申永超 林佳 馮琪 朱大榮

[摘要] 目的 探討miR-92b與信號(hào)通路PI3K/Akt在糖尿病腎病中的相關(guān)性。 方法 選取8周齡的C57BL/6 雄性小鼠12只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和糖尿病腎病組，利用枸櫞酸鈉建立糖尿病腎病小鼠模型;選取人腎小管上皮HK-2細(xì)胞12瓶，隨機(jī)分為高糖組、低糖組和左旋葡萄糖組，用高糖刺激建立糖尿病腎病細(xì)胞模型。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠腎臟組織和細(xì)胞中miR-92b表達(dá)水平，Western blot檢測(cè)小鼠腎臟組織和細(xì)胞中Akt和P-Akt的表達(dá)水平。 結(jié)果 糖尿病腎病組和高糖組miR-92b表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組（P<0.05），而P-Akt/Akt表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。將信號(hào)通路PI3K/Akt抑制劑LY294002加入到高糖誘導(dǎo)的糖尿病腎病細(xì)胞模型中，信號(hào)通路PI3K/Akt被抑制的同時(shí)，miR-92b表達(dá)顯著升高（P<0.05）。結(jié)論 糖尿病腎病時(shí)，miR-92b與PI3K/Akt的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 糖尿病腎病;miR-92b;PI3K;Akt;LY294002

[中圖分類號(hào)] R587.2;R364.3? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2021）30-0044-05

[Abstract] Objective To explore the relationship between miR-92b and PI3K/Akt signaling pathway in diabetic nephropathy. Methods Twelve 8-week-old male C57BL/6 mice were randomly divided into a normal control group and a diabetic nephropathy group. The diabetic nephropathy mouse model was established using sodium citrate. 12 bottles of human renal tubular epithelial HK-2 cells were selected and randomly divided into high glucose group， low glucose group and L-glucose group. The diabetic nephropathy cell model was established with high glucose stimulation. The expression levels of miR-92b in mouse kidney tissues and cells were detected by RT-PCR. The expression levels of Akt and P-Akt in mouse kidney tissues and cells were detected by Western blot. Results Compared with that of the control group，the expression level of miR-92b in the kidney tissue and cells of the diabetic nephropathy model group was significantly lower （P<0.05）， and the expression level of P-Akt/Akt was significantly higher（P<0.05）. The PI3K/Akt signaling pathway inhibitor LY294002 was added to the high glucose-induced diabetic nephropathy cell model. While PI3K/Akt signaling pathway was inhibited， the expression level of miR-92b was significantly increased（P<0.05）. Conclusion In diabetic nephropathy， miR-92b is negatively correlated with the expression of PI3K/Akt signaling pathway.

[Key words] Diabetic nephropathy; miR-92b; PI3K; Akt; LY294002

糖尿病腎?。―iabetic nephropathy，DN）是由糖尿病長(zhǎng)期遷延不愈而致的腎臟微血管并發(fā)癥，已是當(dāng)前引起全球終末期腎臟疾病的主要病因之一[1]。由于導(dǎo)致DN的病因復(fù)雜多樣，醫(yī)學(xué)治療效果有限，目前臨床仍不能徹底治愈DN，只能維持治療，延緩進(jìn)展至終末期腎病。有研究表明[2]，microRNA-92b（miR-92b）可通過激活DOC-2/DAB2相互作用蛋白（DAB2 interactive protein，DAB2IP）下游信號(hào)通路PI3K/AKT促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，而此信號(hào)通路又在DN足細(xì)胞損傷、系膜細(xì)胞凋亡和腎小管細(xì)胞間質(zhì)化等關(guān)鍵病變過程中起著不可替代的作用[3-5]。提示miR-92b與PI3K/AKT信號(hào)通路可能在DN病理變化中具有一定的相關(guān)性，目前國(guó)內(nèi)外尚未見與此相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。因此，為深入研究DN的發(fā)病機(jī)制，尋找治療DN新的靶基因，本研究擬初步探究miR-92b與PI3K/AKT信號(hào)通路在DN中的表達(dá)情況及相關(guān)性，為進(jìn)一步深入研究miR-92b與PI3K/AKT信號(hào)通路在DN病理變化過程中的具體機(jī)制做準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雄性C57BL/6小鼠（上海斯萊克公司）;人腎小管上皮HK-2s細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫）;小鼠代謝籠（美國(guó)Columbus）;鏈佐星（美國(guó)Sigma）;miR-92引物（廣州瑞博生物科技有限公司）;SYBRGreenMaster（瑞士Roche）;DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清（上海聯(lián)碩）;胰酶（美國(guó)Gibco）;LY294002抑制劑（北京百奧萊博科技有限公司）;鼠源性P-Akt及Akt單克隆抗體、抗β-actin抗體、辣根過氧化物酶HRP（英國(guó)Abcom）;RNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒（瑞士Roche）;BSA封閉液及RIPA裂解液（北京索萊寶科技有限公司）;PVDF膜（美國(guó)MiLipore）;CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo）;MyCycler PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)伯樂公司）;實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國(guó)Life Technologies）。

1.2 糖尿病腎病小鼠模型的建立

把12只C57BL/6（8周齡）雄性小鼠隨機(jī)分為糖尿病腎病實(shí)驗(yàn)組（Dia組）和正常對(duì)照組（Con組），禁食12 h后稱體重并測(cè)量空腹血糖。Dia組按70 mg/kg左下腹注射用枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液配制的鏈佐星溶液，兩日注射1次，共3次;Con組也按70 mg/kg左下腹注射枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液，2 d注射1次，共3次。兩組小鼠在同一動(dòng)物房?jī)?nèi)分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飲食，每3天換一次墊料，并觀察小鼠飲水、飲食、排尿的變化。連續(xù)3 d隨機(jī)測(cè)定兩組小鼠血糖值，若Dia組小鼠血糖值≥16.67 mmol/L，建立的糖尿病模型已達(dá)標(biāo)。再繼續(xù)喂養(yǎng)3個(gè)月，DN小鼠模型（1型）基本建立成功。

1.3 糖尿病腎病細(xì)胞模型的建立

以人腎小管上皮細(xì)胞HK-2為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用高糖誘導(dǎo)的方法建立糖尿病腎病細(xì)胞模型。按實(shí)驗(yàn)要求培養(yǎng)12瓶HK-2細(xì)胞，隨機(jī)分為三組：高糖組（HG組）、低糖組（LG組）和左旋葡萄糖組（DG組），每組4瓶。三組細(xì)胞均以無血清培養(yǎng)基饑餓24 h后，按實(shí)驗(yàn)要求加入干預(yù)因素刺激24 h，HG組用25 mmol/L右旋葡萄糖刺激;LG組用5 mmo/L右旋葡萄糖刺激;DG組用25 mmol/L左旋葡萄糖刺激。24 h后收集細(xì)胞用于RNA的反轉(zhuǎn)錄和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）及免疫印跡試驗(yàn)（Western blot）。

1.4 小鼠標(biāo)本的收集及指標(biāo)測(cè)定

小鼠造模期間每周稱體重，每隔2周經(jīng)小鼠尾靜脈取血液標(biāo)本并測(cè)血糖值。處死小鼠前1 d用代謝籠收集24 h尿液標(biāo)本，檢測(cè)尿液中微量白蛋白（Microalbunminuria，MAU）和尿N-乙酰-β-D氨基葡萄糖甙（Urinary N-acetylbeta-D glucosamine glucoside enzyme，NAG）。處死小鼠，稱體重后解剖小鼠，取腎組織，記錄各組小鼠腎臟重量，計(jì)算腎指數(shù)（腎重量/小鼠體重）。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)和處理

HK-2細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，傳代于24個(gè)細(xì)胞瓶中，按實(shí)驗(yàn)要求平分為6組，分別為-LY294002的HG組、LG組、DG組和+LY294002的HG組、LG組、DG組。-LY294002的HG組、LG組和DG組細(xì)胞按1.3實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行高糖刺激，+LY294002的HG組、LG組和DG組細(xì)胞用高糖刺激的同時(shí)加入LY294002（25 μmol/L），加入LY294002 1 h后收集細(xì)胞，為進(jìn)行RT-PCR做準(zhǔn)備。

1.6 RNA提取與RT-PCR檢測(cè)

按照RNA提取試劑盒操作說明書對(duì)小鼠腎組織和HK-2細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取，然后紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后配制RT-PCR混合反應(yīng)體系（2 μL的cDNA、0.8 μL的RT引物、6.4 μL的SYBR Green Mix和10 μL無菌蒸餾水，共20 μL）。反應(yīng)條件為50℃，2 min;95℃，10 min;95℃，15 s;60℃，1 min;增至40個(gè)循環(huán)。PCR儀把U6作為內(nèi)參對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.7 Western blot檢測(cè)

用裂解液對(duì)小鼠腎臟組織及HK-2細(xì)胞進(jìn)行裂解后，4℃，12 000 rpm，離心5 min，取上清分裝至0.5 mL離心管中。測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，并用酶標(biāo)儀在562 nm處測(cè)定紫外吸收峰，算出蛋白濃度后并對(duì)蛋白樣品進(jìn)行處理。配制分離膠和堆積膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，雙抗4℃孵育，蛋白顯影。用Image J圖像分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究所得數(shù)據(jù)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用one-way Anova檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建立糖尿病腎病小鼠模型的結(jié)果

糖尿病腎病小鼠模型建立后，測(cè)兩組小鼠體重、腎指數(shù)、血糖。與Con組相比，Dia組體重明顯降低（P<0.01），腎指數(shù)、血糖顯著升高（P<0.001）。見圖1。同時(shí)為了驗(yàn)證Dia組小鼠合并腎臟并發(fā)癥，測(cè)小鼠24 h尿液中MAU、NAG含量。與Con組相比，Dia組MAU、NAG含量顯著升高（P<0.05）。見圖2。

2.2 miR-92b、P-Akt和Akt在糖尿病腎病小鼠模型中的表達(dá)檢測(cè)

通過對(duì)小鼠腎臟組織miR-92b的表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)Dia組明顯低于Con組（P<0.05）。見圖3。通過Western blot對(duì)小鼠腎臟組織Akt、P-Akt顯影，灰度分析發(fā)現(xiàn)，與Con組相比，Dia組P-Akt/Akt比值明顯升高（P<0.05）。見圖4。

2.3 miR-92b、P-Akt和Akt在糖尿病腎病細(xì)胞模型中的表達(dá)檢測(cè)

采用高糖針對(duì)HK-2s細(xì)胞株進(jìn)行24 h誘導(dǎo)建立糖尿病腎病細(xì)胞模型，通過對(duì)各組細(xì)胞miR-92b的表達(dá)檢測(cè)分析，與LG組相比，HG組miR-92b明顯表達(dá)量降低（P<0.001）。見圖5。Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中P-Akt和Akt表達(dá)水平，與LG組相比，HG組細(xì)胞中P-Akt/Akt比值明顯升高（P<0.05）。見圖6。

2.4 加入抑制劑LY294002后糖尿病腎病細(xì)胞模型中miR-92b的表達(dá)檢測(cè)

仍選用HK-2為研究對(duì)象，通過RT-PCR分析加入LY294002后各組細(xì)胞中miR-92b的表達(dá)量，-LY294002的HG組細(xì)胞中miR-92b表達(dá)量仍然明顯低于-LY294002的LG組（P<0.001）。而+LY294002的HG組細(xì)胞中miR-92b表達(dá)量明顯高于-LY294002的HG組（P<0.001）和LG組（P<0.05）及+LY294002的LG組（P<0.001）。見圖7。

3 討論

DN不僅是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，也是引起糖尿病死亡的主要病因之一。目前，DN臨床治療尚無有效的治療措施，除非腎移植，但腎移植不僅腎源難尋，移植后需長(zhǎng)期服用免疫抑制劑，還不能防止DN的再發(fā)生和改善其他糖尿病并發(fā)癥。隨著病情的蔓延，患者將最終因腎功能衰竭而死亡。DN的病變涉及到多種因素，如代謝、高血壓、腎素-血管緊張素系統(tǒng)等，它們或單一因素或多因素相互作用共同導(dǎo)致DN[6-7]。因DN病因復(fù)雜，本研究對(duì)防治DN的有效措施難以尋找。

miRNA的發(fā)現(xiàn)為研究DN的基因病變和基因治療指明了新的方向。miRNA是一種在生物種內(nèi)高度保守的小非編碼RNA分子，主要通過信使RNA（mRNA）的翻譯抑制或降解來調(diào)節(jié)各種基因表達(dá)，從而調(diào)節(jié)機(jī)體正常發(fā)育和各種疾病的病理演變過程[8-12]。以往學(xué)者的研究表明，miR-92b作為一種癌基因，其異常表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤分化和較差的總體生存率密切相關(guān)，如胃癌、乳腺癌、宮頸癌等[2，13-14]。本研究顯示，無論是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還是體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與正常對(duì)照組相比，miR-92b在小鼠和細(xì)胞DN模型組的表達(dá)明顯下降，表明miR-92b不僅是一種癌基因，還在機(jī)體高血糖時(shí)表達(dá)異常，并且與DN病變相關(guān)。

PI3K于1985年被發(fā)現(xiàn)，是一種磷酸化磷脂酰肌醇的脂質(zhì)激酶，磷脂酰肌醇是真核細(xì)胞膜的組成部分[15]。激活受體酪氨酸激酶（RTKs）和G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）通過激活Ras，進(jìn)而激活PI3K?；罨腜I3K使底物磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（P1P2）磷酸化，在真核細(xì)胞內(nèi)膜上形成磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸（P1P3），隨后募集信號(hào)蛋白，如Akt蛋白[16-17]。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，需通過兩個(gè)關(guān)鍵的磷酸化過程被激活。首先，PIP3與Akt和磷脂酰肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）結(jié)合，促使PDK1磷酸化AKT蛋白的蘇氨酸308位點(diǎn)，導(dǎo)致AKT部分被激活，隨后通過mTOR復(fù)合物2（mTORC2）磷酸化Akt蛋白的絲氨酸473位點(diǎn)，激活A(yù)kt的全部酶活性，該活化過程由PI3K依賴性機(jī)制激活[18]。所以Akt被磷酸化的前提是PI3K被激活。數(shù)十年已經(jīng)過去了，PI3K/Akt通路由于其有多種功能，仍然是當(dāng)今科研的熱點(diǎn)。已有研究表明，機(jī)體高血糖時(shí)，異常表達(dá)的miRNA可通過激活的PI3K/Akt通路發(fā)揮其調(diào)節(jié)機(jī)制[19-21]。本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Con組相比，Dia組小鼠腎組織P-Akt/Akt比值升高;體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與LG組相比，HG組細(xì)胞P-Akt/Akt比值同樣升高。P-Akt/Akt比值升高，說明DN時(shí)PI3K被激活，Akt磷酸化水平升高，即PI3K/Akt通路被激活，這與以往學(xué)者的研究結(jié)果一致。

以上研究結(jié)果表明，DN時(shí)miR-92b表達(dá)下調(diào)，信號(hào)通路PI3K/Akt活性表達(dá)上調(diào)。那么是否在DN病變過程中miR-92b與信號(hào)通路PI3K/Akt存在關(guān)聯(lián)性？為此，本研究仍以HK-2細(xì)胞為研究對(duì)象，向高糖誘導(dǎo)的DN細(xì)胞模型中加入PI3K抑制劑LY294002，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中的miR-92b。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與-LY294002的HG組、-LY294002的LG組和+LY294002的LG組相比，+LY294002的HG組miR-92b表達(dá)水平升高，說明當(dāng)DN病變時(shí)，抑制信號(hào)通路PI3K/Akt可以上調(diào)miR-92b表達(dá)水平。

綜上所述，DN病變時(shí)，miR-92b表達(dá)下調(diào)，miR-92b表達(dá)水平與PI3K/Akt活性呈負(fù)相關(guān)性。此次研究?jī)H對(duì)miR-92b和PI3K/Akt在DN病變時(shí)的表達(dá)變化及其關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了初步研究，但為進(jìn)一步研究miR-92b與PI3K/Akt在DN病變中的具體調(diào)節(jié)機(jī)制和尋找治療DN新的靶基因做了預(yù)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備。

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（收稿日期：2020-11-08）