采集

實(shí)驗(yàn)魚由北京市水產(chǎn)科學(xué)研究院鱘魚工程繁育中心提供。選取同一時期90 日齡的施氏鱘120尾，魚體質(zhì)量為38～55 g，體長201～266 mm。實(shí)驗(yàn)魚隨機(jī)分為4 組，每組30 尾，分別注射生理鹽水（對照組）和1 μg/kg、3 μg/kg 和5 μg/kg 的LHRH-A，生理鹽水為實(shí)驗(yàn)室自配。各組分別于注射后1 d、3 d、5 d 和7 d 采集施氏鱘的性腺和垂體，每次取9 尾，每3 尾混合成一個樣，共三個平行，液氮迅速冷凍后轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。另? 尾體質(zhì)量為（4.8±2.23）kg 的施氏鱘，取其心、肝、腎、脾、腸、鰓、腦及卵巢等組織，液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA 的提取和cDNA 合成

利用總RNA 提取試劑盒（Promega），按照說明書提取施氏鱘性腺、垂體等各組織中的總RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測其RNA 的完整性，超微量核酸蛋白測定儀（Thermo Scientific,美國）檢測RNA 的質(zhì)量和濃度，以施氏鱘總RNA 為模板，取1 μg 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒GoScriptTMReverse Transcription Mix，Oligo DT（Promega）的操作說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈，合成的cDNA 均稀釋10 倍后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 施氏鱘GtHα 基因全長克隆

采用同源克隆的方法，根據(jù)NCBI 已報(bào)道的中華鱘Acipenser sinensis GtHα 全長序列（登錄號為EU656137.1）的保守區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)核心引物。引物由吉林庫美生物技術(shù)公司合成（表1）。以施氏鱘性腺組織的cDNA 為模板，采用Ex Taq Version 2.0 plus dye（TaKaRa）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃10 s，60 ℃30 s，72 ℃1 min，35 個循環(huán)，1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR 產(chǎn)物檢測（110V，25min）。用DNA瓊脂糖凝膠純化試劑盒（CWBIO）回收目的片段切膠，純化片段連接到pMD18-T（TaKaRa）載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含Amp的LB 平板上37 ℃培養(yǎng)過夜。經(jīng)菌落PCR 鑒定后挑選陽性克隆送吉林庫美生物科技有限公司測序。根據(jù)已經(jīng)獲得的核心片段設(shè)計(jì)5'RACE 和3'RACE的特異性引物（表1）。以RACE cDNA 第一鏈為模板，用引物UPM 和GtHα 外側(cè)引物進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，隨后以第一輪PCR 產(chǎn)物的稀釋液為模板，用NUP 和GtHα 內(nèi)側(cè)引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，按照SMARTer?RACE 5'/3'Ki（tTaKaRa，clontech）試劑盒的說明書進(jìn)行操作，膠回收、連接、轉(zhuǎn)化及測序步驟同上。

1.4 施氏鱘GtHα 基因的序列分析

將獲得的GtHα 核心片段、3' RACE 和5'RACE 測序結(jié)果，用DNAMAN 8.0 進(jìn)行拼接得到全長cDNA 序列，使用在線軟件ORF Finder 查找其開放閱讀框（ORF）并推導(dǎo)為相應(yīng)的氨基酸序列，應(yīng)用NCBI 中BLAST 程序?qū)tHα 基因序列進(jìn)行比對。利用Mega 7.0 和Clustal X 軟件，構(gòu)建Neighbor-Joining 系統(tǒng)進(jìn)化樹。用TMHMM Server v.2.0 預(yù)測蛋白的跨膜區(qū)，用蛋白在線分析系統(tǒng)（Expert Protein Analysis System,Ex PASy）分析其基本物理化學(xué)參數(shù)、疏水性、信號肽、亞細(xì)胞定位、功能位點(diǎn)及二結(jié)構(gòu)預(yù)測等信息。

1.5 實(shí)時熒光定量PCR

根據(jù)已得GtHα 的基因序列設(shè)計(jì)熒光定量引物和β-actin 基因設(shè)計(jì)內(nèi)參引物（表1）。以cDNA 為模板，采用半定量RT-PCR 和熒光定量qRT-PCR方法，檢測GtHα 基因mRNA 在施氏鱘各組織中的表達(dá)及LHRH-A 對GtHα mRNA 表達(dá)的影響。熒光定量PCR 儀型號為ABI 7500（Applied Biosystems,USA），熒光試劑使用SYBRGreen Ex Taq（Takara,Ⅱ中國大連），按照說明書進(jìn)行程序設(shè)定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果采用2-ΔΔCT方法計(jì)算GtHα 基因的相對表達(dá)量，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。為確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，每個樣品設(shè)3 次重復(fù)。用SPSS 進(jìn)行單因素方差分析和Duncan 多重比較，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 施氏鱘GtHα 的序列分析和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測

施氏鱘GtHα cDNA 序列全長2 696 bp，包括5'端非編碼區(qū)（5' UTR）54 bp，開放閱讀框（ORF）348 bp 以及3'端非編碼區(qū)（3'UTR）243 bp，在3'端非編碼區(qū)內(nèi)含有1 個加尾信號AAT AAA，共編碼115 個氨基酸。Signal P 3.0 預(yù)測顯示：第1～24 個氨基酸為信號肽，第25～115 個氨基酸為成熟肽。成熟肽序列中的第34、37、55、58、59、86、87、105、107 和110 氨基酸處為10 個較為保守的半胱氨酸Cys 殘基；在第105 和107 Cys 殘基中間間隔了1 個組氨酸His，形成CXC 型趨化因子的特殊結(jié)構(gòu)（圖1）。在GtHα 氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)了2 個N-糖基化位點(diǎn)（NIT）和（NHT）（圖3）。ExPASy 在線軟件的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析顯示，施氏鱘GTHα 蛋白質(zhì)分子式為C574H898N156O164S15，相對分子量為13.09Kda，理論P(yáng)I值為8.83。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)中以α-螺旋占38.26%和無規(guī)則卷曲為42.61%為主（圖2）。該序列中大多數(shù)氨基酸為親水性氨基酸，所以認(rèn)為GTHα屬于親水性蛋白質(zhì)。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物及序列Tab.1 Names and sequences of the primers used in this study

2.2 施氏鱘GtHα 氨基酸同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化分析

GtHα 的氨基酸序列與其他物種的比較表明：施氏鱘GtHα 與中華鱘Acipenser sinensis 的同源性最高（98%）；其次是西伯利亞鱘Acipenser baeri（96%）和俄羅斯鱘Acipenser gueldenstaedtii（94%）；與斑馬魚Danio rerio 同源性為76%；與其他脊椎動物GtHα 氨基酸序列的同源性在72%～80%，在進(jìn)化中較為保守。用軟件MEGA7.0 構(gòu)建的施氏鱘GtHα 氨基酸序列的NJ 系統(tǒng)進(jìn)化樹表明：施氏鱘與鱘形目魚類的親緣關(guān)系較近,與中華鱘和西伯利亞鱘聚為1 個小分支，與非硬骨魚類的其他脊椎動物構(gòu)成一個大分支，推測與該物種的特殊性有關(guān)（圖4）。

2.3 施氏鱘GtHα 在不同組織中的表達(dá)

以β-actin 基因?yàn)閮?nèi)參，采用實(shí)時定量PCR（RT-qPCR）法檢測GtHα mRNA 在施氏鱘不同組織中的表達(dá)（圖5）。結(jié)果表明：施氏鱘的促性腺激素α 亞基在心臟、肝、脾、垂體和性腺等10 種組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量明顯不同。GtHα mRNA 在垂體中表達(dá)量最高，其次為性腺和腎臟，相對于心、脾臟、腸道、肌肉、皮膚、鰓差異性顯著（P＜0.05），而在肌肉、皮膚、肌肉和心臟之間的表達(dá)差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 LHRH-A 對施氏鱘GtHα mRNA 表達(dá)的影響

利用熒光定量PCR 法檢測了施氏鱘在注射LHRH-A 后不同時間垂體和性腺中GtHα mRNA的相對表達(dá)水平。結(jié)果顯示：不同注射劑量組垂體中GtHα mRNA 在各時間點(diǎn)的相對表達(dá)量均明顯低于對照組（P＜0.05）（圖6），說明LHRH-A 抑制了施氏鱘垂體組織中GtHα 基因的表達(dá)；與垂體中GTHα 的表達(dá)模式不同，性腺組織中各濃度組的GtHα 基因則呈先升高后降低的表達(dá)趨勢，但各濃度組GtHα 達(dá)到最高表達(dá)量的時間不同。注射劑量為3μg/kg 組的GTHα 表達(dá)量較高，在注射后第3 d達(dá)最高峰，表明LHRH-A 處理后GtHα 大量表達(dá)。1 μg/kg 組在第3 d 達(dá)峰值，5 μg/kg 組在第5 d 達(dá)峰值，均顯著高于對照組（P＜0.05）（圖7）。

3 討論

本研究克隆得到了施氏鱘促性腺激素α 亞基的全長cDNA 序列。序列分析發(fā)現(xiàn)，GtHα 成熟肽序列中含有10 個保守的半胱氨酸殘基和2 個N－糖基化位點(diǎn),在第58、59 和86、88 位的氨基酸上有2 對相鄰的半胱氨，該結(jié)構(gòu)與條石鯛Oplegnathidea fasciatu[18]的研究結(jié)果相似。在半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis 和真鯛Pagrus major 的研究中也有類似的發(fā)現(xiàn)[19,20]。Milton[21]等將GtHα 歸為蛋白質(zhì)的“半胱氨酸結(jié)”超家族，包含由六種半胱氨酸形成的“半胱氨酸結(jié)基序”。這些半胱氨酸通過三個分子內(nèi)二硫鍵以特定方式連接，推測可能與受體的結(jié)合有關(guān)。同源性分析發(fā)現(xiàn)，GtHα 氨基酸序列與中華鱘的相似度高達(dá)98%，可以確定其為施氏鱘GtHα。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，施氏鱘與其他鱘形目的魚類聚在1 個分支節(jié)點(diǎn)上，符合形態(tài)學(xué)上得出的分類進(jìn)化地位。然而，在進(jìn)化樹分析中發(fā)現(xiàn)，施氏鱘、中華鱘等與哺乳類和爬行類動物聚為一大支，可能與鱘魚為古老特殊的物種有關(guān)。

熒光定量PCR 結(jié)果表明，施氏鱘的GtHα 基因在性腺、垂體、肝臟、脾、腎臟和肌肉等組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量不同。這種多組織表達(dá)特性暗示：GtHα 有更廣泛的生理功能。GtHα 在垂體中表達(dá)量最高，表明垂體是主要的分泌部位。該結(jié)果與大多數(shù)硬骨魚類相同[22]。該基因在性腺和腎臟中也有較高表達(dá)，而在肝臟、脾、腸道、肌肉和皮膚中僅微量表達(dá)，這在半滑舌鰨[20]和斑馬魚[23]中均有相似的發(fā)現(xiàn)，但在大西洋鱈Gadus morhus 的心、頭腎、肌肉和腸中并未發(fā)現(xiàn)GtHα mRNA 的表達(dá)[24]。Parhar 等[25]和wahlstr 等[26]通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色法證明了促性腺激素α 亞基在一些魚類及哺乳動物（包括人類）垂體之外的組織中的表達(dá)。以上研究推斷，施氏鱘的GtHα 基因在生殖中起重要調(diào)控作用，可能具有更廣泛的垂體外生理功能。

LHRH-A 是人工合成GnRH 的高活性類似物，能夠促進(jìn)魚類生殖活動。GnRH 在離體或在體內(nèi)的情況下都可以刺激魚類腦垂體產(chǎn)生和釋放GtHs，促進(jìn)魚類的性腺發(fā)育[27]。Olivereau 等[28]研究表明，LHRH-A 能促使歐洲鰻鱺Anguilla anguilla GtHs 的分泌和性腺發(fā)育。在性腺分化早期，注射LHRH-A能一定程度提高鲇血清中GtH 水平[29]。Kumakura等[30]研究表明，單獨(dú)施用GnRH 激動劑可以刺激真鯛Pagrus major 性腺早熟。本研究發(fā)現(xiàn)，給施氏鱘腹腔注射不同劑量LHRH-A 后，抑制了垂體中GtHα mRNA 的表達(dá)，表達(dá)量顯著低于對照組（P＜0.05）。與垂體的表達(dá)模式不同，不同劑量組中施氏鱘性腺GtHα mRNA 的表達(dá)量在均高于對照組（P＜0.05），且呈先升高后降低的變化趨勢，劑量為3 μg/kg 組在注射后的第3 d 達(dá)最高表達(dá)量。以上推測，LHRH-A 進(jìn)入魚體后，可能阻斷了自身GnRH 的產(chǎn)生，從而抑制了垂體中GTHα 的分泌。垂體分泌的GtH 通過血液遷移到性腺中，GTHα 的高表達(dá)暗示外援性的LHRH-A 可能直接作用于性腺，促進(jìn)GtHα 的分泌。謝嘉華等[31]研究發(fā)現(xiàn)，給金鯽投喂LHRH-A 0.01 mg/g 的飼料顯著刺激了內(nèi)源的GtH合成和分泌，促進(jìn)性腺發(fā)育成熟,但過高的劑量反而表現(xiàn)出一定的抑制作用。本研究中，5 μg/kg 組性腺中GtHα 的表達(dá)量顯著低于1 μg/kg 組和3 μg/kg 組，這與前人的研究結(jié)果相似。林浩然[32]等對金魚的研究也證明了LHRH-A 存在自身增效和抑制作用。綜上，揭示了LHRH-A 可通過調(diào)控GtHα的表達(dá)參與施氏鱘的早期性腺發(fā)育。