龔曉平 況曉明 羅挺 李加勝 莫春紅 何煥然 趙許兵 余偉 張致力

摘要 [目的]對(duì)低溫脅迫下苗期水稻（Oryza sativa L.）進(jìn)行耐冷性生理學(xué)和形態(tài)學(xué)鑒定，為耐冷相關(guān)基因定位和克隆奠定基礎(chǔ)。[方法]以耐冷秈稻材料P1211和冷敏型秈稻突變體cisc（ta）為試驗(yàn)材料，于苗期在人工氣候箱中進(jìn)行低溫脅迫處理（12 ℃），以適溫處理（25 ℃）的參試材料作為對(duì)照，研究低溫脅迫對(duì)水稻冷敏感突變體cisc（ta）苗期抗氧化系統(tǒng)和氨基酸積累的影響。[結(jié)果]與適溫處理相比，P1211和cisc（ta）在低溫下幼苗株高、冠鮮重、冠干重、最長(zhǎng)根長(zhǎng)、根鮮重、根干重顯著下降;同時(shí)葉片抗氧化酶活性（SOD、POD、CAT），可溶性蛋白，光合色素含量不同程度降低，冷敏型秈稻突變體cisc（ta）幼苗的降幅大于耐冷秈稻材料P1211;此外，在長(zhǎng)期低溫脅迫下，突變體cisc（ta）葉片丙二醛含量極顯著增加，而P1211無(wú)顯著差異。低溫脅迫后P1211和突變體cisc（ta）的脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸含量極顯著增加，而亮氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸的含量極顯著降低，其中突變體cisc（ta）精氨酸的含量增幅最大?；謴?fù)正常處理后，突變體cisc（ta）葉片光合色素含量恢復(fù)到正常（CK）水平，但株高顯著變矮，成熟期結(jié)實(shí)率和產(chǎn)量降低。[結(jié)論]低溫脅迫處理影響突變體cisc（ta）幼苗生長(zhǎng)特性，降低了葉片抗氧化酶活性，提高了脯氨酸和游離氨基酸的含量。該研究加深了對(duì)水稻苗期耐冷性生理基礎(chǔ)的全面認(rèn)識(shí)，并為相關(guān)基因的克隆及水稻耐冷分子育種奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 水稻;低溫脅迫;耐冷性;抗氧化系統(tǒng);游離氨基酸

中圖分類號(hào) S511? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）24-0055-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.24.013

Effects of Low Temperature Stress on Antioxidant System and Amino Acid Accumulation of Rice Mutant cisc （ta） at Seedling Stage

GONG Xiao-ping，KUANG Xiao-ming，LUO Ting et al （Yudongnan Academy of Agricultural Sciences，Chongqing 408000）

Abstract [Objective]To identify the physiological and morphological of cold tolerance of rice （Oryza sative L.）at seedling stage under low temperature stress，so as to lay a foundation for the localization and cloning of cold tolerance related genes.[Method] Using cold-tolerant indica rice material P1211 and cold-sensitive indica rice mutant cisc（ta） as test materials，low-temperature stress treatment （12 ℃） was carried out in an artificial climate incubator at the seedling stage，and suitable temperature treatment （25 ℃） was used as the test material.The test materials were used as controls to study the effects of low temperature stress on the antioxidant system and amino acid accumulation in the seedling stage of the cold-sensitive mutant cisc（ta） of rice.[Result]Compared with the suitable temperature treatment，the seedling height，shoot fresh weight，shoot dry weight，longest root length，root fresh weight and root dry weight of P1211 and cisc（ta） were significantly reduced under low temperature;at the same time，the activities of antioxidant enzymes （SOD，POD，CAT），soluble protein and photosynthetic pigment in leaves decreased in varying degrees.The decline of cold sensitive indica rice mutant cisc（ta） seedlings was greater than that of cold tolerant indica rice material P1211;in addition，under long-term low temperature stress，the content of malondialdehyde in leaves of mutant cisc（ta） increased significantly，but there was no significant difference in P1211.After low temperature stress，the contents of proline，arginine，aspartate，glutamate and lysine in P1211 and mutant cisc（ta） increased significantly，while the contents of leucine，methionine and isoleucine decreased significantly.The content of arginine experienced the biggest growth in the cisc（ta） mutant.After the normal treatment was restored，the photosynthetic pigment content of the mutant cisc（ta） leaves returned to the normal （CK） level，but the plant height was significantly shorter，and the seed setting rate and yield at the maturity stage were reduced.[Conclusion]Low temperature stress treatment affected the growth characteristics of mutant cisc（ta） seedlings，reduced leaf antioxidant enzyme activities，and increased the contents of proline and free amino acids.This study deepened the comprehensive understanding of the physiological basis of rice cold tolerance at seedling stage，and laid a foundation for the cloning of related genes and rice cold tolerance molecular breeding.

Key words Rice;Low temperature stress;Cold tolerance;Antioxidative systems;Free amino acid

基金項(xiàng)目 重慶市基礎(chǔ)研究與前沿探索項(xiàng)目（cstc2018jcyjAX0447）。

作者簡(jiǎn)介 龔曉平（1980—），男，重慶墊江人，副研究員，博士，從事水稻遺傳育種、分子生物學(xué)研究。*通信作者，研究員，主要從事水稻遺傳育種研究。

收稿日期 2021-04-11

水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的禾谷類作物，也是超過(guò)50%人口的主要糧食。需要培育具有高產(chǎn)潛力和對(duì)逆境脅迫具有強(qiáng)且持久抗性的品種，以滿足人們對(duì)水稻的需求。水稻起源于熱帶/亞熱帶地區(qū)，因此對(duì)低溫脅迫非常敏感，低溫冷害對(duì)水稻造成多種損害，包括種子發(fā)芽不良、幼苗失綠白化或枯萎、分蘗減少、孕穗期不育以及抽穗開(kāi)花期穎殼不張開(kāi)、花藥不開(kāi)裂、花粉不發(fā)育而造成不育[1-3]。因此，低溫冷害是限制水稻產(chǎn)量和種植面積擴(kuò)大的世界性問(wèn)題。近年來(lái)，直播水稻因成本低、操作簡(jiǎn)潔而在世界范圍內(nèi)得到廣泛應(yīng)用。然而，將預(yù)發(fā)芽種子直接播種在冷水田里很容易受到冷脅迫的影響，提高水稻在萌發(fā)期和芽期的耐冷性成為直播水稻品種選育過(guò)程中的主要難題。因此，鑒定水稻耐冷性相關(guān)基因，深入了解水稻對(duì)冷脅迫的反應(yīng)機(jī)制，將有助于水稻耐寒性的遺傳改良。

植物在冷脅迫下會(huì)發(fā)生許多生理變化，包括對(duì)細(xì)胞膜的直接和間接損傷。冷脅迫可以使細(xì)胞膜受到損傷，引起電解質(zhì)滲漏，同時(shí)破壞細(xì)胞環(huán)境，導(dǎo)致細(xì)胞器功能下降[4-5]。光系統(tǒng)II （PSII）被認(rèn)為是與逆境脅迫或衰老相關(guān)的光合作用元件損傷的主要部位[6]，而冷脅迫下PSII損傷可引起葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度的變化。低溫脅迫導(dǎo)致亞細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS，如H2O2、O2-和HO-）的積累[7]。這些過(guò)多的活性氧在低溫下不僅破壞細(xì)胞膜和葉綠體結(jié)構(gòu)，抑制光合作用和葉綠素?zé)晒?，而且?huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)、DNA和脂類的氧化損傷，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞功能受損甚至植株死亡[8]。丙二醛（MDA）是磷脂中不飽和脂肪酸過(guò)氧化的產(chǎn)物，是導(dǎo)致冷脅迫下細(xì)胞膜損傷的主要原因[9-10]。植物已經(jīng)建立了利用防御酶提高抗寒能力的高效活性氧清除體系，防御酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT），這些防御酶在植物細(xì)胞中對(duì)ROS的積累起積極的抑制作用[11]。同時(shí)，植物也可以通過(guò)增加可溶性蛋白、可溶性糖、游離氨基酸和脫落酸（ABA）等滲透物質(zhì)的含量來(lái)減少冷脅迫造成的損害[12-13]。游離氨基酸具有很強(qiáng)的親和性，能增加細(xì)胞液的濃度，對(duì)原生質(zhì)的保水能力及膠體穩(wěn)定性有一定作用[14]，游離氨基酸中的脯氨酸廣泛參與滲透調(diào)節(jié)、碳氮代謝，保護(hù)多數(shù)酶類物質(zhì)，增強(qiáng)植物抗低溫脅迫能力[15]。

水稻苗期耐冷性形態(tài)學(xué)和生理學(xué)的準(zhǔn)確鑒定是耐冷相關(guān)基因定位和克隆的基礎(chǔ)。該研究以耐冷秈稻材料P1211和冷敏型秈稻突變體cisc（ta）為試驗(yàn)材料，進(jìn)行低溫脅迫處理，檢測(cè)其表型特征、抗氧化生理指標(biāo)和氨基酸積累的差異。深入分析冷敏型秈稻突變體cisc（ta）幼苗在低溫脅迫下的生長(zhǎng)變化和生理特性，為鑒定和分離出水稻耐冷脅迫潛在的候選基因，并全面、深入了解水稻耐冷性的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 突變體cisc（ta）是在重慶渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院開(kāi)展水稻育種過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的1個(gè)苗期低溫失綠突變體，材料命名為cisc（ta）（cold-induced seedling chlorosis）。經(jīng)連續(xù)多代自交得到純合的穩(wěn)定遺傳株系。秈稻材料P1211和突變體cisc（ta）的秧苗經(jīng)低溫脅迫處理后進(jìn)行表型特征觀察和相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定，均以適溫（25 ℃）處理?xiàng)l件下的P1211和突變體cisc（ta）為對(duì)照。

1.2 低溫脅迫處理 各選取P1211與突變體cisc（ta）籽粒飽滿的種子進(jìn)行浸種、催芽，將萌發(fā)一致的芽谷分別播種于8 個(gè)塑料盤(pán)中，置于人工氣候箱中，在28 ℃/ 25 ℃，14 h/10 h 光暗交替培養(yǎng)，植株生長(zhǎng)到三葉期時(shí)，將其分別置于低溫（恒溫12 ℃）和適溫（恒溫25 ℃）的人工氣候箱，光照強(qiáng)度為180 μmol /（m2·s），光照12 h和黑暗12 h，處理7 d后，測(cè)定幼苗生長(zhǎng)狀況和耐冷相關(guān)生理指標(biāo)。低溫處理后的突變體cisc（ta）經(jīng)適溫恢復(fù)14 d后大田移栽，測(cè)定苗期經(jīng)過(guò)低溫（12 ℃）脅迫處理和適溫（25 ℃）處理的cisc（ta）CK在分蘗期和抽穗期葉綠素含量以及成熟期的農(nóng)藝性狀。

1.3 幼苗生長(zhǎng)狀況調(diào)查 低溫脅迫后，取10 株幼苗進(jìn)行株高、單株總根數(shù)、最長(zhǎng)根長(zhǎng)的測(cè)量;取100 株幼苗，將根與地上部分開(kāi)，吸干表面水分后稱量根和冠鮮重，然后在恒溫烘干箱80 ℃烘干，冷卻后稱量根和冠干重。

1.4 生理性狀測(cè)定 在苗期，采集12和25 ℃條件下的P1211和突變體cisc（ta）的葉片，放入采樣袋，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。葉綠素含量采用分光光度法測(cè)定[16]，丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定[17]，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定[18]，過(guò)氧化氫酶（CAT）活性采用紫外分光光度法測(cè)定[19]，過(guò)氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[20]，超氧化物歧化酶（SOD）活性采用淡藍(lán)四唑法測(cè)定[21]，游離氨基酸（脯氨酸、亮氨酸等）含量采用酸性茚三酮法測(cè)定[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫對(duì)P1211和突變體cisc（ta）幼苗植株形態(tài)的影響 經(jīng)低溫脅迫處理（12 ℃）后，突變體cisc（ta）幼苗地上部分（株高、冠鮮重、冠干重）和地下部分（總根數(shù)、最長(zhǎng)根長(zhǎng)、根鮮重和根干重）各形態(tài)指標(biāo)均顯著降低，且各指標(biāo)的降幅均大于P1211;低溫脅迫下，P1211的地上部分和地下部分指標(biāo)除總根數(shù)外，其余指標(biāo)均有顯著降低（表1）。低溫脅迫處理對(duì)水稻幼苗地上部和地下部生長(zhǎng)都產(chǎn)生了不利影響，且對(duì)突變體cisc（ta）的影響大于P1211，表明P1211的耐冷性顯著強(qiáng)于突變體cisc（ta）。

2.2 P1211和突變體cisc（ta）苗期低溫處理后葉片抗氧化生理性狀比較 經(jīng)低溫脅迫處理后，P1211和突變體cisc（ta）的氧化酶活性（SOD、POD、CAT），光合色素和可溶性蛋白含量不同程度降低，且突變體cisc（ta）的降幅遠(yuǎn)大于耐冷材料P1211（表2），表明低溫脅迫后突變體cisc（ta）清除超氧陰離子的能力嚴(yán)重下降，使得過(guò)氧化氫在植株內(nèi)積累，通過(guò)代謝過(guò)程將多余的氧氣轉(zhuǎn)化為對(duì)植株有毒的活性氧（ROS），導(dǎo)致葉片葉綠體結(jié)構(gòu)受到破壞、光合作用能力減弱。同時(shí)，突變體cisc（ta）的MDA含量極顯著增加，而P1211的MDA含量與對(duì)照間無(wú)顯著差異，表明突變體cisc（ta）在低溫脅迫后膜脂過(guò)氧化，造成生物膜損傷，引起磷脂中不飽和脂肪酸過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的極顯著增加，低溫脅迫下P1211的抗氧化防御系統(tǒng)清除ROS的能力明顯強(qiáng)于突變體cisc（ta）。

2.3 P1211和突變體cisc（ta）苗期低溫處理后葉片游離氨基酸含量比較 經(jīng)低溫脅迫后，植物細(xì)胞可以通過(guò)積累脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)減少或消除低溫?fù)p傷，增強(qiáng)其耐冷性[23]。在該研究中，經(jīng)過(guò)低溫處理（12℃）后，P1211和突變體cisc（ta）葉片的脯氨酸（Pro）、精氨酸（Arg）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、賴氨酸（Lys）極顯著增加，亮氨酸（Leu）、甲硫氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）的含量極顯著降低，突變體cisc（ta）積累Pro含量明顯比P1211要多，同時(shí)突變體cisc（ta）在低溫脅迫處理（12 ℃）后Arg的含量相當(dāng)于適溫處理（25 ℃）下的6.48倍（表3），表明可能是由于突變體cisc（ta）耐冷性功能基因缺失導(dǎo)致產(chǎn)生了過(guò)多的Arg。

2.4 苗期低溫脅迫處理對(duì)突變體cisc（ta）生長(zhǎng)發(fā)育及農(nóng)藝性狀的影響 在苗期，低溫脅迫處理后大田觀測(cè)突變體cisc（ta）葉片呈白色，光合色素含量極顯著低于適溫（25 ℃）處理?xiàng)l件下的cisc（ta） CK，將低溫處理后的植株移栽至大田，苗期、分蘗期和抽穗期的觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體cisc（ta）葉片逐漸從白色轉(zhuǎn)為綠色，光合色素含量逐漸恢復(fù)到正常水平，但株高顯著變矮（圖1）。成熟期，突變體cisc（ta）的株高、每穗總粒數(shù)、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)和結(jié)實(shí)率分別為對(duì)照的95.51%、68.92%、79.41%、68.75%和93.51%（表4）。突變體cisc（ta）的一次枝梗數(shù)和二次枝梗數(shù)極顯著減少，導(dǎo)致其每穗總粒數(shù)顯著減少。

3 結(jié)論與討論

當(dāng)植物遭受低溫脅迫時(shí)，能夠通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)使其體內(nèi)在分子、細(xì)胞、生理和生化水平上進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整，及時(shí)產(chǎn)生一系列的刺激應(yīng)答以抵御和適應(yīng)低溫脅迫[9]。當(dāng)植物完整的葉綠體發(fā)育受到長(zhǎng)期低溫脅迫后會(huì)嚴(yán)重破壞其葉綠體的微觀結(jié)構(gòu)和光合代謝，抑制光合色素的生物合成，最終導(dǎo)致葉片顏色的差異甚至植物死亡[24]。植物葉片的葉綠素含量高低和葉綠素?zé)晒鈪?shù)大小通常被作為判斷植物耐受逆境脅迫的重要指標(biāo)[25]。該研究中，P1211和突變體cisc（ta）在低溫脅迫后幼苗株高、冠鮮重、冠干重、最長(zhǎng)根長(zhǎng)、根鮮重、根干重極顯著下降，突變體cisc（ta）的降幅大于P1211，表明P1211的耐冷性顯著強(qiáng)于突變體cisc（ta）。將低溫處理后的突變體cisc（ta）恢復(fù)正常大田種植，其葉片從白色逐漸轉(zhuǎn)為綠色，光合色素含量逐漸恢復(fù)到正常水平。但在成熟期突變體cisc（ta）的一次枝梗數(shù)和二次枝梗數(shù)顯著減少，導(dǎo)致其每穗總粒數(shù)的減少，表明由于突變體cisc（ta）苗期耐冷性差，影響其農(nóng)藝性狀及經(jīng)濟(jì)性狀。

大量的研究表明，在植物正常生長(zhǎng)條件下，植物體內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生和清除處于平衡狀態(tài)，當(dāng)植物遭受低溫脅迫時(shí)，植物體內(nèi)ROS大量積累，引發(fā)膜脂過(guò)氧化，從而造成細(xì)胞膜系統(tǒng)損傷[26]。ROS 還會(huì)促進(jìn)多聚不飽和脂肪酸降解并產(chǎn)生MDA，導(dǎo)致冷脅迫下細(xì)胞膜進(jìn)一步的損傷[9-10]。植物擁有由抗氧化酶系統(tǒng)和非酶小分子抗氧化劑組成的抗氧化防御系統(tǒng)來(lái)清除ROS，從而減輕 ROS 對(duì)細(xì)胞的傷害[27]。該研究中，經(jīng)低溫脅迫處理后，P1211和突變體cisc（ta）的氧化酶活性（SOD、POD、CAT），光合色素和可溶性蛋白含量降低，且突變體cisc（ta）的降幅遠(yuǎn)大于耐冷材料P1211，表明低溫脅迫后突變體cisc（ta）葉片中的氧化酶活性（SOD、CAT）極顯著降低后，不能充分將超氧陰離子和過(guò)氧化氫變成水和氧分子，同時(shí)，過(guò)氧化物酶（POD）活性極顯著降低也減弱了POD以酚類化合物為底物分解H2O2的能力，使得H2O2在植株內(nèi)積累，通過(guò)代謝過(guò)程將多余的氧氣（O2）轉(zhuǎn)化為對(duì)植株有毒的活性氧（ROS），進(jìn)而導(dǎo)致葉片葉綠體結(jié)構(gòu)受到破壞、光合作用能力減弱。此外，低溫脅迫下突變體cisc（ta）的MDA含量極顯著增加，表明突變體cisc（ta）在低溫脅迫后膜脂過(guò)氧化，造成生物膜損傷，引起磷脂中不飽和脂肪酸過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的極顯著增加。該結(jié)果為低溫脅迫下突變體cisc（ta）的基因功能及表達(dá)譜分析奠定基礎(chǔ)。

游離氨基酸具有很強(qiáng)的親和性，能增加細(xì)胞液的濃度，對(duì)原生質(zhì)的保水能力及膠體穩(wěn)定性有一定作用[14]。在持續(xù)低溫下，植物體中脯氨酸能夠清除低溫逆境反應(yīng)產(chǎn)生的過(guò)量氫離子（H+），維持細(xì)胞質(zhì)中有氧呼吸的最佳pH，通過(guò)其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)結(jié)合來(lái)提高蛋白的親水性，保護(hù)低溫下多數(shù)酶類物質(zhì)，避免酶變性失活，維持蛋白合成[15]。龔明等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在長(zhǎng)期冷害處理下抗冷性弱的IR24積累脯氨酸含量明顯比抗冷性強(qiáng)的青林9號(hào)多。在該研究中，經(jīng)過(guò)低溫處理后，P1211和突變體cisc（ta）葉片中的Pro、Arg、Asp、Glu、Lys含量極顯著增加，Leu、Met、Ile含量極顯著降低，突變體cisc（ta）積累脯氨酸含量明顯比P1211多，同時(shí)突變體cisc（ta）在低溫脅迫處理后Arg含量相當(dāng)于適溫處理下的6.48倍，表明可能是由于突變體cisc（ta）耐冷性功能基因缺失導(dǎo)致產(chǎn)生了過(guò)多的Arg。突變體cisc（ta）過(guò)多的Arg是否與緩解因冷凍脫水造成的滲透脅迫有關(guān)，或者作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)減少或消除低溫?fù)p傷，還需進(jìn)一步研究。

該試驗(yàn)結(jié)果表明，低溫脅迫處理嚴(yán)重影響突變體cisc（ta）幼苗生長(zhǎng)特性，降低了葉片抗氧化酶活性，提高了葉片中Pro、Arg、Asp、Glu、Lys的含量，特別是Arg的含量，由于突變體cisc（ta）耐冷性功能基因的缺失，其耐冷性極顯著弱于P1211。該研究加深了對(duì)水稻苗期耐冷性生理基礎(chǔ)的認(rèn)識(shí)，為突變體cisc（ta）耐冷性功能缺失基因的克隆及水稻耐冷機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。

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